本發(fā)明屬于靶基因片斷的快速檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種羅氏沼蝦微胞子蟲可視化快速檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

羅氏沼蝦微胞子蟲(macrobrachiumrosenbergiimicrosporidium，mrmsp)是一種嚴(yán)重影響羅氏沼蝦幼體、成蝦腸道營養(yǎng)吸收的致病性寄生蟲。其可寄生于蝦的腸道和肝臟組織，可引起腸道上皮組織損傷，進而造成羅氏沼蝦營養(yǎng)吸收不良，影響蝦體健康和生長。該病原可間接導(dǎo)致羅氏沼蝦因營養(yǎng)吸收受損而個體偏小，養(yǎng)殖產(chǎn)量低。羅氏沼蝦微胞子蟲是新近發(fā)現(xiàn)并在羅氏沼蝦苗種中流行的新病原，該病原已在我國羅氏沼蝦育苗企業(yè)大面積蔓延，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，2017年羅氏沼蝦微胞子蟲攜帶率接近50％。而現(xiàn)階段又缺乏針對羅氏沼蝦微胞子蟲的高靈敏檢測試劑盒，這已不能滿足該病原引起疾病的檢疫和預(yù)防工作。因此該羅氏沼蝦微胞子蟲檢測試劑盒的開發(fā)和檢測技術(shù)的應(yīng)用具有潛在巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種羅氏沼蝦微胞子蟲可視化快速檢測試劑盒，本發(fā)明的試劑盒特異性強，敏感性高；本發(fā)明羅氏沼蝦微胞子蟲快速檢測方法利用所述試劑盒檢測，該方法方便、靈敏、準(zhǔn)確、快速。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種用于檢測羅氏沼蝦微胞子蟲擴增用核酸引物組，該引物組包含引物mrmsp-f3、引物mrmsp-b3、引物mrmsp-fip、引物mrmsp-bip、引物mrmsp-lpf和引物mrmsp-lpb；

所述的引物mrmsp-f3的核苷酸序列如seqidno：1所示；

所述的引物mrmsp-b3的核苷酸序列如seqidno：2所示；

所述的引物mrmsp-fip的核苷酸序列如seqidno：3所示；

所述的引物mrmsp-bip的核苷酸序列如seqidno：4所示；

所述的引物mrmsp-lpf的核苷酸序列如seqidno：5所示；

所述的引物mrmsp-lpb的核苷酸序列如seqidno：6所示。

本發(fā)明還公開了一種羅氏沼蝦微胞子蟲可視化快速檢測試劑盒，包括微胞子蟲dna提取試劑和反應(yīng)試劑，所述的反應(yīng)試劑中含有上述的用于檢測羅氏沼蝦微胞子蟲擴增用核酸引物組。

進一步地，反應(yīng)試劑具體包括以下組分：

a)預(yù)反應(yīng)液：20mmph為8.8的tris-hc1、8mm硫酸鎂、15mm氯化鉀、10mm硫酸按、0.l2％tween-20、1.4mmdntp、0.4m甜菜堿、0.2μm引物mrmsp-f3、0.2μm引物mrmsp-b3、1.6μm引物mrmsp-fip、1.6μm引物mrmsp-bip、0.8μm引物mrmsp-lpf和0.8μm引物mrmsp-lpb；

b)反應(yīng)酶：每微升含8個活性單位的bst2.0dna聚合酶；

c)反應(yīng)封閉液：由礦物油或液體石蠟油組成；

d)反應(yīng)顯色液：含有10％sybrgreeni的熒光染料。

進一步地，微胞子蟲dna提取試劑：成分為60mmtris、800mmnacl、0.5％sds、1％np-40的ph8.0的裂解液。

本發(fā)明還公開了一種利用上述的羅氏沼蝦微胞子蟲的快速檢測試劑盒進行檢測的方法，包括以下步驟：

1)dna抽提：取羅氏沼蝦幼體或苗或鰓絲或肝臟組織30-80mg于2ml離心管中，采用權(quán)利要求4所述的微胞子蟲dna提取試劑進行dna提??；

2)對羅氏沼蝦微胞子蟲基因進行擴增；

3)對步驟2)中得到的擴增產(chǎn)物進行顯色檢測。

進一步地，步驟1)中的dna抽提具體為：向含有組織的2ml離心管加入權(quán)利要求4所述的微胞子蟲dna提取試劑200μl，研磨均勻后，95℃以上加熱10分鐘左右，10000rpm離心10分鐘后，上清即為提取的待檢dna模板。

進一步地，步驟2)中的對羅氏沼蝦微胞子蟲基因進行擴增具體為：

2.1)根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設(shè)置所需反應(yīng)管數(shù)n，n＝樣品數(shù)+2，其中l(wèi)管為陽性對照，l管為陰性對照；

2.2)吸取所述的預(yù)反應(yīng)液的體積為n×22μl，加入一潔凈的1.5ml離心管中，然后加入nμl反應(yīng)酶，混合均勻，1500～2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，取上清之混合液；

2.3)向設(shè)定的n個反應(yīng)管中分別加入23μl步驟6.2)得到的混合液，得到n個pcr反應(yīng)管，向上述n個pcr反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照、待檢dna模板和陽性對照各2μl；

2.4)在上述步驟2.3)得到的反應(yīng)管中再分別加入30μl反應(yīng)封閉液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；

2.5)在65℃下恒溫反應(yīng)50分鐘。

進一步地，所述陽性對照為含有羅氏沼蝦微胞子蟲基因的質(zhì)粒，所述陰性對照為無核酸去離子水。

進一步地，所述步驟3)中的顯色檢測具體為：取出經(jīng)步驟2)處理的反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入lμl反應(yīng)顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化，綠色判斷為陽性，淺黃色為陰性，觀察結(jié)束后將反應(yīng)管裝入密封袋，丟棄至特定區(qū)域。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明根據(jù)靶基因序列設(shè)計了羅氏沼蝦微胞子蟲檢測用引物組，能特異性識別靶序列上的六個獨立區(qū)域，在bst2.0dna聚合酶的作用下啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，并且只有在4條引物完全識別靶序列六個結(jié)合區(qū)的情況下才能順利進行，所以本發(fā)明的引物組在很大程度上減少了擴增反應(yīng)的背景影響，大大增強了羅氏沼蝦微胞子蟲檢測的特異性；

2)采用本發(fā)明的引物組對羅氏沼蝦微胞子蟲進行檢測，因為特異性高，所以可以根據(jù)是否擴增就能判斷目標(biāo)基因的存在與否；

3)本發(fā)明的快速診斷試劑盒是利用等溫擴增技術(shù)快速檢測羅氏沼蝦微胞子蟲，檢測靈敏度高，擴增模板僅需22拷貝；

4)本發(fā)明的快速診斷試劑盒不但反應(yīng)條件溫和，且所需儀器簡單，也不需要特殊試劑，克服了傳統(tǒng)pcr固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點；

5)本發(fā)明的快速診斷試劑盒擴增快速且高效，在不到1h即可完成擴增，且產(chǎn)率高；

6)本發(fā)明的快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dntp析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的mg²⁺結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠；

7)本發(fā)明的快速診斷試劑盒操作簡單，對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，可建立成本低廉的快速篩選體系，實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測；

8)本發(fā)明的快速診斷試劑盒建立了一套經(jīng)過優(yōu)化的等溫擴增反應(yīng)體系，不但使得羅氏沼蝦微胞子蟲定性檢測更加簡便快速、特異性高、靈敏度高，而且該試劑盒是檢測羅氏沼蝦微胞子蟲的第一個試劑盒，填補了羅氏沼蝦微胞子蟲無檢測方法的缺口，具有很高的科研和經(jīng)濟價值。

當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明引物特異性測試圖；其中，1：羅氏沼蝦微胞子蟲；2：羅氏沼蝦雙順反子病毒；3：羅氏沼蝦野田村病毒；4：羅氏沼蝦紐締病毒；5：對蝦白斑綜合征病毒；6：產(chǎn)氣腸桿菌；7：嗜水氣單胞菌；8：健康羅氏沼蝦dna陰性對照；9：羅氏沼蝦微胞子蟲基因陽性質(zhì)粒對照；

圖2是本發(fā)明靈敏性檢測圖；其中，1.2.2×10⁵copies；2.2.2×10⁴copies；3.2.2×10³copies；4.2.2×10²copies；5.2.2×10copies；6.2.2copies；7.健康羅氏沼蝦dna陰性對照。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。

實施例1羅氏沼蝦微胞子蟲可視化快速檢測試劑盒

羅氏沼蝦微胞子蟲可視化快速檢測試劑盒包括微胞子蟲dna提取試劑和反應(yīng)試劑，該試劑盒僅需常規(guī)離心機和水浴鍋就可以完成核酸提取和檢測，并且整個檢測過程僅需2小時以內(nèi)，檢測產(chǎn)物封閉觀察，不會污染環(huán)境，此外，檢測結(jié)果可以通過肉眼觀察顏色變化，就可以判斷結(jié)果，實用強。

其中，微胞子蟲dna提取試劑為成分為60mmtris、800mmnacl、0.5％質(zhì)量百分比的sds、1％體積百分比np-40的ph8.0的裂解液。

反應(yīng)試劑包括以下組分：

a)預(yù)反應(yīng)液：20mmph為8.8的tris-hc1、8mm硫酸鎂、15mm氯化鉀、10mm硫酸按、0.l2％tween-20、1.4mmdntp、0.4m甜菜堿、0.2μm引物mrmsp-f3、0.2μm引物mrmsp-b3、1.6μm引物mrmsp-fip、1.6μm引物mrmsp-bip、0.8μm引物mrmsp-lpf和0.8μm引物mrmsp-lpb；

b)反應(yīng)酶：每微升含8個活性單位的bst2.0dna聚合酶；

c)反應(yīng)封閉液：由礦物油或液體石蠟油組成；

d)反應(yīng)顯色液：含有10％sybrgreeni的熒光染料。

實施例2利用實施例1所述的羅氏沼蝦微胞子蟲的快速檢測試劑盒進行檢測的方法

(1)dna抽提：

取羅氏沼蝦幼體或苗或鰓絲或肝臟組織30-80mg于1.5ml離心管中，并向離心管加入上述微胞子蟲dna提取試劑裂解液200μl，于冰上用研磨棒研磨，研磨均勻后，95℃以上加熱10分鐘左右，10000rpm離心10分鐘后，上清即為待檢dna模板，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)羅氏沼蝦微胞子蟲基因的快速擴增：

根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目，設(shè)置所需快速反應(yīng)管數(shù)n，n＝樣品數(shù)+2，其中l(wèi)管為陽性對照(含有羅氏沼蝦微胞子蟲基因的質(zhì)粒)，l管為陰性對照(無核酸去離子水)；吸取預(yù)反應(yīng)液的體積為n×22μl，加入一潔凈的1.5ml離心管中，然后加入nμl反應(yīng)酶，混合均勻，1500～2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，向設(shè)定的n個反應(yīng)管中分別加入23μl混合液，并向n個pcr反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照、待檢dna模板和陽性對照各2μl；然后在每個反應(yīng)管中再分別加入30μl封閉液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；在65℃下恒溫反應(yīng)50分鐘。

(3)顯色檢測：

取出經(jīng)步驟(2)的反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入lμl顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化，若顯示綠色，說明樣品中含有羅氏沼蝦微胞子蟲核酸，顯示為淺黃色則無羅氏沼蝦微胞子蟲核酸。

上述預(yù)反應(yīng)液含有：20mmph為8.8的tris-hc1、8mm硫酸鎂、15mm氯化鉀、10mm硫酸按、0.l2％tween-20、1.4mmdntp、0.4m甜菜堿、0.2μm引物mrmsp-f3、0.2μm引物mrmsp-b3、1.6μm引物mrmsp-fip、1.6μm引物mrmsp-bip、0.8μm引物mrmsp-lpf和0.8μm引物mrmsp-lpb，其中所述的引物mrmsp-f3序列如seqidno：1所示；所述的引物mrmsp-b3序列如seqidno：2所示；所述的引物mrmsp-fip序列如seqidno：3所示；所述的引物mrmsp-bip序列如seqidno：4所示；所述的引物mrmsp-lpf的核苷酸序列如seqidno：5所示；所述的引物mrmsp-lpb的核苷酸序列如seqidno：6所示。

實施例3試劑盒特異性檢測

(1)dna抽提：

取羅氏沼蝦微胞子蟲陽性組織樣本30-80mg于1.5ml離心管中，并向各個離心管加入dna提取試劑裂解液200μl，于冰上用研磨棒研磨，研磨均勻后，95℃以上加熱10分鐘左右，10000rpm離心10分鐘后，上清即為待檢dna模板，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)羅氏沼蝦微胞子蟲基因的快速擴增：

設(shè)置9個快速反應(yīng)管數(shù)；吸取預(yù)反應(yīng)液的體積為9×22μl，加入一潔凈的1.5ml離心管中，然后加入9μl反應(yīng)酶，混合均勻，1500～2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，向設(shè)定的9個反應(yīng)管中分別加入23μl混合液，并向9個pcr反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照、羅氏沼蝦微胞子蟲dna模板、羅氏沼蝦雙順反子病毒核酸、羅氏沼蝦野田村病毒核酸、羅氏沼蝦紐締病毒核酸、對蝦白斑綜合征病毒核酸、產(chǎn)氣腸桿菌核酸、嗜水氣單胞菌核酸和陽性對照各2μl；然后在每個反應(yīng)管中再分別加入30μl封閉液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；在65℃下恒溫反應(yīng)50分鐘。

(3)顯色檢測：

取出經(jīng)步驟(2)的反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入lμl顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化，若顯示綠色，說明樣品中含有羅氏沼蝦微胞子蟲核酸，顯示為淺黃色則無羅氏沼蝦微胞子蟲核酸，結(jié)果見圖1，僅羅氏沼蝦微胞子蟲和羅氏沼蝦微胞子蟲基因模版擴增后顯色為陽性綠色，其它病毒或細(xì)菌顯色都為陰性淺黃色，表明對其它病毒無交叉擴增性。

實施例4試劑盒靈敏度檢測

(1)dna模板設(shè)置：

取已被定量的羅氏沼蝦微胞子蟲dna樣品進行梯度稀釋，設(shè)置微胞子蟲核酸拷貝數(shù)濃度分別為：1.1×10⁵copies/μl、1.1×10⁴copies/μl、1.1×10³copies/μl、1.1×10²copies/μl、1.1×10copies/μl和1.1copies/μl；-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)羅氏沼蝦微胞子蟲基因的快速擴增：

設(shè)置7個快速反應(yīng)管數(shù)，其中l(wèi)管為陰性對照(無核酸去離子水)；吸取預(yù)反應(yīng)液的體積為7×22μl，加入一潔凈的1.5ml離心管中，然后加入7μl反應(yīng)酶，混合均勻，1500～2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10秒，向設(shè)定的7個反應(yīng)管中分別加入23μl混合液，并向7個pcr反應(yīng)管內(nèi)按順序依次分別加入陰性對照和待檢6個稀釋度的微胞子蟲dna模板各2μl；然后在每個反應(yīng)管中再分別加入30μl封閉液，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒；在65℃下恒溫反應(yīng)50分鐘。

(3)顯色檢測：

取出經(jīng)步驟(2)的反應(yīng)管，冷卻至室溫，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入lμl顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化，若顯示綠色，說明樣品中含有羅氏沼蝦微胞子蟲核酸，顯示為淺黃色則無羅氏沼蝦微胞子蟲核酸，結(jié)果見圖2，經(jīng)real-timepcr定量后的羅氏沼蝦微胞子蟲dna系列稀釋的擴增顯色圖，當(dāng)反應(yīng)體系中加入22個微胞子蟲基因拷貝的dna，擴增顯色結(jié)果就為陽性。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>浙江省淡水水產(chǎn)研究所

<120>一種羅氏沼蝦微胞子蟲可視化快速檢測試劑盒及其檢測方法

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

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