技術(shù)領(lǐng)域:

本發(fā)明涉及分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種有助于青光眼診斷的長鏈非編碼rna標(biāo)志物、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：
:

眼睛是人體十分重要的感覺器官，能夠接受外部的光刺激，并將光沖動傳送到大腦中樞而引起視覺。達(dá)芬奇曾說：“眼睛是心靈的窗戶，通過眼睛，人們得以擁抱和欣賞世界的無限美妙，靈魂才得以安居于體內(nèi)”。信息時(shí)代，人通過感覺器官從外界獲得的信息中，大約90％是由眼睛來完成的。世界衛(wèi)生組織的資料顯示，眼科疾病已成為繼腫瘤、心血管疾病之后的第三位危害及影響人們生存質(zhì)量的疾病。在所有眼科疾病中，青光眼則是首位不可逆轉(zhuǎn)的致盲性眼病，其影響視覺質(zhì)量的原因是通過威脅和損害視神經(jīng)及其通路而導(dǎo)致失明，從而嚴(yán)重威脅人類的視覺健康，給個(gè)人、家庭和社會造成難以估量的損失。

青光眼造成的主要危害是影響視覺功能，即便是在發(fā)達(dá)國家中，也只有50％左右的青光眼患者能夠得到及時(shí)的診斷和治療，而且，青光眼的發(fā)病因素、遺傳學(xué)規(guī)律等均不明了，因此我們要科學(xué)地掌握其發(fā)生發(fā)展規(guī)律，從而進(jìn)行早期診斷和早期治療，避免青光眼患者的失明。目前，青光眼的診斷主要是依靠病史、形態(tài)學(xué)和功能學(xué)方面的檢查，如眼壓測量、超聲生物顯微鏡、眼底照相、光學(xué)相干斷層掃描和視野檢查等。雖然這些檢查可以診斷青光眼，但研究表明，通過形態(tài)學(xué)和功能學(xué)手段診斷的青光眼，患者視覺功能的損害已經(jīng)超過50％。而青光眼相關(guān)的生化檢查、血清學(xué)篩查及檢測標(biāo)準(zhǔn)仍處于相對空白狀態(tài)，因此尋找一種高靈敏度和高特異性的標(biāo)志物對青光眼診斷和監(jiān)控尤為重要。

基因組計(jì)劃研究表明，在組成人類基因組的30億個(gè)堿基對中，僅有1.5％的核苷酸序列用于蛋白質(zhì)編碼，其余98.5％的基因組為非蛋白編碼序列。這些序列曾被認(rèn)為是在進(jìn)化過程中累積的“垃圾序列”而未予以關(guān)注，在隨后啟動的人類基因組dna元件百科全書(encyclopediaofdnaelements,encode)計(jì)劃中，研究表明75％的基因序列能夠被轉(zhuǎn)錄成rna，其中近74％的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為非編碼rna(non-codingrnas，ncrnas)。在ncrna中，序列長度大于200個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄本為長鏈非編碼rnas(longnoncodingrna,lncrnas),它們由于功能的豐富性及作用機(jī)制的多樣性而備受關(guān)注。lncrnas能夠在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯多個(gè)層面上調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)，從而廣泛地參與包括細(xì)胞分化和機(jī)體發(fā)育在內(nèi)的重要生命過程，其異常表達(dá)還與人類多種重大疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

lncrna具有高度保守性及組織特異性，在腦部含量非常豐富。lncrna不僅參與了神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育和功能完善，使神經(jīng)系統(tǒng)按照一定的時(shí)間順序和在一定的空間內(nèi)進(jìn)行生長和發(fā)育，并且參與執(zhí)行神經(jīng)系統(tǒng)的功能。lncrna通過多種機(jī)制參與到神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及功能執(zhí)行中，包括作為順式作用元件及反式作用因子參與基因印記、染色質(zhì)重塑、細(xì)胞周期調(diào)控、剪接調(diào)控、mrna降解和翻譯調(diào)控等過程。因此，利用檢測lncrnas的組成及表達(dá)水平的變化來反映神經(jīng)系統(tǒng)的生理及病理狀態(tài)是可行的手段。

房水屬于眼內(nèi)容物，由睫狀體產(chǎn)生，經(jīng)過瞳孔、小梁網(wǎng)等最終進(jìn)入血液，且處于動態(tài)循環(huán)之中，其成分構(gòu)成與眼球局部生理及病理環(huán)境密切相關(guān)。外泌體作為機(jī)體至關(guān)重要的細(xì)胞間相互交流的中介物質(zhì)，包含了lncrnas、mrnas、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等。外泌體內(nèi)包含的物質(zhì)由于特殊保護(hù)機(jī)制能長期保持穩(wěn)定狀態(tài)。因此，房水中的lncrnas等分子可以外泌體的形式傳遞細(xì)胞間的相互交流信息，并可隨房水的動態(tài)循環(huán)進(jìn)入血液。因此青光眼相關(guān)的lncrnas研究具有為青光眼相關(guān)生物標(biāo)志物檢測提供理論基礎(chǔ)的潛能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種用于青光眼早期診斷的長鏈非編碼rna，對青光眼的發(fā)病檢測有重要意義。

用于青光眼早期診斷的分子標(biāo)記物lncrnast342877，其序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明的目的之二是提供上述分子標(biāo)記物lncrnast342877的應(yīng)用。檢測lncrnast342877表達(dá)水平的產(chǎn)品在制備青光眼早期診斷工具中的應(yīng)用。

所述的檢測lncrnast342877表達(dá)水平的產(chǎn)品包括：通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測lncrnast342877表達(dá)水平的制劑。

用實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測lncrnast342877表達(dá)水平的制劑包括特異性擴(kuò)增lncrnast342877的引物。

用實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測lncrnast342877表達(dá)水平的特異性擴(kuò)增lncrnast342877的引物序列為：

f:5'-tctgcgggacattcatacct-3’，

r:5'-atttccttctctctcctggtctc-3’。

本發(fā)明的目的之三是提供一種用于青光眼早期診斷的試劑盒，包含檢測lncrnast342877表達(dá)水平的試劑。具體是包含通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測lncrnast342877表達(dá)水平的試劑。

所述的通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測lncrnast342877表達(dá)水平的試劑包含通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr特異性擴(kuò)增lncrnast342877的引物。

所述的通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測lncrnast342877表達(dá)水平的試劑包含一對通過實(shí)時(shí)熒光定量pcr特異性擴(kuò)增lncrnast342877的引物，其引物序列為：

f:5'-tctgcgggacattcatacct-3’，

r:5'-atttccttctctctcctggtctc-3’。

我們運(yùn)用qrt-pcr檢測方法驗(yàn)證lncrnas-t267384、enst00000607393和t342877在房水、虹膜組織和血清中的表達(dá)水平并分析其在兩類房水中表達(dá)量的差異。在三種組織中，房水具有最高的診斷意義，三種lncrnas在房水中診斷青光眼的敏感性/特異性均大于90％。這種現(xiàn)象的可能原因是由于血-房水屏障的存在，顯著限制了血源性免疫細(xì)胞和來自全身其他部位的信號分子進(jìn)入房水。因此較血清而言，房水更能特異性的代表眼部的生理及病理狀態(tài)。因此，在今后的研究中房水可能較血清具有更大的青光眼診斷價(jià)值。

對于本申請而言，申請人發(fā)現(xiàn)相對于對照組人群，lncrnas:t342877在青光眼患者的房水中表達(dá)上調(diào)。提示t342877是青光眼中的高表達(dá)lncrnas，是有助于青光眼診斷的生物標(biāo)志物。本發(fā)明為青光眼診斷提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。

附圖說明

圖1為青光眼患者房水中l(wèi)ncrnas和mrnas表達(dá)譜；

a：青光眼患者房水中l(wèi)ncrnas表達(dá)譜分析聚類圖；b：青光眼患者房水中mrnas表達(dá)譜分析聚類圖。

圖2為青光眼患者房水中差異表達(dá)的lncrnas和mrnas；

a：較年齡相關(guān)性白內(nèi)障而言，青光眼患者房水中2倍差異表達(dá)的lncrnas；b：較年齡相關(guān)性白內(nèi)障而言，青光眼患者房水中2倍差異表達(dá)的mrnas。

圖3為青光眼患者房水中l(wèi)ncrnas和mrnas表達(dá)的cnc分析圖；

紅色點(diǎn)代表lncrnas，藍(lán)色點(diǎn)代表mrnas，實(shí)線代表正相關(guān)，虛線代表負(fù)相關(guān)。

圖4為lncrnas在青光眼及年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水中的表達(dá)量；

a-c：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼及年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水中表達(dá)的散點(diǎn)圖；d-f：t267384、enst00000607393和t342877在在青光眼及年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水中表達(dá)的箱圖。

圖5為lncrnas在青光眼患者對照人群虹膜組織中的表達(dá)量；

a-c：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者及對照人群虹膜組織中表達(dá)的散點(diǎn)圖；d-f：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者對照人群虹膜組織中表達(dá)的箱圖。

圖6為lncrnas在青光眼患者及對照人群血清中的表達(dá)量；

a-c：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者及對照人群血清中表達(dá)的散點(diǎn)圖；d-f：t267384、enst00000607393和t342877在青光眼患者對照人群血清中表達(dá)的箱圖。

圖7為利用lncrnas在不同組織中診斷青光眼的roc曲線；

a：利用t267384在房水中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.998；b：利用enst00000607393在房水中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.998；c：利用t342877在房水中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.983；d：利用enst00000607393在虹膜組織中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.793；e：利用t267384在血清中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.620；f：利用enst00000607393在血清中診斷青光眼的roc曲線，曲線下面積為0.638。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：青光眼患者房水中l(wèi)ncrnas及mrnas的表達(dá)譜：

1.1材料與試劑

1.1.1主要儀器

常用離心機(jī)及低溫離心機(jī)購自eppendorf公司；高速離心機(jī)購自beckman公司；real-timepcr儀器購自abi公司；移液器和電動移液槍購自eppendorf公司；q5000購自quawelltechnology公司；制冰機(jī)購自sanyan公司。

1.1.2材料與試劑

不同型號的離心管及pcr管均購自axygen公司；depc水購自鼎國昌盛公司；trizol購自invitrogen公司；targetamp^tm1-roundarnaamplification試劑盒購自epicentre公司；transcriptorfirststrandcdnasynthesis試劑盒購自roche公司；quickamplabelingkit,one-color試劑盒購自agilenttechnologies公司；人lncrnasmicroarray芯片購自arraystar公司。

1.1.3試劑配置

各種免疫印跡所用試劑根據(jù)《分子克隆(第三版)》中提供的方法配置。

1.2方法

1.2.1房水樣本準(zhǔn)備

該研究已通過中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院倫理委員會審批。術(shù)前與所有研究對象簽署知情同意書，在正式手術(shù)步驟開始前利用1ml的一次性無菌注射器于角膜緣抽取未稀釋的房水標(biāo)本0.1ml，立即注入高壓滅菌的0.5mlep管中，置于-80℃低溫冰箱避光保存?zhèn)溆谩Ｋ腥脒x患者為在我院住院需要進(jìn)行手術(shù)治療的青光眼患者和年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：1.原發(fā)性開角型青光眼：a.眼壓>21mmhgb.青光眼性視盤損害和/rnfl缺損c.典型的青光眼性視野缺損d.前房角開放。具有以上四項(xiàng)或具有其中的a,d,b或c者。2.正常眼壓性青光眼：具有類似于poag的視盤改變，rnfl及視野損害，24h眼壓測量均≤21mmhg,房角開放。3.原發(fā)性閉角型青光眼：具有青光眼的視盤改變，rnfl及視野損害，眼壓>21mmhg,前房角變窄或關(guān)閉4.年齡相關(guān)性白內(nèi)障(對照組)：晶狀體呈皮質(zhì)性和/或核型渾濁和/或后囊下性混濁。排除標(biāo)準(zhǔn)：1.伴發(fā)全身性疾病如高血壓和糖尿病等。2.繼發(fā)性青光眼3.可能影響視野、視神經(jīng)或色覺的眼科或神經(jīng)科疾病。4.視野檢測可靠性標(biāo)準(zhǔn)：固視丟失率、假陽性率和/或假陰性率>25％。5.年齡相關(guān)性白內(nèi)障：排除并發(fā)性、外傷性、先天性白內(nèi)障并排除伴有其他眼內(nèi)疾病者、排除過熟期病例。

1.2.2rna提取

取房水0.1ml加入0.5mltrizol試劑，劇烈震蕩后加入0.1毫升氯仿。而后經(jīng)離心、沉淀及75％乙醇清洗后溶于10微升dpec水，經(jīng)q5000儀器測量各管rna濃度。

1.2.3rna擴(kuò)增

使用targetamp^tm1-roundarnaamplificationkit103(epicentre)按生廠商說明書所示步驟對rna進(jìn)行擴(kuò)增。大致步驟如下：首先根據(jù)rna樣本合成單成單鏈cdna:rna雜交產(chǎn)物，然后使用rnaseh酶將上述雜交產(chǎn)物消化為小片段序列，這些小片段序列可協(xié)助雙鏈cdna的合成。最后由雙鏈cdna轉(zhuǎn)錄合成反義rna。

1.2.4cdna合成和標(biāo)記

使用transcriptorfirststrandcdnasynthesiskit(roche)按生廠商說明書所示步驟合成cdna。使用quickamplabelingkit,one-color(agilenttechnologies)對合成的cdna進(jìn)行標(biāo)記。

1.2.5標(biāo)記效率質(zhì)量檢測

取1.5微升已標(biāo)記的cdna樣本，使用nanodropnd-1000檢測熒光標(biāo)記效率。

1.2.6芯片雜交

在標(biāo)準(zhǔn)條件下將標(biāo)記好的探針和高密度芯片(humanlncrnamicroarrayv4.0,arraystar公司)進(jìn)行雜交。該芯片共檢測40173種lncrnas及20730種mrnas表達(dá)水平。

1.2.7圖像采集和數(shù)據(jù)分析

使用genepix4000b芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存。p值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3結(jié)果

1.3.1青光眼患者房水中l(wèi)ncrnas及mrnas的表達(dá)譜

在10份青光眼患者房水樣本中平均檢測到20653±569.9種lncrnas和11265±268.3種mrnas。其中，10份青光眼患者房水樣本中均檢測到的lncrnas為11728種，均檢測到的mrnas為6686種。1.3.2青光眼患者房水中差異表達(dá)的lncrnas及mrnas

較年齡相關(guān)性白內(nèi)障而言，青光眼患者房水中2倍上調(diào)表達(dá)的lncrnas為4372種，2倍下調(diào)表達(dá)的lncrnas為2602種。較年齡相關(guān)性白內(nèi)障而言，青光眼患者房水中2倍上調(diào)表達(dá)的mrnas為2783種，2倍下調(diào)表達(dá)的mrnas為1617種。

1.4結(jié)果

由于其易取性、個(gè)體特異性及相對受機(jī)體其他器官影響較小的特點(diǎn)，房水是一種眼部疾病生物標(biāo)志物相關(guān)研究的價(jià)值較大的研究對象。并且，盡管目前已有多種研究報(bào)道青光眼相關(guān)的流行病學(xué)及遺傳學(xué)危險(xiǎn)因素，但以房水為研究對象的相關(guān)研究相對較少。因此，我們認(rèn)為房水具有應(yīng)用于今后青光眼相關(guān)遺傳學(xué)研究的潛能。由于取樣的限制，人源性房水樣本體積較小。為克服該問題，我們在進(jìn)行芯片雜交前增加rna擴(kuò)增步驟，如此以保證后續(xù)步驟的順利進(jìn)行。通過使用lncrnas芯片微陣列分析方法，11728種lncrnas及6686種mrnas在10份青光眼房水樣本中均檢測到，這與年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水中l(wèi)ncrnas和mrnas表達(dá)譜具有顯著差異，因此房水中l(wèi)ncrnas和mrnas表達(dá)譜表現(xiàn)出個(gè)體特異性及疾病特異性。就我們所知，這是第一個(gè)青光眼房水相關(guān)lncrnas和mrnas表達(dá)譜研究。

實(shí)施例2：通過cnc分析明確房水中特定lncrnas與mrnas的相關(guān)性

為進(jìn)一步探討青光眼患者房水中表達(dá)的lncrnas的可能功能，我們運(yùn)用cnc(coding-noncodinggeneco-expression)分析明確與青光眼相關(guān)基因的mrnas表達(dá)具有顯著相關(guān)性的lncrnas。cns分析是一種通過lncrna和mrna共表達(dá)數(shù)據(jù)，將lncrna與mrna聯(lián)系起來的分析方法。通過cnc分析可以發(fā)現(xiàn)與某個(gè)lncrna具有相同表達(dá)模式的mrna，通過這些mrna的功能，可以將lncrna與特定信號通路或疾病狀況聯(lián)系起來，從而便于預(yù)測lncrna的功能，并揭示其作用機(jī)制。

2.1方法

挑選房水中差異表達(dá)并且與青光眼發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性的mrnas，將這些mrnas在不同青光眼患者房水中的表達(dá)數(shù)據(jù)求平均值；求挑選出的mrnas標(biāo)準(zhǔn)化之后的數(shù)據(jù)與青光眼患者房水中差異表達(dá)的lncrnas相關(guān)數(shù)據(jù)之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)(pearsoncorrelationcoefficient,pcc)與錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(falsediscoveryrate,fdr)；挑選出pcc≥0.90并且fdr≤0.05的記錄；使用相關(guān)記錄，利用cytoscape2.8.3工具繪圖。

2.2結(jié)果

較年齡相關(guān)性白內(nèi)障而言，在青光眼患者房水中差異表達(dá)且與青光眼發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性的mrnas為如下十種：骨形態(tài)生成蛋白2(bonemorphogeneticprotein2,bmp2)、室管膜相關(guān)基因1(ependyminrelated1,epdr1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowthfactorbeta1,tgfb1)、叉頭蛋白e3(forkheadboxe3,foxe3)、生長激素促分泌素受體(growthhormonesecretagoguereceptor,ghsr)、叉頭蛋白c1(forkheadboxc1,foxc1)、跨膜及卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域1(transmembraneandcoiled-coildomains1,tmco1)、ph結(jié)構(gòu)域a7(pleckstrinhomologydomaincontaininga7,plekha7)、視神經(jīng)蛋白(optineurin,optn)和整合素亞基β5(integrinsubunitbeta5,itgb5)。在青光眼患者房水中，與這些mrnas表達(dá)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)大于0.9并且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率小于0.05的lncrnas有10種。

實(shí)施例3

我們利用qrt-pcr在青光眼及年齡相關(guān)白內(nèi)障患者房水中驗(yàn)證實(shí)施例2中的10種lncrnas中，7種lncrnas在兩類房水中的差異表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，3種lncrnas在兩類房水中的差異表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然后選取差異表達(dá)量最顯著的3種t267384、enst00000607393和t342877，進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

實(shí)施例4

我們運(yùn)用qrt-pcr檢測方法驗(yàn)證實(shí)施例3中差異最顯著的3種lncrnas分子在房水、虹膜組織和血清中的表達(dá)水平，并分析其在青光眼患者和正常人中表達(dá)量的差異。

4.1材料與試劑

4.1.1主要儀器

常用離心機(jī)及低溫離心機(jī)購自eppendorf公司；高速離心機(jī)購自beckman公司；real-timepcr儀器購自abi公司；移液器和電動移液槍購自eppendorf公司；q5000購自quawelltechnology公司；制冰機(jī)購自sanyan公司。

4.1.2材料與試劑

不同型號的離心管及pcr管均購自axygen公司；depc水購自鼎國昌盛公司；trizol購自invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒均購自roche公司。

4.1.3試劑配置

各種免疫印跡所用試劑根據(jù)《分子克隆(第三版)》中提供的方法配置。

4.2方法

4.2.1房水、血清及虹膜樣本準(zhǔn)備

房水樣本按1.2.1所述步驟準(zhǔn)備。血清樣本取自青光眼患者組及健康對照組人群，其中青光眼患者的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)同1.2.1所述，對照組血清取自與青光眼組患者年齡與性別匹配的健康人群。虹膜樣本取自青光眼患者組及對照組，其中青光眼患者的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)同1.2.1所述，對照組虹膜樣本取自與青光眼患者年齡與性別匹配的湘雅二醫(yī)院角膜捐贈自愿者的虹膜組織。

4.2.2rna提取

0.1毫升房水或虹膜組織加入0.5毫升trizol試劑，劇烈震蕩后加入0.1毫升氯仿。而后經(jīng)離心、沉淀及75％乙醇清洗后溶于20微升dpec水，經(jīng)q5000儀器測量各孔rna濃度。外周靜脈血靜置30分鐘后放入離心機(jī)中，在3200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心10分鐘,使用滅菌的移液管取上層血清，然經(jīng)由上述同樣步驟提取rna。

4.2.3qrt-pcr

根據(jù)生廠商說明書首先依賴反轉(zhuǎn)錄酶將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，然后用pcr方法擴(kuò)增cdna，通過測定熒光強(qiáng)度信號實(shí)時(shí)檢測定量擴(kuò)增的產(chǎn)物量。

4.2.2數(shù)據(jù)分析

采用spss19.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以中位數(shù)±四分位數(shù)間距表示，青光眼/白內(nèi)障代表兩組中位數(shù)比值，比較進(jìn)行mann-whitneyu檢驗(yàn)。p值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.3結(jié)果

為進(jìn)一步擴(kuò)大房水樣本量驗(yàn)證相關(guān)lncrnas的表達(dá)水平并且探究特定lncrnas在青光眼患者血清及虹膜中的表達(dá)量，我們利用qrt-pcr檢測60個(gè)房水樣本(30個(gè)青光眼患者房水樣本，30個(gè)年齡與性別匹配的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水標(biāo)本)、50個(gè)虹膜組織(40個(gè)青光眼患者虹膜組織樣本，10個(gè)年齡與性別匹配的角膜捐贈自愿者的虹膜組織)和158個(gè)血清樣本(103個(gè)青光眼患者血清樣本，55個(gè)年齡與性別匹配的健康人群血清樣本)中t267384、enst00000607393和t342877表達(dá)水平。結(jié)果表明，在兩類房水樣本中，三種lncrnas的表達(dá)量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其在青光眼患者房水中表達(dá)量依次為在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水中表達(dá)量的4.4036、2.1467和2.9692倍；在兩類虹膜組織中enst00000607393的表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其在青光眼患者虹膜組織中表達(dá)量為在對照組虹膜組織中表達(dá)量的3.3436倍，而t267384和t342877的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在兩類血清樣本中，t267384及enst00000607393的表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其在青光眼患者血清中表達(dá)量依次為在對照組血清中表達(dá)量的1.2878和1.5301倍，而t342877的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1,2,3)(圖4,5,6)。為進(jìn)一步了解這三種lncrnas在不同種組織中診斷青光眼的有效性，我們利用所得數(shù)據(jù)繪制受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,roc)曲線(圖7)。發(fā)現(xiàn)t267384、enst00000607393和t342877在房水樣本中診斷青光眼的roc曲線下面積分別為0.998、0.998和0.983。enst00000607393在虹膜組織中診斷青光眼的roc曲線下面積為0.793；t267384和enst00000607393在血清樣本中診斷青光眼的roc曲線下面積分別為0.620和0.638。當(dāng)t267384、enst00000607393和t342877在房水中的診斷值設(shè)為1.5437、1.1485和2.1052時(shí)，其診斷的敏感性/特異性依次為0.967/0.967、0.967/0.967和0.967/0.900；當(dāng)enst00000607393在虹膜組織中的診斷值設(shè)為0.2470時(shí)，其診斷的敏感性/特異性為0.700/0.700；當(dāng)t267384和enst00000607393在血清中的診斷值設(shè)為0.7191和0.8376時(shí)，其診斷的敏感性/特異性依次為0.612/0.600和0.680/0.600。

表13種lncrnas在房水中的表達(dá)量

表23種lncrnas在虹膜組織中的表達(dá)量

表33種lncrnas在血清中的表達(dá)量

表43種lncrnas在不同組織中診斷的敏感性和特異性

sequencelisting

<110>中南大學(xué)

<120>青光眼診斷分子標(biāo)記物lncrnast342877、試劑盒及應(yīng)用

<130>無

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2541

<212>dna

<213>lncrna：t342877的序列

<400>1

gccggcccccgaggcccacgccctccaactttccagaatgtggggtggggggccgggggc60

agcccttctcagtagggactgggacccctgagtctcaagggcctgggcttagctctctgc120

ggagccccgtgagccggaagcatggaggaggggaggaaatgtccatctgcacggggccca180

ctgggcctgcagacaggggaagaaaaataaagcaggtgtcgaaggggcctcctgaaccaa240

gagaaaacagcgcctgcctgggagaaatgacaaatcacagctggcggatcaatctgcgta300

tgcacagcccttccccaagcccacgccgagcagcaggaaccgggaccccggccccaggct360

gggccctcccagcctctctttccagcctctcctgcagaggctgagcagggcctccgtgcc420

ccccacccagccctgactcctcagcagggaggagcaaggtgtttgtctgtatttggaaca480

cagggcaagagggtgcagagggagcctccgaacatctgcctaggactctggatgaatcag540

aaggaaaggcaccagttaacctcttgatctcacatccagccatccagagctgagtctgtg600

catatggaggggttcaaatgcactgaaagtgcattttcgtcacctgggcaaggtgtgtca660

cacctgtaatcccagcactttgggaggccaagaaaggaagattgcttgaggccaggagtt720

caacatcaacctgggcaaaatagtgagaccctgcctttataaaaatttttaaaaattagc780

tcagtgtggtggtgcgcctgtagtcccagttacttgggaggctgaggcaggaggattgct840

tgaacccaggagcccaggctgtagtgagccatgaacatgatcacaccactgcactccagc900

ctgggcaacagagtgagaccttgtctcttaaaacaacaactgggccgggcgcggtggctc960

atgcctgtaatcctggtcaggggttcaagaccagcctgaccaacatggtgaaaccctgtc1020

tctactaaaaaatacaaaaattagccaggcatggtggcacgtgccctgtaataccagcta1080

ctcaggaggctgaggcaggagaattgcttgaacctgggaggcagaggttgcagtgagctg1140

agatcatgccattgcactccagcttgggtgacagagcaagactctgcctcaaaaaacaac1200

aacaacaacaacaaaaaaccccaaagaaaacccaaaaaatgcattttgggacctgtgggt1260

tcaagggaagggagtgcggtcatggctactcttggaattaccagttctcctttcttactc1320

taaaggcagacagagcctcctgacatcccccttgctgtggcttcctgctggtgacatcaa1380

caggtggtacaggtacctgccgggtgatggcccaaatgccccttgtcctgcctttagcca1440

acctcactccctgatccccatcagcagctgtaatggcagctgacaagcaagagccattcc1500

tttcccagtttaatgtatttgactcctgcataggaagtaacctcatggagtacgagaaag1560

cctgagatggttcttcagcctccccagcaaagtgctcctaacagtgcagtgggatgggtg1620

tgggcacaggaagtgaggtgtcggggagccagcgcaggctagagggaagcccccagtgaa1680

gcgtttcagaagtgtcctgcttaaccctgaaagtggacttgaagtctctatgtgtaaaat1740

gccaggtgctcctacagttccccgtgtgctgggaatccacaaccatggtgtcctccggct1800

tcgctggccagcctggcacattcctgggggcggggctggaagtccttggaagagaaacta1860

ggtccttgaccagcctcctgcacatgggcacagcctggaccacactcctgaaaaccactc1920

tactagcatttgcctgctctgcgggacattcatacctgtttgttttctgccgtccagctt1980

cctaaccgccttcaaggtcccctgagaccaggagagagaaggaaatcctaacaaccccag2040

agaaggcctgcagtaggttggagcgcactagggcctgcagccacacttcttactgagagt2100

cctgctgtcaaaagcccttgtgtgttcctacctgccacactaagcatgaatgggaagtcc2160

gcagcagcagcctggacgagggagggtcaagaagaaggtgttccaactatttgctttaat2220

aaaaacgtttactagaaacactagaaagtgttttccccctcccgctccccctctccctct2280

ccctctccctctccccacggtctccctctccctctctttctacggtctccctctgatgcc2340

gagccaaagctggactgtactgctgccatctcggctcactgcaacctccctgcctgattc2400

tcctgcctcagcctgccgagtgcctgcgattgcaggcacgcaccaccacacctgactggt2460

tttcgtatttttttggtggagacgggatttcgctgtgttggccgggccggtctccagctc2520

ctaaccgcgagtgatccgcca2541

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>特異性擴(kuò)增lncrnast342877的引物序列f

<400>2

tctgcgggacattcatacct20

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>特異性擴(kuò)增lncrnast342877的引物序列r

<400>3

atttccttctctctcctggtctc23