本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種綠色木霉及其培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

木霉(trichodermaspp.)屬半知菌亞門(mén)，絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，粘孢菌類(lèi)，廣泛存在于土壤、空氣中，能夠生存于從熱帶到凍土地帶的多種生態(tài)環(huán)境中，是目前為止研究最多的植物生防真菌。大量研究認(rèn)為，木霉對(duì)植物病原菌具有多種拮抗機(jī)制，如競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用、酶的溶菌作用、抗生素的產(chǎn)生以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性。大多數(shù)木霉，如綠色木霉、哈茨木霉、康寧木霉、綠粘帚霉等木霉菌都具有廣譜拮抗作用，能夠拮抗的病原真菌包括立枯絲核菌、腐霉菌、疫霉菌、鐮刀菌、白絹病菌等，對(duì)幼苗立枯病、枯萎病、猝倒病、白絹病等土傳病害具有良好的防治效果。另外，木霉菌容易分離和培養(yǎng)，對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)忍耐能力，因此在植物病生物防治中占有重要地位。

專(zhuān)利zl201310372776.1公開(kāi)了一種液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)綠色木霉的方法。將綠色木霉進(jìn)行液體發(fā)酵，得到液體發(fā)酵產(chǎn)物；將液體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行固體發(fā)酵，但培養(yǎng)條件在固定溫度、濕度、無(wú)菌的環(huán)境中培養(yǎng)。zl201310286529.x公開(kāi)一種哈茨木霉固體發(fā)酵生產(chǎn)分生孢子的方法，經(jīng)菌種活化、菌種斜面培養(yǎng)、菌種液體種子制作、菌種固體種子培養(yǎng)，再采用固體發(fā)酵方法發(fā)酵產(chǎn)生分生孢子，也在固定的溫度、濕度、無(wú)菌的環(huán)境中培養(yǎng)。

目前的木霉培養(yǎng)方式主要采用固體發(fā)酵的方式，大都采用淺盤(pán)發(fā)酵且在恒溫恒濕且無(wú)菌的條件下培養(yǎng)，生產(chǎn)條件苛刻，導(dǎo)致木霉成本居高不下，限制了木霉的廣泛使用，本發(fā)明針對(duì)上述不足，開(kāi)發(fā)了一種低成本、易實(shí)施的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)上述不足，提供一種綠色木霉及其培養(yǎng)方法，該方法采用傳統(tǒng)食用菌生產(chǎn)技術(shù)生產(chǎn)綠色木霉孢子粉，工藝合理，成本低廉，易于實(shí)施，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境效益和社會(huì)效益。

本發(fā)明采用菌包式袋式發(fā)酵，僅需一次滅菌，接種后，室溫培養(yǎng)即可，且發(fā)酵水平達(dá)到恒溫恒濕發(fā)酵水平。

本發(fā)明所述的綠色木霉菌株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmccno.5611。

所述菌株為綠色木霉trichodermaviride，該菌株的16s核糖體dna即16srdna的基因序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明所述的一種綠色木霉的培養(yǎng)方法，主要包括綠色木霉菌株活化、液體菌種制備、固體發(fā)酵及干燥步驟，固體發(fā)酵采用食用菌菌包發(fā)酵方式；

所述的固體發(fā)酵具體步驟如下：

a.固體發(fā)酵原料的制備：

將固體培養(yǎng)基原料混合均勻后，加入水，充分混合均勻，裝入食用菌培養(yǎng)袋，在121-125℃的條件下滅菌2-4h，冷卻至室溫；其中，按重量比計(jì)，固體培養(yǎng)基原料：水＝1：1.2-1.5；

b.接種：

將液體菌種在無(wú)菌的條件下，接種到食用菌培養(yǎng)袋中的物料中，每包接15-40ml；

c.培養(yǎng)：

24-28℃培養(yǎng)，待2/3物料長(zhǎng)滿菌絲后，開(kāi)口，保證培養(yǎng)室的濕度60％以上，待菌包表面轉(zhuǎn)綠色后，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

所述的固體培養(yǎng)基原料為麩皮、豆粕、棉籽殼、木屑、玉米粉、磷酸鹽、硫酸鹽、鹽酸鹽中的一種或幾種混合物；所述的食用菌培養(yǎng)袋為聚丙烯或者聚乙烯材質(zhì)。

進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的綠色木霉的培養(yǎng)方法，具體步驟如下：

(1)綠色木霉菌株活化

將綠色木霉菌株置于pda培養(yǎng)基平板上，于26-30℃條件下培養(yǎng)4-7天，活化；

(2)液體菌種制備；

將活化的綠色木霉菌株轉(zhuǎn)接到pd培養(yǎng)基中，于180rpm，26-28℃培養(yǎng)24-48h，然后轉(zhuǎn)接到綠色木霉液體培養(yǎng)基中，180rpm，26-28℃培養(yǎng)24-48h；

(3)固體發(fā)酵：

將固體培養(yǎng)基原料混合均勻后，加入水，充分混合均勻，裝入食用菌培養(yǎng)袋，在121-125℃的條件下滅菌2-4h，冷卻至室溫；其中，按重量比計(jì)，固體培養(yǎng)基原料：水＝1：1.2-1.5；

將液體菌種在無(wú)菌的條件下，接種到食用菌培養(yǎng)袋的物料中，每包接15-40ml；

24-28℃培養(yǎng)，待2/3物料長(zhǎng)滿菌絲后，打孔，保證培養(yǎng)室的濕度60％以上，待菌包表面轉(zhuǎn)綠色后，繼續(xù)培養(yǎng)48h；

(4)干燥

將培養(yǎng)好的綠色木霉在室外晾曬或者50℃以下烘干，干燥后粉碎，包裝。

本發(fā)明所述的pda培養(yǎng)基為：土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15-20g，補(bǔ)充蒸餾水至1000ml，ph自然，121℃滅菌25分鐘；所述的pd培養(yǎng)基為：土豆200g，葡萄糖20g，補(bǔ)充蒸餾水至1000ml，ph自然，121℃滅菌25分鐘；所述的綠色木霉液體培養(yǎng)基為：葡萄糖0.2-0.5wt％，玉米粉0.5-3wt％，酵母浸粉0.2-1wt％，硫酸鎂0.05-0.1wt％，磷酸二氫鉀0.02-0.05wt％，加水至1000ml。

利用該方法生產(chǎn)木霉孢子制劑有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、利用該方法生產(chǎn)的木霉孢子數(shù)量高，采用食用菌包發(fā)酵方法，木霉菌絲易于充分生長(zhǎng)，發(fā)酵周期10-15天，發(fā)酵徹底，因而孢子數(shù)目較傳統(tǒng)固體發(fā)酵數(shù)量多；

2、采用菌包發(fā)酵的方式，常規(guī)環(huán)境就可以培養(yǎng)，不需要無(wú)菌的培養(yǎng)環(huán)境，降低了運(yùn)行成本，生產(chǎn)的木霉孢子粉成本低，利于產(chǎn)業(yè)化；

3、該方法可以和傳統(tǒng)的食用菌行業(yè)配套生產(chǎn)，尤其是夏天，食用菌行業(yè)淡季，通過(guò)生產(chǎn)木霉增加食用菌行業(yè)的設(shè)備利用率，增加食用菌行業(yè)的利潤(rùn)空間。

4、該方法產(chǎn)品屬于生物制劑，毒性低，田間施用后無(wú)殘留，具有良好的環(huán)境效益。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

一種綠色木霉的培養(yǎng)方法，其具體步驟為：

(1)綠色木霉菌株活化

將綠色木霉菌株置于pda培養(yǎng)基平板上，于26℃條件下培養(yǎng)4天，活化；

(2)液體菌種制備；

將活化的綠色木霉菌株轉(zhuǎn)接到pd培養(yǎng)基中，于180rpm，26℃培養(yǎng)48h；

然后轉(zhuǎn)接到綠色木霉液體培養(yǎng)基中，180rpm，28℃培養(yǎng)48h；

所述的綠色木霉液體培養(yǎng)基按重量計(jì)(w/w)為：葡萄糖0.3％，玉米粉2％，酵母浸粉0.5％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.04％，加水至1000ml；裝有上述培養(yǎng)基的三角瓶在高壓滅菌鍋中121℃滅菌30min；

具體轉(zhuǎn)接過(guò)程為：在無(wú)菌操作臺(tái)上，用10ml無(wú)菌水將經(jīng)過(guò)pd培養(yǎng)基培養(yǎng)的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有綠色木霉液體培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為1支試管菌種接種1個(gè)三角瓶；

(3)固體發(fā)酵：

固體培養(yǎng)基組成為：棉籽殼90kg，麩皮9kg，玉米粉1kg，生石灰1kg，磷酸二氫鉀0.5kg，硫酸鎂0.5kg，加水130l；

混合均勻后，物料的ph7.02，水分58.6％，采用裝袋機(jī)將入料裝入食用菌袋中，在121℃滅菌箱中滅菌2h，冷卻至室溫；

將液體菌種在無(wú)菌的條件下，接種到食用菌培養(yǎng)袋的物料中，每包接25ml；

在溫度28℃培養(yǎng)，待2/3物料長(zhǎng)滿菌絲后，打孔，保證培養(yǎng)室的濕度60％以上，待菌包表面轉(zhuǎn)綠色后，繼續(xù)培養(yǎng)48h；

(4)干燥

將培養(yǎng)好的綠色木霉45℃條件下烘干，干燥后水分6.8％，孢子數(shù)為22億/g，粉碎，包裝。

實(shí)施例2

一種綠色木霉的培養(yǎng)方法，其具體步驟為：

(1)綠色木霉菌株活化

將綠色木霉菌株置于pda培養(yǎng)基平板上，于30℃條件下培養(yǎng)4天，活化；

(2)液體菌種制備

將活化的綠色木霉菌株轉(zhuǎn)接到pd培養(yǎng)基中，于180rpm，28℃培養(yǎng)24h；

然后轉(zhuǎn)接到綠色木霉液體培養(yǎng)基中，180rpm，28℃培養(yǎng)48h；

所述的綠色木霉液體培養(yǎng)基按重量計(jì)(w/w)為：葡萄糖0.5％，玉米粉1％，酵母浸粉0.5％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.04％，加水至1000ml；裝有上述培養(yǎng)基的三角瓶在高壓滅菌鍋中121℃滅菌30min；

具體轉(zhuǎn)接過(guò)程為：在無(wú)菌操作臺(tái)上，用10ml無(wú)菌水將經(jīng)過(guò)pd培養(yǎng)基培養(yǎng)的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有綠色木霉液體培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為1支試管菌種接種1個(gè)三角瓶；

(3)固體發(fā)酵

固體培養(yǎng)基組成為：麩皮90kg，玉米粉5kg，豆粕5kg，生石灰1kg，磷酸二氫鉀0.5kg，硫酸鎂0.5kg，加水130l；

混合均勻后，物料的ph7.46，水分63.6％，采用裝袋機(jī)將入料裝入食用菌袋中，在125℃滅菌箱中滅菌4h，冷卻至室溫；

將液體菌種在無(wú)菌的條件下，接種到食用菌培養(yǎng)袋的物料中，每包接20ml；

在溫度28℃，待2/3物料長(zhǎng)滿菌絲后，打孔，保證培養(yǎng)室的濕度60％以上，待菌包表面轉(zhuǎn)綠色后，繼續(xù)培養(yǎng)48h；

(4)干燥

將培養(yǎng)好的綠色木霉45℃條件下烘干，干燥后水分6.8％，孢子數(shù)為35億/g，粉碎，包裝。

實(shí)施例3

一種綠色木霉的培養(yǎng)方法，其具體步驟為：

(1)綠色木霉菌株活化

將綠色木霉菌株置于pda培養(yǎng)基平板上，于26℃條件下培養(yǎng)7天，活化；

(2)液體菌種制備；

將活化的綠色木霉菌株轉(zhuǎn)接到pd培養(yǎng)基中，于180rpm，27℃培養(yǎng)36h；

然后轉(zhuǎn)接到綠色木霉液體培養(yǎng)基中，180rpm，28℃培養(yǎng)48h；

所述的綠色木霉液體培養(yǎng)基按重量計(jì)(w/w)為：葡萄糖0.3％，玉米粉2％，酵母浸粉0.5％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.04％，加水至1000ml；裝有上述培養(yǎng)基的三角瓶在高壓滅菌鍋中121℃滅菌30min；

具體轉(zhuǎn)接過(guò)程為：在無(wú)菌操作臺(tái)上，用10ml無(wú)菌水將經(jīng)過(guò)pd培養(yǎng)基培養(yǎng)的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有綠色木霉液體培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為1支試管菌種接種1個(gè)三角瓶；

(3)固體發(fā)酵：

固體培養(yǎng)基組成為：棉籽殼90kg，玉米粕5kg，麩皮5kg，玉米粉1kg，生石灰1kg，磷酸二氫鉀0.5kg，硫酸鎂0.5kg，加水130l；

混合均勻后，物料的ph7.12，水分59.6％，采用裝袋機(jī)將物料裝入食用菌袋中，在121℃滅菌箱中滅菌3h，冷卻至室溫；

將液體菌種在無(wú)菌的條件下，接種到食用菌培養(yǎng)袋的物料中，每包接15ml；

在溫度24℃培養(yǎng)，待2/3物料長(zhǎng)滿菌絲后，打孔，保證培養(yǎng)室的濕度60％以上，待菌包表面轉(zhuǎn)綠色后，繼續(xù)培養(yǎng)48h；

(4)干燥

將培養(yǎng)好的綠色木霉45℃條件下烘干，干燥后水分6.8％，孢子數(shù)為19億/g，粉碎，包裝。

實(shí)施例4

一種綠色木霉的培養(yǎng)方法，其具體步驟為：

(1)綠色木霉菌株活化

將綠色木霉菌株置于pda培養(yǎng)基平板上，于28℃條件下培養(yǎng)5天，活化；

(2)液體菌種制備

將活化的綠色木霉菌株轉(zhuǎn)接到pd培養(yǎng)基中，于180rpm，28℃培養(yǎng)48h；

然后轉(zhuǎn)接到綠色木霉液體培養(yǎng)基中，180rpm，28℃培養(yǎng)48h；

所述的綠色木霉液體培養(yǎng)基按重量計(jì)(w/w)為：葡萄糖0.2％，玉米粉1％，酵母浸粉0.6％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.04％，加水至1000ml；裝有上述培養(yǎng)基的三角瓶在高壓滅菌鍋中121℃滅菌30min；

具體轉(zhuǎn)接過(guò)程為：在無(wú)菌操作臺(tái)上，用10ml無(wú)菌水將經(jīng)過(guò)pd培養(yǎng)基培養(yǎng)的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有綠色木霉液體培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為1支試管菌種接種1個(gè)三角瓶；

(3)固體發(fā)酵

固體培養(yǎng)基組成為：木屑60kg，玉米芯10kg，豆粕5kg，麩皮10kg，玉米粉1kg，生石灰1kg，磷酸二氫鉀0.5kg，硫酸鎂0.5kg，加水130l；

混合均勻后，物料的ph7.12，水分60.6％，采用裝袋機(jī)將入料裝入食用菌袋中，在121℃滅菌箱中滅菌2h，冷卻至室溫；

將液體菌種在無(wú)菌的條件下，接種到食用菌培養(yǎng)袋的物料中，每包接40ml；

在溫度26℃，待2/3物料長(zhǎng)滿菌絲后，打孔，保證培養(yǎng)室的濕度60％以上，待菌包表面轉(zhuǎn)綠色后，繼續(xù)培養(yǎng)48h；

(4)干燥

將培養(yǎng)好的綠色木霉45℃條件下烘干，干燥后水分6.8％，孢子數(shù)為26億/g，粉碎，包裝。