本發(fā)明屬于生物病理檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于原位雜交或免疫組化檢測的陽性參照物及其制備方法。

背景技術(shù)：

在目前臨床組織病理診斷和形態(tài)學(xué)的研究中，原位雜交和免疫組織化學(xué)染色已經(jīng)成為不可或缺的病理診斷輔助技術(shù)，在全球臨床病理檢測中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，成為了臨床病理檢測常規(guī)工作中不可缺少的部分。這兩種常規(guī)檢測方法不僅提高了病理診斷的準(zhǔn)確性，同時(shí)也滲透到了臨床和基礎(chǔ)學(xué)科，在探討疾病的病因?qū)W、發(fā)病機(jī)制及科研工作中起到了不可估量的作用。如eber原位雜交檢測在多種惡性腫瘤特別是鼻咽癌的病理診斷中起著十分重要的作用，能夠確定病毒與組織和細(xì)胞的關(guān)系，在確定ebv與疾病關(guān)系時(shí)，eber原位雜交已成為公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法；又如在乳腺癌組織中，er、pr及c—erbb-2的免疫組化檢測可為患者的預(yù)后判斷、個(gè)體化治療和靶向治療方案的選擇提供幫助。

但由于原位雜交和免疫組化的染色過程比較復(fù)雜，影響染色結(jié)果的因素也很多，如一些實(shí)驗(yàn)條件的差別及其他技術(shù)因素的影響，使得最終的染色結(jié)果差別很大，從而影響到病理診斷的結(jié)果，目前提高原位雜交和免疫組化染色技術(shù)水平的需要越來越迫切，而且任重道遠(yuǎn)。在日常的病理檢測中，為保證結(jié)果的穩(wěn)定和可信，常用的方法是在病理檢測中設(shè)置陽性對照對實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行質(zhì)控。臨床常用的陽性質(zhì)控方法主要有兩種:一種是每次在對待檢組織進(jìn)行檢測時(shí)，都使用和待檢組織同樣的方法將已知表達(dá)為陽性的組織(簡稱陽性組織)制成蠟塊，然后將制備的陽性對照蠟塊和待檢組織蠟塊裱在同一張載玻片上，進(jìn)行檢測，該方法陽性對照與待檢組織實(shí)驗(yàn)條件一致，具有結(jié)果可比性好和誤差小等優(yōu)點(diǎn)，但該方法每進(jìn)行一次檢測，均需要制備陽性對照蠟塊，不僅需要耗費(fèi)大量的陽性對照組織、試劑等，而且操作繁瑣，工作量大，大大降低了檢測效率；另一種是組織微陣列(tma)技術(shù)，通過一次性將多個(gè)陽性組織轉(zhuǎn)移到一個(gè)新石蠟塊上，構(gòu)建高通量陽性組織陣列的方法在一定程度上提高了檢測效率，但依然存在制作過程煩瑣，所占的面積較大，需耗費(fèi)大量抗體試劑等缺點(diǎn)，制約其在臨床上的推廣應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于原位雜交或免疫組化檢測的陽性參照物，所述陽性參照物鏡下觀察組織形態(tài)完整，使用方便，保存時(shí)間長，制備方法簡單，節(jié)約試劑成本。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于原位雜交或免疫組化檢測的陽性參照物的制備方法，所述方法僅需一次操作即可制備出能夠供多次檢測使用、組織形態(tài)完整且保存時(shí)間長的陽性參照物，實(shí)驗(yàn)操作簡單方便、成本節(jié)約且大大提高檢測效率。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種用于原位雜交或免疫組化檢測的陽性參照物，由以下方法制備得到：

步驟1：將已知原位雜交或免疫組化染色陽性的腫瘤組織用福爾馬林緩沖液固定，切成(1.0-2.0)cm×(1.0-2.0)cm、厚度為(0.3-0.4)cm的組織塊，脫水、浸蠟,石蠟包埋制得陽性組織蠟塊，he染色定位，選擇陽性組織蠟塊上代表性病變組織區(qū)域；

步驟2：將石蠟和蜂蠟按質(zhì)量比50:1的比例混合熔化成蠟液，將所得蠟液注入包埋模具中，冷卻，制得空白蠟塊，用內(nèi)徑為0.8-2.0mm的組織芯片穿刺針在空白蠟塊中穿刺打孔；

步驟3：用內(nèi)徑為0.8-2.0mm的組織芯片穿刺針在步驟1所得的代表性病變組織蠟塊穿刺取樣后置入步驟2所得的空白蠟塊穿刺孔中，加熱使加入的病變組織與蠟塊融合，冷卻，燙熔表面,加上塑料組織包埋框和石蠟液，冷凍，脫模制得組織芯片蠟塊；

步驟4：將步驟3所得的組織芯片蠟塊切成厚度為4-10um的薄片，二甲苯溶解石蠟，離心，棄上清液，100％乙醇洗滌，離心，棄上清液，95％乙醇洗滌，離心，棄上清液，加入95-100％乙醇稀釋至每毫升溶液中含500-1000個(gè)組織片段的陽性參照物，4℃保存?zhèn)溆?，所述?5％乙醇、95-100％乙醇是指乙醇體積分?jǐn)?shù)為95％、95-100％的乙醇水溶液。

根據(jù)本發(fā)明所述的陽性參照物，步驟1中所述的福爾馬林緩沖液的濃度為10％。

根據(jù)本發(fā)明所述的陽性參照物，步驟1中所述的組織塊為1.5cm×1.5cm、厚0.3cm。

根據(jù)本發(fā)明所述的陽性參照物，步驟1中所述的脫水為全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)脫水。

根據(jù)本發(fā)明所述的陽性參照物，步驟1中所述he染色定位的方法是將陽性組織蠟塊切片，he染色，顯微鏡觀察有代表性病變組織，定位。

根據(jù)本發(fā)明所述的陽性參照物，步驟3中所述的組織芯片穿刺針的直徑為1.0mm。

根據(jù)本發(fā)明所述的陽性參照物，步驟4中所述的薄片厚度為4-8um；優(yōu)選地，步驟4中所述的薄片厚度為6um。

根據(jù)本發(fā)明所述的陽性參照物，步驟4中所述的陽性參照物的濃度為每毫升溶液中含700-800個(gè)組織片段。

本發(fā)明提供的通過組織芯片穿刺針對陽性組織蠟塊上代表性病變區(qū)域穿刺取樣，制備成組織芯片蠟塊后，再切薄片制備成液態(tài)陽性參照物的方法制備得到的陽性參照物，具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，得到的陽性參照物組織碎片形態(tài)完整，且大小適合觀察，節(jié)省抗體試劑，避免了由于陽性組織蠟塊切片太大，攪碎引起組織形態(tài)不完整、不便于實(shí)驗(yàn)觀察等缺陷；其次，通過he染色選取代表性病變組織塊，組織陽性表達(dá)區(qū)域集中，染色陽性定位準(zhǔn)確，質(zhì)控作用好，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及科學(xué)性，檢測結(jié)果有充分的可比性；再次，制作方法非常簡單、方便，一次操作就能夠制備出大量的、能夠供多次檢測使用的陽性參照物，大大節(jié)省了人力和成本，適用于臨床批量工作，提高了檢測效率，整個(gè)陽性參照物的制備大約需要40min，以用200張4-10um石蠟切片制備陽性參照物為例，按每次用時(shí)滴加5ul計(jì)算，可用2000次左右，該溶液制備完成后，可等份分裝，方便存儲(chǔ)，4度保存半年或-20℃保存兩年染色陽性強(qiáng)度沒有任何改變。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，組織芯片穿刺針的直徑、步驟4中所述薄片的厚度和陽性參照物的濃度對陽性參照物的實(shí)驗(yàn)效果影響很大，當(dāng)組織芯片穿刺針的直徑小于0.8mm或步驟4中所述薄片的厚度小于4um時(shí)，制得的陽性參照物中組織以碎片的形式存在，缺乏完整性；當(dāng)組織芯片穿刺針的直徑大于2.0mm或步驟4中所述薄片的厚度大于10um時(shí)，制得的陽性參照物中組織容易壓落、折疊、堆積，不便于實(shí)驗(yàn)觀察；此外，陽性參照物中組織片段的濃度小于每毫升溶液中含500個(gè)組織片段，則組織太分散，不集中，容易擴(kuò)散到待測組織上，造成污染；陽性參照物中組織片段的濃度大于每毫升溶液中含1000個(gè)組織片段時(shí)，陽性參照物不易擴(kuò)散，易壓落，組織折疊、堆積嚴(yán)重，不便于觀察。本發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)組織芯片穿刺針的直徑為0.8-2.0mm時(shí)，組織切片的厚度為4-10um時(shí)，用95％的乙醇溶液稀釋至每毫升溶液中含500-1000個(gè)組織片段時(shí)，能夠得到陽性參照物中組織相對集中，不易折疊和重疊，組織形態(tài)完整便于觀察，尤其是組織芯片穿刺針的直徑為1.0mm，薄片的厚度為6um時(shí)，濃度為每毫升溶液中含700-800個(gè)組織片段時(shí)得到的陽性參照物在使用時(shí)，陽性參照物中組織分布相對集中，而又不重疊，組織形態(tài)完整，染色結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

本發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，陽性參照物中稀釋液的種類對實(shí)驗(yàn)效果影響較大，如果稀釋液中乙醇濃度低于95％，組織片段無法分散均勻，組織重疊、掉片；當(dāng)稀釋液中乙醇濃度為95-100％時(shí)，組織片段分布相對集中，又不重疊，組織形態(tài)完整，染色結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且制得的陽性參照物4℃下保存半年或-20℃保存兩年染色陽性強(qiáng)度沒有任何改變。

第二方面，本發(fā)明提供上述用于原位雜交或免疫組化檢測的陽性參照物的制備方法，包括以下步驟：

步驟1：將已知免疫組化或原位雜交染色陽性的腫瘤組織用福爾馬林緩沖液固定，切成(1.0-2.0)cm×(1.0-2.0)cm、厚度為(0.3-0.4)cm的組織塊，脫水、浸蠟,石蠟包埋制得陽性組織蠟塊，he染色定位，選擇陽性組織蠟塊上代表性病變組織區(qū)域；

步驟2：將石蠟和蜂蠟按質(zhì)量比50:1的比例混合熔化成蠟液，將所得蠟液注入包埋模具中，冷卻，制得空白蠟塊，用內(nèi)徑為0.8-2.0mm的組織芯片穿刺針在空白蠟塊中穿刺打孔；

步驟3：用內(nèi)徑為0.8-2.0mm的組織芯片穿刺針在步驟1所得的代表性病變組織蠟塊穿刺取樣后置入步驟2所得的空白蠟塊穿刺孔中，加熱使加入的病變組織與蠟塊融合，冷卻，燙熔表面,加上塑料組織包埋框和石蠟液，冷凍，脫模制得組織芯片蠟塊；

步驟4：將步驟3所得的組織芯片蠟塊切成厚度為4-10um的薄片，二甲苯溶解石蠟，離心，棄上清液，100％乙醇洗滌，離心，棄上清液，95％乙醇洗滌，離心，棄上清液，加入95-100％乙醇稀釋至每毫升溶液中含500-1000個(gè)組織片段的陽性參照物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的用于原位雜交或免疫組化檢測的陽性參照物的制備方法，包括以下步驟：

步驟1：將已知免疫組化或原位雜交染色陽性的腫瘤組織用10％福爾馬林緩沖液固定，切成(1.0-2.0)cm×(1.0-2.0)cm、厚度為(0.3-0.4)cm的組織塊，全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)脫水、浸蠟,石蠟包埋制得陽性組織蠟塊，將所得的陽性組織蠟塊切片，he染色，顯微鏡觀察有代表性病變組織，選擇陽性組織蠟塊上代表性病變組織區(qū)域；

步驟2：選用高純度的石蠟和蜂蠟按質(zhì)量比50:1的比例混合熔化成蠟液，將所得蠟液注入包埋模具中，室溫下使蠟塊自然冷卻,待其凝固且稍軟時(shí),用用內(nèi)徑為1.0mm的組織芯片穿刺針在空白蠟塊中穿刺打孔，各孔間距緊湊排列，相距1mm，每排打4個(gè)孔，共計(jì)5排，制得空白蠟塊；

步驟3：用內(nèi)徑為1.0mm的組織芯片穿刺針在步驟1所得的代表性病變組織蠟塊穿刺取樣后置入步驟2所得的空白蠟塊穿刺孔中，加熱使加入的病變組織與蠟塊融合，冷卻，燙熔表面,加上塑料組織包埋框和石蠟液，冷凍，脫模制得組織芯片蠟塊；

步驟4：將步驟3所得的組織芯片蠟塊切成厚度為6um的薄片，二甲苯溶解石蠟，離心，棄上清液，100％乙醇洗滌，離心，棄上清液，95％乙醇洗滌，離心，棄上清液，加入95-100％乙醇稀釋至每毫升溶液中含700-800個(gè)組織片段的陽性參照物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1陽性參照物he染色圖(放大40倍)；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2陽性參照物與待測組織的位置圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例2陽性參照物原位雜交染色結(jié)果染色圖(放大40倍)；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例2陽性參照物原位雜交染色結(jié)果圖(放大100倍)；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例2陽性參照物原位雜交染色結(jié)果圖(放大200倍)；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例3陽性參照物he染色圖(放大40倍)；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例4陽性參照物免疫組化染色結(jié)果圖(放大100倍)；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例4陽性參照物免疫組化染色結(jié)果圖(放大200倍)；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例4陽性參照物免疫組化染色結(jié)果圖(放大400倍)。

具體實(shí)施例

實(shí)施例1eber原位雜交檢測陽性參照物的制備

選用重慶市腫瘤醫(yī)院病理科外檢標(biāo)本中eber原位雜交檢測陽性的鼻咽癌組織,經(jīng)10％福爾馬林緩沖液固定24h,取材,將組織切成1.5cm×1.5cm,厚0.3cm,全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)脫水、浸蠟,石蠟包埋,4μm切片,he染色,顯微鏡觀察定位，選取蠟塊上有代表性的病變組織的區(qū)域。

選用高純度的石蠟,每500g加入10g蜂蠟充分熔化后,將蠟液注入不銹鋼包埋模具中,室溫下使蠟塊自然冷卻,待其凝固且稍軟時(shí),用直徑1.0mm的組織芯片穿刺針在空白蠟塊中穿刺打孔，各孔間距緊湊排列，相距1mm，每排打4個(gè)孔，共計(jì)5排。

用直徑1.0mm組織芯片穿刺針在代表性病變組織蠟塊上穿刺取樣,用力均勻且有落空感,用針芯將所取組織芯推出,放入上述空白蠟塊穿刺孔中,將蠟塊模具置于熱臺(tái)上使病變組織樣本與蠟塊融合,此時(shí)觀察其穿刺孔中會(huì)有小氣泡溢出或芯片孔中蠟熔化,置于冷臺(tái)冷卻,再用燒熱的電烙鐵或鑷子將蠟塊表面燙熔,加上塑料組織包埋框,再加入熔好的石蠟,待冷凍后制作的組織芯片蠟塊即可從不銹鋼模具中脫離。

使用thermohm325型手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，切200片6um的切片放到100ml的燒杯中，加10ml的二甲苯溶解石蠟，轉(zhuǎn)移到15ml離心管，離心1500g，2min，棄上清；用100％和95％乙醇溶液各洗一次,離心1500g，2min；棄上清，按稀釋液：沉淀體積比1:30的比例加入稀釋液95％乙醇進(jìn)行稀釋制得陽性參照物，陽性參照物he染色，顯微鏡下40倍觀察，結(jié)果見圖1，顯微鏡下檢查組織片段的濃度，每毫升含約800個(gè)組織片段，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2待測組織檢測

將待測組織切片厚3～4μm，石蠟切片裱貼于經(jīng)防脫處理的潔凈載玻片上，常規(guī)脫蠟水化，室溫晾干。

將實(shí)施例1制備的陽性參照物搖勻，取陽性參照物5ul，滴于待測組織的載玻片上，盡量靠近待測組織，但又不使陽性參照物擴(kuò)散至待測組織切片上，位置見圖2，室溫晾干。

eber原位雜交染色

滴加100μl胃蛋白酶反應(yīng)液，保證溶液完全覆蓋陽性參照物和待測組織上，37℃下孵育30min，蒸餾水洗后無水酒精脫水，空氣干燥，滴加10μl探針雜交液，蓋上蓋玻片，37℃下孵育3h或過夜，取出玻片，移去蓋玻片，pbs沖洗甩干，滴加適量hrp標(biāo)記的抗地高辛抗體，37℃下孵育30min，室溫pbs浸泡3x2min，最后對切片進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺(dab)顯色液顯色和常規(guī)蘇木素復(fù)染、封片，顯微鏡下放大40、100倍觀察，結(jié)果見圖3、4，顯微鏡下放大200倍觀察，結(jié)果見圖5。由圖3-5可以看出，陽性參照物中組織片段呈圓形，形態(tài)完整，沒有脫落。組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核保存良好。染色陽性定位準(zhǔn)確，在細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色，表明免疫組化的染色結(jié)果準(zhǔn)確理想。

實(shí)施例3免疫組化檢測陽性參照物的制備

選用重慶市腫瘤醫(yī)院病理科外檢標(biāo)本中免疫組化孕激素受體(pr)檢測陽性的乳腺癌組織,經(jīng)10％福爾馬林緩沖液固定24h,取材,將組織切成1.5cm×1.5cm,厚0.3cm,全自動(dòng)密閉式脫水機(jī)脫水、浸蠟,石蠟包埋,4μm切片,he染色,顯微鏡觀察定位，選取蠟塊上有代表性的病變組織的區(qū)域。

選用高純度的石蠟,每500g加入10g蜂蠟充分熔化后,將蠟液注入不銹鋼包埋模具中,室溫下使蠟塊自然冷卻,待其凝固且稍軟時(shí),用直徑1.0mm的組織芯片穿刺針在空白蠟塊中穿刺打孔，各孔間距緊湊排列，相距1mm，每排打4個(gè)孔，共計(jì)5排。

用直徑1.0mm組織芯片穿刺針在代表性病變組織蠟塊上穿刺取樣,用力均勻且有落空感,用針芯將所取組織芯推出,放入上述空白蠟塊穿刺孔中,將蠟塊模具置于熱臺(tái)上使病變組織樣本與蠟塊融合,此時(shí)觀察其穿刺孔中會(huì)有小氣泡溢出或芯片孔中蠟熔化,置于冷臺(tái)冷卻,再用燒熱的電烙鐵或鑷子將蠟塊表面燙熔,加上塑料組織包埋框,再加入熔好的石蠟,待冷凍后制作的組織芯片蠟塊即可從不銹鋼模具中脫離。

使用thermohm325型手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，切200片6um的切片放到100ml的燒杯中，加10ml的二甲苯溶解石蠟，轉(zhuǎn)移到15ml離心管，離心1500g，2min，棄上清；用100％和95％乙醇溶液各洗一次,離心1500g，2min；棄上清，按稀釋液：沉淀體積比1:30的比例加入稀釋液95％乙醇進(jìn)行稀釋制得陽性參照物，陽性參照物he染色，顯微鏡下40倍觀察，結(jié)果見圖6，顯微鏡下檢查組織片段的濃度，每毫升含約800個(gè)組織片段，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4待測組織檢測

將待測組織切片厚3～4μm，石蠟切片裱貼于經(jīng)防脫處理的潔凈載玻片上，常規(guī)脫蠟水化，室溫晾干。

將實(shí)施例3制備的陽性參照物搖勻，取陽性參照物5ul，滴于待測組織的載玻片上，盡量靠近待測組織，但又不使陽性參照物擴(kuò)散至待測組織切片上，位置見圖2，室溫晾干。

免疫組化染色

阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3％h2o237℃孵育10min，pbs沖洗3×5min；取出后進(jìn)行抗原修復(fù)：置edta抗原修復(fù)液(ph8.0)中，放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)2-3min，自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，pbs沖洗3×5min。正常羊血清工作液封閉，37℃，10min，傾去勿洗。滴加抗pr的一抗4℃冰箱孵育過夜，pbs沖洗3×5min；滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30min，pbs沖洗3×5min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，pbs沖洗3×5min；dab/h2o2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。顯微鏡下放大100、200倍觀察，結(jié)果見圖7、8，顯微鏡下放大400倍觀察，結(jié)果見圖9。由圖7-9可以看出，陽性參照物中組織片段呈圓形，形態(tài)完整，沒有脫落。組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核保存良好。染色陽性定位準(zhǔn)確，在細(xì)胞核內(nèi)呈棕黃色，表明免疫組化的染色結(jié)果準(zhǔn)確理想。