本發(fā)明涉及一種一氧化氮供體，特別是涉及一種角蛋白生物大分子一氧化氮供體及其合成方法，以及所述的一氧化氮供體在血液接觸材料、傷口愈合材料等生物醫(yī)學材料中的應用。

背景技術：

1992年no成為《science》雜志的年度明星分子。1998年度的諾貝爾醫(yī)學獎授予美國科學家ignarro，murad和fuchgott，以表彰他們在“no作為心血管系統(tǒng)的信號分子”研究中的杰出貢獻。no在心血管系統(tǒng)中主要有三個作用：抑制血小板聚集、舒張血管、防止心肌缺血再灌注損傷。此外，no還可以殺菌、消炎、促進傷口愈合。

一氧化氮供體主要有有機硝酸酯類、金屬-no配合物類、有機亞硝酸酯類、n-亞硝胺類、肽偶聯(lián)nonoates類、亞硝基硫醇類等，其中n-亞硝胺類和亞硝基硫醇類研究最廣。常見的外源性no小分子供體，在體內(nèi)的半衰期很短，不穩(wěn)定，并且具有生物毒性等，因而限制了其生物學作用的有效性和持續(xù)性。理想的no供體應具備良好的穩(wěn)定性、釋放機制簡單、長時間作用無耐受性、釋放過程便于控制等特點。

no可以與硫醇類物質(zhì)的巰基以共價鍵的方式結(jié)合形成rsno，使其性質(zhì)相對穩(wěn)定。亞硝基硫醇類不需細胞代謝，可通過自發(fā)均裂反應產(chǎn)生no。人工合成的no供體rsno類藥物snap(s-亞硝基乙酰青霉胺)已用于臨床。臨床上常用的no供體藥物是有機硝酸酯和金屬-no配合物類(如硝普鈉)，典型代表分別為三硝酸甘油酯和硝普鈉。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種角蛋白生物大分子一氧化氮供體及其制備方法，能夠克服現(xiàn)有的外源性no供體的缺陷，所述的一氧化氮供體分子量大、穩(wěn)定性良好、生物相容性好，具有可控釋放no的功能。

本發(fā)明的另一目的還在于提供所述的角蛋白生物大分子一氧化氮供體的應用。

為實現(xiàn)本發(fā)明目的，采用以下技術方案：

一種角蛋白生物大分子一氧化氮供體，其特征在于，所述的一氧化氮供體包含角蛋白經(jīng)還原法處理后所得到的還原型角蛋白，所述還原型角蛋白上的巰基上形成sno基團。

本發(fā)明的一氧化氮供體為一種s-亞硝基化角蛋白(ksno)，其中sno基團可以在一定條件下分解，從而釋放no。所述一氧化氮供體中sno基團的量，可以根據(jù)巰基取代度的大小控制，通過硫亞硝基化前后巰基的濃度的變化測定得到。

所述的角蛋白生物大分子一氧化氮供體采用以下方法制備：

一種角蛋白生物大分子一氧化氮供體的制備方法可稱之為“油相法”，其合成過程如圖1所示，具體合成方法包括：將還原型角蛋白和亞硝酸叔丁酯的甲醇溶液混合，暗處避光，氮氣氣氛室溫下攪拌；優(yōu)選還原型角蛋白中的巰基和亞硝酸叔丁酯的化學計量比為1∶1。反應結(jié)束后，室溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除未反應的亞硝酸叔丁酯和副產(chǎn)物叔丁醇，凍干避光保存，即得角蛋白生物大分子一氧化氮供體。

另一種角蛋白生物大分子一氧化氮供體的制備方法可稱之為“水相法”，其合成過程如圖2所示，具體合成方法包括：將還原型角蛋白在亞硝酸鈉水溶液中攪拌溶解，優(yōu)選還原型角蛋白中的巰基和亞硝酸鈉的化學計量比為1∶1；冰浴下，滴加濃鹽酸，避光攪拌反應；透析除去多余小分子，凍干制得角蛋白生物大分子一氧化氮供體。

所述的還原型角蛋白的制備參照中國專利(公開號cn104784744a，cn104784758a)，主要原理是將角蛋白中的二硫鍵通過還原劑處理，從而斷裂為巰基基團。巰基基團的含量可以通過dtnb法測定得到。

本發(fā)明還涉及所述的角蛋白生物大分子一氧化氮供體在制備生物醫(yī)學材料或no藥物方面的應用。

所述的生物醫(yī)學材料包括人工血管、血管支架、傷口敷料等血液接觸材料。所述的角蛋白生物大分子一氧化氮供體可以應用于制備no釋放型人工血管或血管支架、no釋放型傷口敷料等?？蓪⒔堑鞍咨锎蠓肿右谎趸w與聚合物共混復合，采用靜電紡絲法、冷凍干燥法、流延成膜法等制備成纖維狀、膜狀或多孔性等材料，用于人工血管、血管支架或傷口敷料等用途。例如，可以將角蛋白生物大分子一氧化氮供體與聚合物共混復合，制備薄膜或涂層；或與其他聚合物共混，流延成膜。特別地，可以通過靜電紡絲法制備角蛋白生物大分子一氧化氮供體/聚合物納米纖維，用于制備人工血管、血管支架、傷口敷料等材料。

有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有小分子no供體相比，突出的優(yōu)點在于，合成的大分子一氧化氮供體分子量大、可以穩(wěn)定保存，生物相容性好、毒性低，具備角蛋白的性質(zhì)，還可以釋放no。所述的角蛋白生物大分子一氧化氮供體可以直接作為no供體使用，也可以容易地與其他材料復合，制備出具有可控釋放no功能的生物醫(yī)用材料，具有抗血小板粘附、促進血管內(nèi)皮細胞生長，抑制平滑肌細胞生長的特性，可用于心血管疾病的治療和皮膚修復等。

附圖說明

圖1角蛋白生物大分子一氧化氮供體(ksno)的油相法合成示意圖；

圖2角蛋白生物大分子一氧化氮供體(ksno)的水相法合成示意圖；

圖3角蛋白no供體ksno的紫外光譜圖；

圖4nano2標準曲線；

圖5角蛋白no供體ksno的穩(wěn)定性測試；

圖6角蛋白no供體ksno的no釋放圖；

圖7pcl(a)和pcl/ksno(b)納米纖維掃描電鏡圖sem圖；

圖8pcl(a)、pcl/ksno(b)和pcl/ksno/asc(c)納米纖維的血小板粘附圖；

圖9huvec細胞培養(yǎng)3天的mtt圖；***表示不同組之間的顯著性差異p＜0.001；

圖10大腸桿菌的mtt圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明所述的技術方案給予進一步詳細的說明，但有必要指出以下實施例只用于對發(fā)明內(nèi)容的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護范圍的限制。

實施例1：角蛋白生物大分子一氧化氮供體及其合成(油相法)

取0.1g實驗室提取的還原型角蛋白(ksh，巰基角蛋白)于棕色瓶中用5ml乙醚分散，加入1ml亞硝酸叔丁酯的乙醚溶液，暗處避光，氮氣氣氛室溫下攪拌24h。室溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除未反應的亞硝酸叔丁酯、副產(chǎn)物叔丁醇和乙醚，即得s-亞硝基化角蛋白(ksno)，是一種no供體的角蛋白。

將上述制備的s-亞硝基化角蛋白(ksno)配成一定濃度的溶液，在200～600nm波長范圍內(nèi)測量紫外吸收光譜，如圖3所示。在334nm處出現(xiàn)的吸收峰為改性后角蛋白上s-no鍵上n0-π*電子躍遷吸收(v.b.damodaran，l.w.place，m.j.kipper，m.m.reynolds.

enzymaticallydegradablenitricoxidereleasings-nitrosateddextranthiomersforbiomedicalapplications.journalofmaterialschemistry，2012，22：23038-23048.)，而巰基角蛋白的特征吸收峰在276nm(x.l.zhi，y.f.wang，p.f.li，j.yuan，j.shen.preparationofkeratin/chlorhexidinecomplexnanoparticlesforlong-termanddualstimuliresponsiverelease.

rscadvances，2015，5，82334-82341.)。這些結(jié)果顯示ksno合成成功。

實施例2：角蛋白生物大分子一氧化氮供體及其合成(水相法)

將還原型角蛋白樣品0.1g投入2ml，50mg/ml亞硝酸鈉水溶液中攪拌溶解。冰浴下，慢慢滴加5ml，5m鹽酸。避光攪拌反應2h。透析除去多余小分子，凍干制得sno端基角蛋白。樣品-20℃避光保存。

實施例3：角蛋白生物大分子一氧化氮供體的穩(wěn)定性實驗

取實施例1或2制備的角蛋白生物大分子一氧化氮供體ksno20mg，先用5ml磷酸鹽緩沖液中溶解，將此溶液用35ml含0.1mmoledta的磷酸鹽緩沖液37℃透析。設定時間取樣，用no試劑盒測定no的含量，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，角蛋白生物大分子一氧化氮供體在磷酸鹽緩沖液溶液中穩(wěn)定性較好。

實施例4：體外no釋放

分別采用cu(ii)和抗壞血酸這兩種引發(fā)劑誘導引發(fā)合成的ksno分解釋放no。

用1mol·l^-1的nano2標準溶液進行稀釋，得到不同濃度梯度的nano2溶液，每種濃度梯度的溶液取50μl加入96孔板中，再依次加入50μlgriess試劑i和griess試劑ii，避光靜置反應15min后，用酶標儀測540nm吸光度。以nano2溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，如圖4。所得標準曲線方程為：a＝0.00273+0.00623c，r²＝0.992。

稱取兩份5mgksno樣品分別放入螺口瓶中設置為a和b兩組，另設一組空白對照組(不加任何樣品)。每瓶加入5mlpbs緩沖溶液中(a含有50mg/mlcubr2溶液，b含有250μg/ml抗壞血酸(asc)溶液)，密封后在37℃空氣浴中進行搖動，每隔一定時間(12h，24h，36h，48h，60h，72h，96h)。反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)移溶液至96孔板中，用no檢測試劑盒檢測亞硝酸根含量，然后依據(jù)nano2標準曲線換算出no生成量。

按上述方法，取實施例1或2制備的角蛋白生物大分子一氧化氮供體ksno，用no試劑盒測定no的含量，結(jié)果如圖6所示。由圖可見，在加入cu(ii)和抗壞血酸兩種引發(fā)劑后，no釋放量比空白有明顯增加，表明引發(fā)劑的加入促進ksno釋放no。

實施例5：具有no釋放功能的pcl/ksno聚合物納米纖維的制備

紡絲溶液配制：紡絲液濃度為7wt％，溶劑為六氟異丙醇(hfip)，pcl，pcl與ksno共聚物按比例為9/1(w/w)，同時含1％n-聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，以及pcl與ksno共聚物按比例為7/3(w/w)，室溫下充分攪拌溶解至紡絲液均勻。

靜電紡絲：將配制好的pcl/ksno溶液加入到20ml醫(yī)用注射器中，采用內(nèi)徑為0.6mm的針頭，將注射器固定于輸液泵中(型號為cp-1100，slgo醫(yī)學科技有限公司，北京)，調(diào)整發(fā)射電極和接收電極的距離為15cm，靜電紡絲的流速為2.0ml/h，開啟靜電發(fā)生器，以相同電壓20kv暗處進行紡絲，得到淡黃色混紡納米纖維，50℃真空烘箱中避光干燥6h左右，待溶劑揮發(fā)完全后取出。

對pcl和pcl/ksno表面通過sem進行表征。如圖7所示，從sem圖可以觀察到納米纖維是均勻的，具有光滑的表面和納米級纖維結(jié)構(gòu)。

采取靜態(tài)法測定纖維表面水接觸角的變化。結(jié)果顯示，pcl靜電紡納米纖維膜水接觸角為133.59±4.18°，呈現(xiàn)出很強的疏水性?；烊敫男院蟮慕堑鞍祝溆H水性有了明顯改善，pcl/ksno水接觸角為0.557±0.32°，改性后的角蛋白仍然保持角蛋白的良好親水性。

血小板粘附

取新鮮抗凝兔血以1500rpm/min的速度離心15min后，吸取上層清液富血小板血漿(prp)。將提前準備好的樣品放在24孔板中，并用pbs浸泡24h，結(jié)束后除去pbs，在每孔中加入0.5mlprp以及催化劑抗壞血酸(asc)(濃度為250μg/ml)溶液，在37℃靜態(tài)下孵化3h，結(jié)束后除去多余的prp，用pbs輕輕洗滌3次。用2.5％戊二醛水溶液在4℃下固定2h。用25％，50％，75％，90％，100％梯度的乙醇水溶液相繼脫水20min。結(jié)束后冷凍干燥，sem下觀察纖維表面的血小板粘附情況。

為了表征制備的pcl/ksno納米纖維的血液相容性，通過掃描電子顯微鏡觀察粘附在材料表面的血小板數(shù)量情況來進行表征如圖8所示。大量血小板粘附在pcl納米纖維墊上，粘附在pcl/ksno納米纖維墊的表面上的血小板數(shù)量低于粘附在純pcl納米纖維墊上的血小板數(shù)量，這主要是由于改性后的角蛋白固定在納米纖維后，pcl表面親水性提高。相比較pcl/ksno和純的pcl材料，加入抗壞血酸的pcl/ksno納米纖維墊表面血小板數(shù)量明顯降低，基本沒有被激活，這可能原因是抗壞血酸的加入催化pcl/ksno釋放no，從而抑制纖維表面血小板粘附和活化。

人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

以含20％的胎牛血清的改良型rpmi-1640為培養(yǎng)基，將人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(huvec)于37℃含5％co2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25％胰蛋白酶消化，配成5×10⁴cells/ml的細胞懸液。將樣品剪成2×2cm²方片，放在超凈臺中并在紫外線下正反面各照射1h，然后將其放入24孔細胞培養(yǎng)板中，并用滅菌的玻璃圈固定。用75％的酒精浸泡30min，結(jié)束后用pbs緩沖溶液清洗3次，最后向每孔內(nèi)加入1ml細胞懸液以及15μl抗壞血酸(濃度為250μg/ml)溶液，于37℃含5％co2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12h加一次15μl抗壞血酸溶液，于37℃含5％co2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，陰性對照實驗(negativecontrol)為1ml含20％胎牛血清的細胞懸液，將培養(yǎng)板放入溫度為37℃，co2濃度為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。結(jié)束后向每個孔里加入100μlmtt溶液(濃度為0.5mg/ml)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后將mtt溶液和細胞培養(yǎng)液吸去，用pbs溶液洗滌后，加入500μldmso，避光并用振蕩器震蕩20min后，吸取甲瓚溶液轉(zhuǎn)入96孔板中，用酶標儀測570nm處其od值。

用mtt法檢測納米纖維表面內(nèi)皮細胞(huvec)的生長情況如圖9所示，在抗壞血酸的存在下，細胞存活數(shù)量在pcl/ksno納米纖維上明顯高于無抗壞血酸pcl/ksno和pcl納米纖維的表面，表明抗壞血酸能夠誘導亞硝基硫醇釋放出no，促進內(nèi)皮細胞的生長，有利于血管的形成。

抑菌mtt法

將pcl和pcl/ksno樣品剪成2×2cm²方片，放入24孔培養(yǎng)板中，在超凈臺中并在紫外線下正反面各照射1h，取大腸桿菌菌液，用pbs溶液稀釋到1×10⁷cfus·ml^-1(560nmod＝0.1)^[11]。每孔加入1ml稀釋后的菌液以及15μl抗壞血酸(濃度為250μg/ml)溶液，置于培養(yǎng)箱里37℃培養(yǎng)12h。結(jié)束后向每個孔里加入100μl5％mtt溶液(濃度為0.5mg.ml^-1)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)12h。然后將mtt溶液和細胞培養(yǎng)液吸去，用pbs溶液洗滌后，加入500μldmso，避光振震蕩30min后，用酶標儀(bio-teksynergy2型酶標儀，美國)測570nm處od值。

在真皮傷口中通常存在包括金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的病原體，它們是延遲傷口愈合，甚至膿毒癥的原因。通過mtt方法對pcl/ksno的抑菌性做了定性表征。實驗結(jié)果如圖10所示，pcl/ksno在無抗壞血酸存在下對大腸桿菌有溫和的生長抑制現(xiàn)象。這歸因于s-亞硝基化硫醇在生理ph和溫度下的緩慢分解。相比之下，在抗壞血酸存在下，催化pcl/ksno釋放no，加速細菌的生長抑制及滅殺。增強的殺菌效力可能是由抗壞血酸誘導使初始no量增加的結(jié)果。通過材料的殺菌活性實驗表明其可有效的對no存儲和釋放提供良好的平臺。

總之，本發(fā)明的角蛋白生物大分子一氧化氮供體可以采用靜電紡絲法、冷凍干燥法、流延成膜法等制備成纖維狀、多孔性等材料，制備得到復合人工血管、血管支架或傷口敷料等材料，用于人工血管、血管支架或傷口敷料等用途。