本發(fā)明涉及一種南瓜抗壞血酸氧化酶的提取純化方法。
背景技術(shù)：
：抗壞血酸氧化酶(aso)是以分子氧為底物的氧化酶類，它隸屬于藍(lán)色氧化酶類，酶分子活性部位含有多個金屬銅離子，在催化還原性有機(jī)底物單電子氧化的同時，為氧分子(o2)提供四個電子，將其直接還原成h2o。國際酶學(xué)委員會將其命名為l-抗壞血酸:o2氧化還原酶，編號為：ec1.10.3.3。aso對還原性底物要求較高，僅作用于l-抗壞血酸和其它有在羰基鄰近含烯二醇基團(tuán)的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。aso廣泛存在于自然界，已從南瓜、黃瓜、柑桔等多種植物和微生物中得以純化，許多研究集中在酶的分離純化、細(xì)胞定位、分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、催化機(jī)制和酶學(xué)特征，已闡明其三維結(jié)構(gòu)、糖鏈結(jié)構(gòu)和銅結(jié)合位點，已從南瓜和黃瓜中克隆出該酶的cdna，并和其它含銅化酶的一級結(jié)構(gòu)比較了同源性。目前，通過南瓜提取純化得到aso的方法中還存在產(chǎn)品純度不高，葉綠素難以去除等問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明提供一種南瓜抗壞血酸氧化酶的提取純化方法，以更優(yōu)化地去除葉綠素。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)：一種南瓜抗壞血酸氧化酶的提取純化方法，經(jīng)過下列各步驟：(1)將青皮南瓜洗凈后削皮，以瓜皮為原料，加入瓜皮質(zhì)量1～3％的食鹽，再按固液質(zhì)量比為1:2加水混合后粉碎，得到粉碎液；(2)將步驟(1)所得粉碎液經(jīng)固液分離，所得分離液用醋酸調(diào)節(jié)ph值至5.0，再用板框過濾得到澄清液；(3)按水：乙醇：納米級硫酸銅：氨水的體積比為40～60：2～10：25～45：2～10，將氨水、乙醇、水和納米級硫酸銅混合后，在室溫下攪拌10～16小時，再加入硝酸溶液調(diào)節(jié)ph值為4～6，并繼續(xù)攪拌70～120分鐘，經(jīng)離心清洗后，即得到表面改性的微球；將所得表面改性的微球超聲分散到0.01mol/l的硝酸溶液中，在攪拌情況下，按微球質(zhì)量的0.05～1％加入聚乙二醇-4000，然后按微球質(zhì)量的2～50倍加入檸檬酸，攪拌30～90分鐘以上，用去離子水離心沉積和超聲分散循環(huán)的清洗方式，去除所得微球的反應(yīng)殘余物，即得到吸附顆粒；(4)按固液比mg/l計為1:4～10，在步驟(2)所得澄清液中加入步驟(3)所得吸附顆粒，攪拌60～120分鐘后，經(jīng)固液分離得到清液；(5)濃縮：用8000k～10000k的卷式膜濃縮機(jī)濃縮，按需要的活性確定濃縮倍數(shù)，即可得到濃縮液；(6)滅菌：用0.45u孔徑的膜過濾機(jī)把細(xì)菌過濾掉，得到無菌濃縮液(細(xì)菌的分子量都在0.6u以上)；(7)干燥：用冷凍真空干燥機(jī)把無菌的濃縮液凍干即得干燥的抗壞血酸氧化酶。所述步驟(3)的聚乙二醇-4000和檸檬酸為市購分析純產(chǎn)品。所述步驟(4)的攪拌由超聲波震蕩操作替代。所得干燥的抗壞血酸氧化酶用80目的粉碎機(jī)打粉，經(jīng)檢測活性、微生物指標(biāo)合格后即為成品。本發(fā)明具備的優(yōu)點及效果：本發(fā)明通過板框過濾、吸附顆粒結(jié)合膜過濾，能有效去除葉綠素，提高抗壞血酸氧化酶產(chǎn)品的純度。生產(chǎn)過程中產(chǎn)物易與水分離，便于按需要的活性獲得濃縮液，且滅菌效果好，產(chǎn)品合格率高。本發(fā)明工藝條件溫和，方法簡便，生產(chǎn)成本低，過程易于控制，對設(shè)備要求低，能耗低。本發(fā)明所得抗壞血酸氧化酶產(chǎn)品收率達(dá)80％以上，純度達(dá)99％以上。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實施例1(1)將青皮南瓜洗凈后削皮，以瓜皮為原料，加入瓜皮質(zhì)量2％的食鹽，再按固液質(zhì)量比為1:2加水混合后粉碎，得到粉碎液；(2)將步驟(1)所得粉碎液經(jīng)固液分離，所得分離液用醋酸調(diào)節(jié)ph值至5.0，再用板框過濾得到澄清液；(3)按水：乙醇：納米級硫酸銅：氨水的體積比為50：6：35：5，將氨水、乙醇、水和納米級硫酸銅混合后，在室溫下攪拌12小時，再加入硝酸溶液調(diào)節(jié)ph值為5，并繼續(xù)攪拌100分鐘，經(jīng)離心清洗后，即得到表面改性的微球；將所得表面改性的微球超聲分散到0.01mol/l的硝酸溶液中，在攪拌情況下，按微球質(zhì)量的0.5％加入聚乙二醇-4000，然后按微球質(zhì)量的30倍加入檸檬酸，攪拌60分鐘以上，用去離子水離心沉積和超聲分散循環(huán)的清洗方式，去除所得微球的反應(yīng)殘余物，即得到吸附顆粒；(4)按固液比mg/l計為1:6，在步驟(2)所得澄清液中加入步驟(3)所得吸附顆粒，攪拌80分鐘后，經(jīng)固液分離得到清液；(5)濃縮：用9000k的卷式膜濃縮機(jī)濃縮，按需要的活性確定濃縮倍數(shù)，即可得到濃縮液；(6)滅菌：用0.45u孔徑的膜過濾機(jī)把細(xì)菌過濾掉，得到無菌濃縮液(細(xì)菌的分子量都在0.6u以上)；(7)干燥：用冷凍真空干燥機(jī)把無菌的濃縮液凍干即得干燥的抗壞血酸氧化酶。實施例2(1)將青皮南瓜洗凈后削皮，以瓜皮為原料，加入瓜皮質(zhì)量1％的食鹽，再按固液質(zhì)量比為1:2加水混合后粉碎，得到粉碎液；(2)將步驟(1)所得粉碎液經(jīng)固液分離，所得分離液用醋酸調(diào)節(jié)ph值至5.0，再用板框過濾得到澄清液；(3)按水：乙醇：納米級硫酸銅：氨水的體積比為40：2：25：2，將氨水、乙醇、水和納米級硫酸銅混合后，在室溫下攪拌10小時，再加入硝酸溶液調(diào)節(jié)ph值為4，并繼續(xù)攪拌70分鐘，經(jīng)離心清洗后，即得到表面改性的微球；將所得表面改性的微球超聲分散到0.01mol/l的硝酸溶液中，在攪拌情況下，按微球質(zhì)量的0.05％加入聚乙二醇-4000，然后按微球質(zhì)量的2倍加入檸檬酸，攪拌30分鐘以上，用去離子水離心沉積和超聲分散循環(huán)的清洗方式，去除所得微球的反應(yīng)殘余物，即得到吸附顆粒；(4)按固液比mg/l計為1:4，在步驟(2)所得澄清液中加入步驟(3)所得吸附顆粒，超聲波震蕩60分鐘后，經(jīng)固液分離得到清液；(5)濃縮：用8000k的卷式膜濃縮機(jī)濃縮，按需要的活性確定濃縮倍數(shù)，即可得到濃縮液；(6)滅菌：用0.45u孔徑的膜過濾機(jī)把細(xì)菌過濾掉，得到無菌濃縮液(細(xì)菌的分子量都在0.6u以上)；(7)干燥：用冷凍真空干燥機(jī)把無菌的濃縮液凍干即得干燥的抗壞血酸氧化酶。實施例3(1)將青皮南瓜洗凈后削皮，以瓜皮為原料，加入瓜皮質(zhì)量3％的食鹽，再按固液質(zhì)量比為1:2加水混合后粉碎，得到粉碎液；(2)將步驟(1)所得粉碎液經(jīng)固液分離，所得分離液用醋酸調(diào)節(jié)ph值至5.0，再用板框過濾得到澄清液；(3)按水：乙醇：納米級硫酸銅：氨水的體積比為60：10：45：10，將氨水、乙醇、水和納米級硫酸銅混合后，在室溫下攪拌16小時，再加入硝酸溶液調(diào)節(jié)ph值為6，并繼續(xù)攪拌120分鐘，經(jīng)離心清洗后，即得到表面改性的微球；將所得表面改性的微球超聲分散到0.01mol/l的硝酸溶液中，在攪拌情況下，按微球質(zhì)量的1％加入聚乙二醇-4000，然后按微球質(zhì)量的50倍加入檸檬酸，攪拌90分鐘以上，用去離子水離心沉積和超聲分散循環(huán)的清洗方式，去除所得微球的反應(yīng)殘余物，即得到吸附顆粒；(4)按固液比mg/l計為1:10，在步驟(2)所得澄清液中加入步驟(3)所得吸附顆粒，攪拌120分鐘后，經(jīng)固液分離得到清液；(5)濃縮：用10000k的卷式膜濃縮機(jī)濃縮，按需要的活性確定濃縮倍數(shù)，即可得到濃縮液；(6)滅菌：用0.45u孔徑的膜過濾機(jī)把細(xì)菌過濾掉，得到無菌濃縮液(細(xì)菌的分子量都在0.6u以上)；(7)干燥：用冷凍真空干燥機(jī)把無菌的濃縮液凍干即得干燥的抗壞血酸氧化酶。對比例1：同實施例1，僅省略步驟(2)。對比例2：同實施例1，僅省略步驟(3)和(4)。對比例3：同實施例1，僅省略步驟(6)。收率純度葉綠素去除率滅菌率對比例162％95％88％91％對比例277％93％84％97％對比例381％98％95％92％實施例185％99.3％97％99.1％實施例288％99.5％98％99.0％實施例386％99.6％97％99.2％當(dāng)前第1頁12