本發(fā)明涉及光敏感靶向抗腫瘤藥物的釋放，具體涉及基于過(guò)氧化氫、光刺激的抗腫瘤藥物苯丁酸氮芥和熒光雙釋放體系的設(shè)計(jì)與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

光作為一種“取之不盡，用之不竭”的外界刺激因素，無(wú)需依賴機(jī)體內(nèi)部生理環(huán)境的變化，能夠在特定的時(shí)間和空間控制光敏感類前藥釋放出活性藥物，是藥物釋放領(lǐng)域最受青睞的刺激手段之一。近年來(lái)，制備光敏感前藥的報(bào)道越來(lái)越多，其中香豆素類光敏基團(tuán)具有易合成、易修飾、易檢測(cè)、光解速度快和明確的光解機(jī)理等優(yōu)勢(shì)，得到了廣泛的應(yīng)用。氮芥類藥物是應(yīng)用于臨床的一類廣譜性抗腫瘤藥物，對(duì)癌細(xì)胞的殺滅能力較強(qiáng)，但由于其本身藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(毒副作用大、半衰期短、選擇性差、治療效率低等)的局限，使得它在抗腫瘤的臨床應(yīng)用上受到限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述缺陷，本論文以香豆素為母核，針對(duì)腫瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的過(guò)氧化氫(h2o2)，利用其特有的反應(yīng)性能，設(shè)計(jì)光敏感部位的“開(kāi)-關(guān)”，并合成了具有靶向性的光敏感氮芥類衍生物，實(shí)現(xiàn)了抗腫瘤藥物釋放和熒光示蹤的雙重目的。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種式(cm-1)所示的化合物：

本發(fā)明提供一種式(cm-1)所示的化合物的制備方法，包括以下步驟：

將式(1-3)所示化合物溶解于dcm中，依次加入dmap，dcc，活化5～30min后得混合物，將苯丁酸氮芥溶于dcm中，再加入上述混合物中，反應(yīng)1～48小時(shí)，反應(yīng)全程在惰性氣體保護(hù)下進(jìn)行，反應(yīng)液經(jīng)分離純化，得到所述式(cm-1)所示的化合物；

進(jìn)一步，本發(fā)明所述式(1-3)所示化合物、dmap、dcc與苯丁酸氮芥物質(zhì)的量之比為1:0.1-1.5:1-2.5:1-2.2。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述dcm總體積用量以式(1-3)所示化合物物質(zhì)的量計(jì)為10～50ml/mmol。本發(fā)明所述的惰性氣體優(yōu)選為n2。

通常，本發(fā)明分離純化方法為：反應(yīng)液加入dcm后用水洗滌，取有機(jī)相用飽和氯化鈉洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋蒸除去有機(jī)溶劑得粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離，所用展開(kāi)劑為dcm(d)/meoh(m)＝15:1，收集目標(biāo)組分，干燥，獲得式(cm-1)所示化合物。

此外，本發(fā)明還提供一種式(cm-1)所示化合物在制備響應(yīng)過(guò)氧化氫殺滅腫瘤細(xì)胞的光敏感靶向抗腫瘤前藥中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，本法敏所述腫瘤細(xì)胞為子宮頸癌細(xì)胞hela、hepg2、mfc-7、f9、te-1細(xì)胞。

更進(jìn)一步，本發(fā)明所述過(guò)氧化氫以水溶液形式存在，濃度為1～200μmol/l。

再進(jìn)一步，本發(fā)明所述過(guò)氧化氫優(yōu)選為腫瘤細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫。

本發(fā)明所述dcm為二氯甲烷；dmap為4-二甲氨基吡啶；dcc為二環(huán)己基碳二亞胺。

本發(fā)明的反應(yīng)路線如下：

本發(fā)明所述式(cm-1)所示化合物，即化合物(cm-1)可作為熒光監(jiān)測(cè)光敏感靶向抗腫瘤前藥，應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞藥物釋放時(shí)的熒光監(jiān)測(cè)。所述的過(guò)氧化氫濃度的熒光檢測(cè)的方法為：以化合物(cm-1)作為熒光探針，與pbs緩沖溶液中的過(guò)氧化氫進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，測(cè)定在激發(fā)為365nm下的熒光強(qiáng)度變化，從而獲得過(guò)氧化氫濃度。

其次，以化合物(cm-1)作為熒光探針及前藥，與hela細(xì)胞進(jìn)行孵化，經(jīng)過(guò)氧化氫作用及紫外照射后，進(jìn)而完成熒光成像以跟蹤藥物的釋放過(guò)程。

此外，本發(fā)明還制備了以下化合物k1和k2以進(jìn)一步驗(yàn)證前藥cm-1的選擇性及抗腫瘤活性。

本發(fā)明所述化合物(cm-1)可作為光敏感靶向抗腫瘤前藥，應(yīng)用于光敏感靶向抗腫瘤藥物的釋放。所述的藥物釋放過(guò)程的檢測(cè)方法為：以化合物(cm-1)作為光敏感靶向抗腫瘤前藥，與pbs緩沖溶液中的過(guò)氧化氫進(jìn)行反應(yīng)，隨后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行uv光照，取不同時(shí)段反應(yīng)液進(jìn)行高效液相色譜分析，從而獲得藥物釋放過(guò)程。

其次，針對(duì)腫瘤細(xì)胞hela，hepg2給不同濃度前藥cm-1光照前后的細(xì)胞活性評(píng)價(jià)采用一種標(biāo)準(zhǔn)的mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)方法。

本發(fā)明基于香豆素光敏感的特性，成功設(shè)計(jì)合成了h2o2激活的光刺激苯丁酸氮芥前藥的釋放體系，改善了藥物苯丁酸氮芥的不良藥代動(dòng)力學(xué)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)的核磁氫譜。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)的核磁碳譜。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下加入0mm和1mm過(guò)氧化氫水溶液濃度的熒光光譜。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下的熒光強(qiáng)度與h2o2濃度之間的關(guān)系。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下與h2o2反應(yīng)的熒光強(qiáng)度與隨時(shí)間變化的關(guān)系

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下加入過(guò)氧化氫和不同生物相關(guān)活性小分子的熒光光譜。(圖(a)1.gly,2.ala,3.ser,4.cys,5.thr,6.val,7.leu,8.ile,9.met,10.phe,11.trp,12.tbhp,13.oh.,14,otbu,15.cl-,16.o2-,17.h2o2,(200μm)；圖(b)1.zn(ii),2.na(i),3.mg(ii),4.fe(iii),5.fe(ii),6.cu(ii),7.ca(ii),8.pb(ii),9.pb(0),10.cd(ii),11h2o2,(200μm).

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在不同ph值條件下加入0mm和200μm過(guò)氧化氫濃度的熒光變化。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下和過(guò)氧化氫反應(yīng)之后，在光照條件下藥物釋放的高效液相色譜圖。

圖中，cm-1u指以下物質(zhì)：

圖9為本發(fā)明實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下經(jīng)h2o2處理之后分別在光照和暗場(chǎng)下的藥物釋放情況。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)的抗hela和hepg2細(xì)胞增殖活性。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在子宮頸癌細(xì)胞(hela)中的共聚焦熒光成像效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

實(shí)施例1前藥(cm-1)的合成

將化合物1-3投入到含有dcm的三口燒瓶中，待完全溶解后，依次加入dmap(1.5當(dāng)量)，dcc(2.5當(dāng)量)，活化10min后，將2.2當(dāng)量苯丁酸氮芥溶于10mldcm并注入瓶中，反應(yīng)全程需要n2保護(hù)，反應(yīng)過(guò)夜。向瓶中加入50mldcm,水洗(7×50ml)，飽和氯化鈉洗(2×50ml)，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋蒸除去有機(jī)溶劑得粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離得到產(chǎn)物cm-1，所用展開(kāi)劑為dcm(d)/meoh(m)＝15:1，收率83％。核磁氫譜見(jiàn)圖1，核磁碳譜見(jiàn)圖2。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.85(d,j＝8.1hz,3h),7.42(dd,j＝16.4,8.4hz,6h),7.08(d,j＝8.7hz,4h),6.97–6.88(m,4h),6.68–6.60(m,4h),6.33(s,2h),5.25(d,j＝1.2hz,4h),5.16(d,j＝3.6hz,4h),3.71(t,j＝6.9hz,8h),3.63(dd,j＝10.6,3.9hz,8h),2.60(t,j＝7.5hz,4h),2.47(t,j＝7.5hz,4h),2.02–1.89(m,5h),1.36(s,22h).¹³cnmr(126mhz,cdcl3)δ172.69,161.83,160.86,155.40,149.25,144.45,138.68,135.19,133.82,130.06,129.71,126.74,126.55,124.43,113.29,112.19,110.82,110.03,102.37,83.91,77.29,77.03,76.78,70.40,60.99,53.57,40.52,33.87,33.29,26.50,24.85.

實(shí)施例2前藥(cm-1)的合成

將化合物1-3投入到含有dcm的三口燒瓶中，待完全溶解后，依次加入dmap(0.1當(dāng)量)，dcc(1當(dāng)量)，活化10min后，將1當(dāng)量苯丁酸氮芥溶于10mldcm并注入瓶中，反應(yīng)全程需要n2保護(hù)，反應(yīng)過(guò)夜。向瓶中加入50mldcm,水洗(7×50ml)，飽和氯化鈉洗(2×50ml)，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋蒸除去有機(jī)溶劑得粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離得到產(chǎn)物cm-1，所用展開(kāi)劑為dcm(d)/meoh(m)＝15:1，收率61％。

實(shí)施例3

將化合物1-2(100mg)加入到含有10mldmf的圓底燒瓶中，完全溶解，加入1.2當(dāng)量碳酸鉀固體，將1.2當(dāng)量的4-溴甲基苯溶于10mldmf中，緩慢滴加到瓶中，常溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，向瓶中加入20mldcm，水洗(7×50ml)，取有機(jī)相用飽和氯化鈉洗(2×50ml)，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋蒸除去有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離得到化合物2，所用展開(kāi)劑為d/m＝10:1，收率78％。

實(shí)施例4化合物k1的合成

將化合物2(80mg)投入到含有10mldcm的圓底燒瓶中，待完全溶解后，依次加入0.2當(dāng)量dmap，1.2當(dāng)量dcc，活化10min后，將1.2倍當(dāng)量苯丁酸氮芥溶于dcm并注入瓶中，反應(yīng)過(guò)夜。向瓶中加入dcm，水洗(7×50ml)，飽和氯化鈉洗(2×50ml)，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋蒸除去有機(jī)溶劑得粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離得到產(chǎn)物k1，所用展開(kāi)劑為dcm(d)/meoh(m)＝15:1，收率91％。

實(shí)施例5化合物3的合成

將化合物1-2(100mg)加入到含有20mldmf的圓底燒瓶中，完全溶解，加入1.2當(dāng)量碳酸鉀固體，將化合物4溶于10mldmf中，緩慢滴加到瓶中，常溫反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，向瓶中加入20mldcm，水洗(7×50ml)，取有機(jī)相用飽和氯化鈉洗(2×50ml)，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋蒸除去有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離得到化合物3，所用展開(kāi)劑為d/m＝10:1，收率38％。

實(shí)施例6化合物k2的合成

將化合物3(100mg)投入到含有10mldcm的圓底燒瓶中，待完全溶解后，依次加入0.2當(dāng)量dmap，1.2當(dāng)量dcc，活化10min后，將1.2倍當(dāng)量苯丁酸氮芥溶于dcm并注入瓶中，反應(yīng)過(guò)夜。向瓶中加入dcm，水洗(7×50ml)，飽和氯化鈉洗(2×50ml)，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋蒸除去有機(jī)溶劑得粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析分離得到產(chǎn)物k2，所用展開(kāi)劑為dcm(d)/meoh(m)＝15:1，收率22％。

實(shí)施例7實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下加入0mm和1mm過(guò)氧化氫水溶液濃度的熒光光譜檢測(cè)。

在1.5ml離心管中分兩組，每組設(shè)置三個(gè)平行，其中一組含有5.0μm前藥(cm-1)，20μl(1mm)h2o2最終體系體積為400μl，另一組含有5.0μm前藥(cm-1)，20μlh2o最終體系體積為400μl，在37℃水浴搖床反應(yīng)1h。用96孔板通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在波長(zhǎng)460nm處，加入化合物(cm-1)和h2o2的實(shí)驗(yàn)組的熒光值比僅加入化合物(cm-1)的對(duì)照組熒光值高出15倍左右，證明化合物(cm-1)的硼酸酯基團(tuán)是可以被h2o2氧化，隨后快速發(fā)生水解，生成激活型的光敏感前藥，因而釋放出熒光,如圖3所示。

實(shí)施例8實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下的熒光強(qiáng)度與h2o2濃度之間的關(guān)系檢測(cè)。

將化合物(cm-1)與不同濃度的h2o2在37℃水浴搖床下反應(yīng)30min后，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化。與此同時(shí)，將等量的超純水與化合物(cm-1)在同等條件下反應(yīng)30min，作為空白對(duì)照組。從圖4中可以看出，當(dāng)h2o2濃度在0-140μm的范圍內(nèi)時(shí)，(cm-1)在460nm處的熒光強(qiáng)度隨h2o2濃度的增加而增強(qiáng)；當(dāng)h2o2濃度為140μm時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，增強(qiáng)15倍左右。

實(shí)施例9實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下與h2o2反應(yīng)的熒光強(qiáng)度與隨時(shí)間變化的關(guān)系檢測(cè)。

將化合物(cm-1)和200μmh2o2的反應(yīng)液置于37℃水浴搖床中，反應(yīng)不同時(shí)間，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化。與此同時(shí)，將等量的超純水與化合物(cm-1)在同等條件下反應(yīng)不同時(shí)間，作為空白對(duì)照組。從圖5中可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在0-10min的過(guò)程中，波長(zhǎng)為460nm處的熒光值隨時(shí)間的增加不斷變高，在20min時(shí)熒光值達(dá)到最大。

實(shí)施例10實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下加入過(guò)氧化氫和不同生物相關(guān)活性小分子的熒光光譜。

將前藥(cm-1)(5.0μm)和不同氧負(fù)離子、氨基酸以及金屬離子(200μm)反應(yīng)，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置三組平行組，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)其波長(zhǎng)為460nm時(shí)的熒光強(qiáng)度。從圖6a)和b)中可以發(fā)現(xiàn)，化合物(cm-1)對(duì)h2o2具有優(yōu)異的專一性，除了和h2o2會(huì)發(fā)生作用外，其它氧負(fù)離子和氨基酸以及金屬離子并不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生熒光。

實(shí)施例11實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在不同ph值條件下加入0mm和200μm過(guò)氧化氫濃度的熒光光譜檢測(cè)。

將5.0μl的化合物(cm-1)(最終濃度為5.0μm)和5.0μlh2o2(最終濃度為200μm)加入到不同ph的pbs緩沖液(ph＝3、3.5…10.5，每組三個(gè)平行)，置于37℃水浴搖床中反應(yīng)30min；與此同時(shí)將等濃度的(cm-1)以及等體積的超純水加入到不同ph緩沖液中，作為對(duì)照組，在37℃水浴搖床中反應(yīng)30min，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度變化(圖7)。從圖中可以看出，化合物(cm-1)在ph＝6.5-7.5之間熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，說(shuō)明化合物(cm-1)在生理狀況下(ph＝7.35-7.45)，具有最佳的反應(yīng)活性。

實(shí)施例12實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下和過(guò)氧化氫反應(yīng)之后，在光照條件下藥物釋放的高效液相色譜檢測(cè)。

將化合物(cm-1)(5μl,100μm)和h2o2(5μl,20μm)加入到1mlpbs緩沖液中(ph＝7.4)，37℃水浴搖床中反應(yīng)30min后，取樣進(jìn)行高效液相色譜分析。然后將反應(yīng)液置于紫外光照射條件下繼續(xù)反應(yīng)，每隔兩分鐘分別取樣進(jìn)行，進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果如圖8所示。

實(shí)施例13實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在ph為7.4條件下經(jīng)h2o2處理之后分別在光照和暗場(chǎng)下的藥物釋放情況。

將反應(yīng)液置于光照條件下反應(yīng)5min，取樣，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，然后將反應(yīng)液置于暗場(chǎng)中反應(yīng)5min，取樣，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，如此交替進(jìn)行40min。通過(guò)計(jì)算峰面積比值變化，計(jì)算藥物釋放率(如圖9，結(jié)果表明，被h2o2激活的抗腫瘤前藥(cm-1)只有在光照條件下才能分解釋放活性藥物。為了進(jìn)一步驗(yàn)證化合物(cm-1)的穩(wěn)定性，我們將(cm-1)溶于pbs緩沖液中，置于空氣中未做任何避光措施，兩天以后發(fā)現(xiàn)該藥物的穩(wěn)定保持率高達(dá)95％以上。說(shuō)明了上鎖以后的光敏感基團(tuán)，對(duì)光穩(wěn)定。

實(shí)施例14實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)的抗hela、hepg2、mfc-7、f9、te-1細(xì)胞增殖活性

將實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)濃度梯度，每組設(shè)置3個(gè)平行(計(jì)算誤差)，采用三種不同的加藥方式：其一，將腫瘤細(xì)胞在uv照射15min后加入苯丁酸氮芥，孵育24h；其二，將腫瘤細(xì)胞在uv照射15min后加入(cm-1)，孵育24h；其三，將腫瘤細(xì)胞與(cm-1)共同孵育12h后，進(jìn)行uv照射15min,再孵育12h。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，不加入任何藥物，uv照射15min后，孵育24h。通過(guò)實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組吸光度的比值，計(jì)算出藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞存活率的影響。由圖10可以明顯看出，修飾后的化合物(cm-1)的濃度為50μm時(shí)，細(xì)胞的存活率在90％以上；當(dāng)在uv照射下，修飾后的化合物(cm-1)的濃度為12.5μm時(shí)細(xì)胞存活率(小于50％)明顯低于苯丁酸氮芥，說(shuō)明修飾后的藥物具有良好的靶向性。

實(shí)施例14實(shí)施例1制得的前藥(cm-1)在子宮頸癌細(xì)胞(hela)中的共聚焦熒光成像效果圖。

由于在h2o2作用及光照后所釋放的香豆素為強(qiáng)熒光染料，我們嘗試通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示。其中，圖a為未經(jīng)處理的對(duì)照組，圖b為加藥孵育12h后的共聚焦細(xì)胞成像圖，圖c為加藥孵育12h之后，h2o2處理30min。由圖可以看出，化合物可以被細(xì)胞攝取，并且可通過(guò)此時(shí)的細(xì)胞形態(tài)來(lái)判斷是否釋放苯丁酸氮芥。

實(shí)驗(yàn)證明，在過(guò)氧化氫濃度提高的情況下，我們能夠看到細(xì)胞中的熒光信號(hào)也在變強(qiáng)。說(shuō)明我們的物質(zhì)能夠響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化氫。