本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體涉及復(fù)合水凝膠的制備技術(shù)。

背景技術(shù)：

水凝膠因獨特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，類似于生命組織材料，表面粘附蛋白質(zhì)及細胞能力較弱，與血液、體液及人體組織相接觸時，表現(xiàn)出良好的生物相容性，在細胞生長培養(yǎng)及醫(yī)療方面受到極大關(guān)注。目前醫(yī)用合成水凝膠的高分子材料主要有丙烯酰胺、丙烯酸羥基酯，甲基丙烯酸羥基酯、聚乙烯醇、聚氧乙烯等。但常見醫(yī)用水凝膠主要有自由基引發(fā)劑和交聯(lián)劑進行交聯(lián)的，在這類交聯(lián)反應(yīng)中，交聯(lián)劑分解產(chǎn)生自由基，這些自由基引發(fā)高分子自由基鏈反應(yīng)，從而導(dǎo)致高分子化合物鏈交聯(lián)，在這里交聯(lián)劑實際上起的是引發(fā)劑的作用，或者是利用交聯(lián)劑分子中的官能團，與高分子化合物進行反應(yīng)，通過交聯(lián)劑作為橋基把聚合大分子交聯(lián)起來。而應(yīng)用自由基引發(fā)劑及交聯(lián)劑尚有缺點，即單體殘留，交聯(lián)劑或引發(fā)劑殘留都會引起炎癥或者細胞毒性，且沒有生物活性。如何改進制備材料、方法及條件克服傳統(tǒng)醫(yī)用水凝膠制備的缺點以及開發(fā)出更廣泛的用途是現(xiàn)在研究的熱點。本發(fā)明通過天然中藥多糖制備具有促細胞生長和抗凝血活性多糖水凝膠的方法可以實現(xiàn)上述目的，并且目前尚未見到兼具有促細胞生長和抗凝血活性的復(fù)合中藥多功能多糖水凝膠的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種朵功能多糖水凝膠的制備方法及用途。

本發(fā)明是一種多功能多糖水凝膠的制備方法，其步驟為：

（1）將川芎、紅花、海帶的原材料以質(zhì)量比為1∶1∶1混合，粉碎后用水提醇沉的方法提取多糖；用sevage法除多糖蛋白2次，50℃下干燥，即得紅川海粗多糖；

（2）取多糖粉末，加入到干燥的反應(yīng)釜中，然后加入按體積比為10ml/50ml的無水乙醇/蒸餾水混合溶液中，在25℃下進行攪拌2小時；

（3）取摩爾量相當于多糖單體摩爾量的naio4，溶于水后加入反應(yīng)體系，在避光的狀態(tài)下反應(yīng)10小時；

（4）然后向反應(yīng)體系中在加入與naio4等摩爾量的乙二醇，攪拌30分鐘；加入體積相當于反應(yīng)體系三倍量的無水乙醇，攪拌10分鐘，抽濾，然后用截留分子量為3500的透析袋透析72小時，50℃下干燥12h，即得氧化的紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖；

（5）將紅花、川穹、海帶氧化多糖，溶于蒸餾水中配成4%的溶液，攪拌使其完全溶解；取n-o羧甲基殼聚糖，溶于蒸餾水中配成8%的溶液，攪拌使其完全溶解；

（6）分別將紅花、川穹、海帶氧化多糖和n-o羧甲基殼聚糖兩種溶液按體積比為1:1進行混合，200r/min攪拌均勻，得到多糖水凝膠。

以上所述的方法制得的多糖水凝膠具有促細胞生長和抗凝血作用，其用途為：應(yīng)用于組織工程材料，即小直徑血管組織工程血管支架，能夠有效促進血管形成并抑制支架移植后的血栓形成。

以上所述的方法制得的多糖水凝膠具有促細胞生長和抗凝血作用，其用途為：應(yīng)用于抗凝血活性藥物輔料，能夠利用3d打印制備緩釋制劑。

本發(fā)明的有益之處在于：產(chǎn)品原料來源廣泛，制備工藝簡單，成本較低；紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖復(fù)合水凝膠本身具有促細胞生長活性，比其它任何合成生物材料都接近活體組織，具有良好的材料生物相容性、可降解性，以及良好的材料——細胞界面及一定的空間三維結(jié)構(gòu)；且具有優(yōu)良的抗凝血作用，可以抑制移植血管后的凝血現(xiàn)象。

附圖說明

圖1是本發(fā)明制備的具有促細胞生長和抗凝血作用的多功能復(fù)合多糖水凝膠（未成膠）；圖2是本發(fā)明制備的具有促細胞生長和抗凝血作用的多功能復(fù)合多糖水凝膠（已成膠）；

圖3是通過實施例1制備的紅花/川穹/海帶多糖水凝膠的促細胞生長活性。

具體實施方式

本發(fā)明是一種多功能多糖水凝膠的制備方法，其步驟為：

（1）將川芎、紅花、海帶的原材料以質(zhì)量比為1∶1∶1混合，粉碎后用水提醇沉的方法提取多糖；用sevage法除多糖蛋白2次，50℃下干燥，即得紅川海粗多糖；

（2）取多糖粉末，加入到干燥的反應(yīng)釜中，然后加入按體積比為10ml/50ml的無水乙醇/蒸餾水混合溶液中，在25℃下進行攪拌2小時；

（3）取摩爾量相當于多糖單體摩爾量的naio4，溶于水后加入反應(yīng)體系，在避光的狀態(tài)下反應(yīng)10小時；

（4）然后向反應(yīng)體系中在加入與naio4等摩爾量的乙二醇，攪拌30分鐘；加入體積相當于反應(yīng)體系三倍量的無水乙醇，攪拌10分鐘，抽濾，然后用截留分子量為3500的透析袋透析72小時，50℃下干燥12h，即得氧化的紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖；

（5）將紅花、川穹、海帶氧化多糖，溶于蒸餾水中配成4%的溶液，攪拌使其完全溶解；取n-o羧甲基殼聚糖，溶于蒸餾水中配成8%的溶液，攪拌使其完全溶解；

（6）分別將紅花、川穹、海帶氧化多糖和n-o羧甲基殼聚糖兩種溶液按體積比為1:1進行混合，200r/min攪拌均勻，得到多糖水凝膠。

以上所述步驟（5）中氧化紅川海多糖和n,o-羧甲基殼聚糖的質(zhì)量比為1:2。

以上所述的方法制得的多糖水凝膠具有促細胞生長和抗凝血作用，其用途為：應(yīng)用于組織工程材料，即小直徑血管組織工程血管支架，能夠有效促進血管形成并抑制支架移植后的血栓形成。

以上所述的方法制得的多糖水凝膠具有促細胞生長和抗凝血作用，其用途為：應(yīng)用于抗凝血活性藥物輔料，能夠利用3d打印制備緩釋制劑。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。

實施例1：

（1）取川芎紅花海帶各250g，適當粉碎，加適量乙醇60℃下攪拌4h，進行脫脂處理，再用自來水沖洗一次，在80℃下蒸餾水浸提三次，濃縮浸提液至適量體積，用sevage（氯仿/正丁醇=5：1）法除多糖蛋白，加三倍量無水乙醇進行醇沉，抽濾，50℃下干燥，稱量，待用；

（2）取5.0g多糖粉末，加入到干燥的單口瓶中，然后加入無水乙醇/蒸餾（10ml/50ml）在25℃下進行攪拌2h，取摩爾量相當于多糖單體摩爾量（以180計算）的naio4，溶于10ml水后加入反應(yīng)體系，在避光的狀態(tài)下反應(yīng)一定時間,然后向反應(yīng)體系中在加入與naio4等摩爾量的乙二醇，攪拌30min后，加入體積相當于反應(yīng)體系三倍量的無水乙醇，攪拌10min，抽濾，50℃下干燥即得氧化的多糖；

（3）向反應(yīng)體系中加入體積約2倍于前述反應(yīng)體系的無水乙醇，攪拌10min后抽濾，然后用截留分子量為3500的透析袋透析72h，50℃下干燥12小時，即得氧化的紅川海多糖；

（4）取16g氫氧化鈉固體配制成40%(25ml)氫氧化鈉溶液，加5g殼聚糖粉末，混均，在-20℃下過夜保存。取20g氯乙酸溶解于100ml異丙醇，緩慢滴入上述殼聚糖溶液，約0.5h滴完。氯乙酸殼聚糖混合溶液25℃攪拌2h，然后60℃繼續(xù)攪拌2h，抽濾混合液，濾餅在50℃下干燥保存，待用；

（5）分別以n,o-羧甲基殼聚糖和氧化的多糖質(zhì)量比為1:1、1:2、1:3分別溶于一定量的蒸餾水中，在室溫下以體積比為1:1進行混合，總體積定為4ml，并觀察凝膠的形成；

（6）在37℃條件下，將粗提復(fù)方紅花/川穹/海帶多糖水凝膠樣品cslph-1、cslph-2和cslph-3分別在α-mem培養(yǎng)基（5ml）中，浸泡48h，獲得各樣品凝膠提取物。將wi-38細胞以1×104個細胞/孔的密度接種于96孔板中。此后，向體系中加入0.1ml一系列水凝膠提取液。加入新鮮培養(yǎng)基的孔作為陽性對照。然后放置在37℃co2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，采用mtt法測定細胞存活率。使用酶標儀（dnm9606，北京）在570nm處測定并記錄吸光度值。細胞存活率（%）根據(jù)下列公式計算：

細胞存活率（%）=實驗組吸光度/陽性對照吸光度×100%

如圖3所示，顯示了紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖水凝膠有較好的促細胞生長作用。

實施例2：

（1）取5.0g多糖粉末，加入到干燥的反應(yīng)釜中，然后加入無水乙醇/蒸餾（10ml/50ml）在25℃下進行攪拌2h；

（2）取摩爾量相當于多糖單體摩爾量（以180計算）的naio4，溶于10ml水后加入反應(yīng)體系，在避光的狀態(tài)下反應(yīng)10h；

（3）然后向反應(yīng)體系中在加入與naio4等摩爾量的乙二醇，攪拌30min；

加入體積相當于反應(yīng)體系三倍量的無水乙醇,攪拌10min，抽濾，然后用截留分子量為3500的透析袋透析72h，50℃下干燥12h，即得氧化的紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖；

（4）取4g紅花、川穹、海帶氧化多糖，溶于100ml蒸餾水，攪拌使其完全溶解；

（5）稱取8gn-o羧甲基殼聚糖，溶于100蒸餾水中，攪拌使其完全溶解；

（6）分別將紅花/川穹/海帶氧化多糖和n-o羧甲基殼聚糖兩種溶液按體積比為1:2進行混合，200r/min攪拌均勻（時間較短），制備成多糖凝膠；

（7）將小鼠36只，隨機分為三組，以25ml/kg容量灌胃，分別給予生理鹽水為模型對照組，法華令7mg/kg為陽性對照組，紅花/川穹/海帶多糖水凝膠1000mg/kg為實驗組。1h后用直徑為10mm的玻璃毛細管插入小鼠內(nèi)眥球后靜脈叢取血至出現(xiàn)血凝絲的時間，即為凝血時間。如表1顯示，紅花/川穹/海帶多糖凝膠可顯著延長小鼠凝血時間，與生理鹽水對照組有顯著差異。

表1紅花/川穹/海帶多糖水凝膠對小鼠凝血時間（ct）的影響

。

實施例3：

（1）取5.0g多糖粉末，加入到干燥的反應(yīng)釜中，然后加入無水乙醇/蒸餾（10ml/50ml）在25℃下進行攪拌2h；

（2）取摩爾量相當于多糖單體摩爾量（以180計算）的naio4,溶于10ml水后加入反應(yīng)體系，在避光的狀態(tài)下反應(yīng)10h；

（3）然后向反應(yīng)體系中在加入與naio4等摩爾量的乙二醇，攪拌30min；

加入體積相當于反應(yīng)體系三倍量的無水乙醇，攪拌10min，抽濾，然后用截留分子量為3500的透析袋透析72h，50℃下干燥12h，即得氧化的紅花多糖/川穹多糖/海帶多糖；

（4）取4g紅花、川穹、海帶氧化多糖，溶于100ml蒸餾水，攪拌使其完全溶解；

（5）稱取8gn-o羧甲基殼聚糖，溶于100ml蒸餾水中，攪拌使其完全溶解；

（6）分別將紅花/川穹/海帶氧化多糖和n-o羧甲基殼聚糖兩種溶液按體積比為1:2進行混合，200r/min攪拌均勻（時間較短），將攪拌均勻的溶液以20ml/h的速度通過3d打印機打印組織工程血管支架。