本發(fā)明涉及基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于定量pcr技術(shù)的gstm1分型檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

gstm1為一種重要的代謝酶，參與對(duì)內(nèi)生和外源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和代謝，賦予代謝物新的生物學(xué)特性。在人類gstm1具有多態(tài)性，gstm1缺失為一種常見(jiàn)的基因型。不同gstm1基因型的個(gè)體地物質(zhì)的轉(zhuǎn)化功能存在差異。gstm1基因分型用于多種生物學(xué)性狀的研究。傳統(tǒng)的，由于gstm1缺失多態(tài)性可以通過(guò)普通pcr檢測(cè)，多采用常規(guī)基因特異性pcr，瓊脂糖電泳檢測(cè)方式確認(rèn)gstm1基因型。雖然簡(jiǎn)便，但是由于電泳操作必須開管加樣和電泳，容易造成實(shí)驗(yàn)室污染，難于在高通量下確保實(shí)驗(yàn)可靠性。同時(shí)常規(guī)pcr電泳分析法也難于發(fā)現(xiàn)雜合子基因型，影響基因性狀分析的準(zhǔn)確定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種避免有毒dna染色劑污染、提高檢測(cè)通量的基于定量pcr技術(shù)的gstm1分型檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種基于定量pcr技術(shù)的gstm1分型檢測(cè)方法，具體步驟如下：

（1）采用二代測(cè)序驗(yàn)證的人gstm1正常純合子、雜合子和缺失純合子基因組dna作為相應(yīng)對(duì)照物；

（2）采用gstm1基因特異性的引物seq1和seq2擴(kuò)增gstm1基因片段，同時(shí)在gstm1基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam；若存在gstm1基因，則gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam釋放fam熒光信號(hào)而被定量pcr儀器檢到；若沒(méi)有g(shù)stm1片段，則無(wú)gstm1擴(kuò)增，無(wú)fam熒光信號(hào)釋放；

（3）采用albumin特異性的pcr引物seq4和seq5擴(kuò)增albumin基因片段，同時(shí)在albumin基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)albumin基因特異性taqman探針seq6-vic；若存在合格樣本，則有albumin擴(kuò)增，釋放vic熒光信號(hào)，定量pcr儀器檢測(cè)到vic熒光信號(hào)；若樣本不合格，則樣本無(wú)albumin擴(kuò)增，無(wú)vic熒光信號(hào)釋放；

（4）對(duì)比擴(kuò)增fam/vic信號(hào)確認(rèn)待檢測(cè)樣本基因型；

所述引物seq1的核苷酸序列號(hào)如下：5′-cctggctgtctaaacagtcct-3′；

所述引物seq2的核苷酸序列號(hào)如下：5′-cactcactgtgcctgctcat-3′；

所述gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam的核苷酸序列號(hào)如下：

fam-5′-tgctgcccatccctgccctcacaacca-3′；

所述引物seq4的核苷酸序列號(hào)如下：5′-actccaaacctgatgcttct-3′；

所述引物seq5的核苷酸序列號(hào)如下：5′-ccttagggcagaattatcca-3′；

所述albumin基因特異性taqman探針seq6-vic的核苷酸序列號(hào)如下：

fam-5′-cagcctgttgccccttttagagttcctttt-3′。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述步驟（1）中人gstm1正常純合子、雜合子和缺失純合子基因組dna的濃度為10ng/μl。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明采用基于taqman探針的定量pcr實(shí)現(xiàn)閉管一次檢測(cè)確定gstm1基因拷貝數(shù)的目的，解決了常規(guī)gstm1檢測(cè)需要pcr后開管電泳，而容易引起實(shí)驗(yàn)室內(nèi)pcr產(chǎn)物污染，難于高通量穩(wěn)定獲得準(zhǔn)確基因分型結(jié)果的問(wèn)題，同時(shí)簡(jiǎn)化了pcr檢測(cè)方法，防止電泳檢測(cè)方法的操作過(guò)程復(fù)雜、存在潛在dna染料等環(huán)境污染危險(xiǎn)以及人為結(jié)果誤判的可能；可以有效預(yù)防pcr產(chǎn)物污染，避免有毒dna染色劑污染，可以大大簡(jiǎn)化檢測(cè)與結(jié)果分析過(guò)程，提高檢測(cè)通量；另外，本發(fā)明也建立一種定量機(jī)制，提供鑒定發(fā)現(xiàn)雜合子的技術(shù)路線。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中albumin基因擴(kuò)增和gstm1特異性片段擴(kuò)增曲線示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。

請(qǐng)參閱圖1，一種基于定量pcr技術(shù)的gstm1分型檢測(cè)方法，具體步驟如下：

（1）采用二代測(cè)序驗(yàn)證的濃度為10ng/μl的人gstm1正常純合子、雜合子和缺失純合子基因組dna作為相應(yīng)對(duì)照物；

（2）采用gstm1基因特異性的引物seq1和seq2擴(kuò)增gstm1基因片段，同時(shí)在gstm1基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam；若存在gstm1基因，則gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam釋放fam熒光信號(hào)而被定量pcr儀器檢到；若沒(méi)有g(shù)stm1片段，則無(wú)gstm1擴(kuò)增，無(wú)fam熒光信號(hào)釋放；

（3）采用albumin特異性的pcr引物seq4和seq5擴(kuò)增albumin基因片段，同時(shí)在albumin基因特異性的引物界定的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)albumin基因特異性taqman探針seq6-vic；若存在合格樣本，則有albumin擴(kuò)增，釋放vic熒光信號(hào)，定量pcr儀器檢測(cè)到vic熒光信號(hào)；若樣本不合格，則樣本無(wú)albumin擴(kuò)增，無(wú)vic熒光信號(hào)釋放；

（4）對(duì)比擴(kuò)增fam/vic信號(hào)確認(rèn)待檢測(cè)樣本基因型；

所述引物seq1的核苷酸序列號(hào)如下：5′-cctggctgtctaaacagtcct-3′；

所述引物seq2的核苷酸序列號(hào)如下：5′-cactcactgtgcctgctcat-3′；

所述gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam的核苷酸序列號(hào)如下：

fam-5′-tgctgcccatccctgccctcacaacca-3′；

所述引物seq4的核苷酸序列號(hào)如下：5′-actccaaacctgatgcttct-3′；

所述引物seq5的核苷酸序列號(hào)如下：5′-ccttagggcagaattatcca-3′；

所述albumin基因特異性taqman探針seq6-vic的核苷酸序列號(hào)如下：

fam-5′-cagcctgttgccccttttagagttcctttt-3′。

本發(fā)明基于基因特異性pcr結(jié)合taqman探針判斷基因片段存在時(shí)學(xué)界一致認(rèn)為可靠的技術(shù)方法。采用albumin基因?qū)φ諗U(kuò)增也是學(xué)界一致認(rèn)為的提示樣本質(zhì)量和相對(duì)定量的參照體系。本發(fā)明采用的技術(shù)方案采用gstm1特異性的基因擴(kuò)增和taqman探針，同時(shí)采用對(duì)照albumin基因?qū)φ諗U(kuò)增可以明確gstm1基因分型結(jié)果?；趖aqman探針定量pcr方法不需要開管電泳，可以有效預(yù)防pcr產(chǎn)物污染，避免有毒dna染色劑污染，可以大大簡(jiǎn)化檢測(cè)與結(jié)果分析過(guò)程，提高檢測(cè)通量。

實(shí)施例1

（1）測(cè)試用正常人基因組dna制備：采取正常人口腔咽拭子，chlex100抽提制備，正常人基因組dna濃度稀釋到10ng/μl；

（2）pcr特異性引物和探針設(shè)計(jì)合成：根據(jù)人gstm1基因序列設(shè)計(jì)合成基因特異性引物seq1，seq2和gstm1特異性taqman基因探針標(biāo)記fam；依據(jù)人albumin基因設(shè)計(jì)內(nèi)參基因特異性pcr引物seq4，seq5和探針seq6標(biāo)記vic；

（3）gstm1定量pcr檢測(cè)：

1）引物探針混合物配置：

2）反應(yīng)體系：引物探針混合物1.5μl，2倍tiantoughgenotypingqpcrpremix(probe)12.5μl，標(biāo)準(zhǔn)模板1.5μl，ddh2o9.5μl。

3）定量pcr儀：abi7500

4）反應(yīng)條件：95℃、2min；95℃、15s---60℃、32s，42循環(huán)。

（4）基因驗(yàn)證結(jié)果讀取：

參見(jiàn)圖1，圖1是人gstm1正常檢測(cè)結(jié)果，albumin基因擴(kuò)增曲線，gstm1特異性片段擴(kuò)增曲線，橫坐標(biāo)是以0-42的偶數(shù)標(biāo)示的循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)是相應(yīng)的熒光信號(hào)。

檢測(cè)到vic、fam信號(hào)確定為擴(kuò)增成功；樣本fam/vic與三個(gè)對(duì)照樣本之一擴(kuò)增fam/vic比值為3-6，確定為對(duì)應(yīng)對(duì)應(yīng)基因型；無(wú)法對(duì)應(yīng)三個(gè)樣本之一或者對(duì)應(yīng)多個(gè)則實(shí)驗(yàn)失敗.

上面對(duì)本專利的較佳實(shí)施方式作了詳細(xì)說(shuō)明，但是本專利并不限于上述實(shí)施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。