本發(fā)明涉及一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽及其制備提取方法。

背景技術(shù)：

高血壓是一種世界性的疾病，影響到大多數(shù)國(guó)家30％的成年人口。它是最常見的嚴(yán)重慢性疾病，是引發(fā)動(dòng)脈硬化，中風(fēng)，心肌梗死和終末期腎臟疾病等的重要因素。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensinconvertingenzyme,ace)是調(diào)節(jié)外周血壓和電解質(zhì)平衡的關(guān)鍵酶，它能促進(jìn)血管緊張素i高度有效的轉(zhuǎn)化為血管緊張素ii，導(dǎo)致血壓升高。ace抑制劑(angiotensinconvertingenzymeinhibitor,acei)可以抑制ace的活性，通過動(dòng)物模型和臨床實(shí)驗(yàn)已證明其可有效的降低血壓。從天然產(chǎn)物中提取的ace抑制肽以其穩(wěn)定、安全、無(wú)副作用的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)引起了廣泛的興趣，快速、高效的從天然產(chǎn)物中純化ace抑制肽將對(duì)治療高血壓有著非常重要的作用。但小分子肽所處環(huán)境復(fù)雜且濃度很低，特別是雜質(zhì)特性與目標(biāo)小分子肽性質(zhì)相似，使得小分子肽的分離純化非常困難。

傳統(tǒng)的分離方法如超濾、微濾、鹽析、透析、離子交換、電泳等操作過程復(fù)雜、分離速度慢、樣品處理量小、回收率低以及成本昂貴。另一方面，由于生物樣品中目標(biāo)小分子含量低，大量存在的生物大分子會(huì)影響小分子擴(kuò)散和競(jìng)爭(zhēng)吸附位點(diǎn)，會(huì)降低目標(biāo)小分子的純度及吸附量。因此高選擇性并高效的分離純化方法是小分子肽的重要研究方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽及其制備提取方法，本發(fā)明先利用聚乙二醇單甲醚5000將固定化金屬親和介質(zhì)(imac)進(jìn)行修飾制備限進(jìn)親和介質(zhì)這種分離介質(zhì)，限進(jìn)親和介質(zhì)具有的特異性吸附和大分子阻拒的特點(diǎn)，再利用限進(jìn)親和介質(zhì)高效快速地提取分離血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，提高了imac分離小分子肽的效率。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，其氨基酸序列為：leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg。

一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

s1.磁性二氧化硅微球的制備：取0.03～0.05gfe3o4、0.95～1.05ml正硅酸乙酯(teos)和0.08～0.12ml聚乙二醇單辛基苯基醚(tritionx-100)加入100ml乙醇/水混合液中并以50～60khz功率超聲分散8～15min，然后加入9ml濃度為25％的氨水，反應(yīng)2～3h后利用外加磁場(chǎng)分離出固體產(chǎn)品得到磁性二氧化硅微球，所述fe3o4的粒徑為10～30nm，所述乙醇/水混合液中乙醇和水的體積比為1:1；fe3o4為磁性粒子，tritionx-100為表面活性劑，使得fe3o4粒子分布均勻，氨水給反應(yīng)提供堿性環(huán)境，正硅酸乙酯在堿性條件下能夠水解生成二氧化硅，反應(yīng)結(jié)束后得到磁性二氧化硅微球；

s2.限進(jìn)親和介質(zhì)的制備：利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)將s1中的磁性二氧化硅微球進(jìn)行氨基化改性得到氨基化微球，再用環(huán)氧氯丙烷對(duì)氨基化微球進(jìn)行活化，然后用活化后的氨基化微球螯合銅離子得到螯合微球；將1～2g聚乙二醇單甲醚5000(mpeg-5000)加入裝有4～8ml二甲基亞砜(dmso)的三口瓶中，再向三口瓶中加入1.5～3ml氯仿及0.6～0.8ml乙酸酐并在35～40℃反應(yīng)12h，得到mpeg-cho；將0.2g的螯合微球溶于50～100ml乙醇/水(乙醇和水的體積比為1:1)混合溶液中，加入1g的mpeg-cho，在室溫下攪拌反應(yīng)24h后再加入0.05～0.08g還原劑nabh3，繼續(xù)反應(yīng)48h，將反應(yīng)后產(chǎn)物置于透析袋中，在蒸餾水中透析48h，最后磁性分離得到限進(jìn)親和介質(zhì)；磁性二氧化硅微球氨基化后能接枝mpeg-cho，氨基化微球與銅離子螯合使得微球獲得特異性吸附功能；

s3.將酪蛋白用胰蛋白酶和胃蛋白酶在55℃下酶解2h以上得到酶解液，然后采用超濾離心管(10kda)對(duì)酶解液進(jìn)行超濾得到濾液，將10mgs2中的限進(jìn)親和介質(zhì)加入2ml濾液中進(jìn)行吸附1～2h，然后利用外加磁場(chǎng)分離出限進(jìn)親和介質(zhì),再用0.5～1ml濃度為0.5～1mol/l的氯化銨和0.5～1ml濃度為0.5～1mol/l的氯化鈉對(duì)其洗脫0.5～1h得到洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)洗脫液得到濃縮液；酶解液超濾是為了將一部分雜質(zhì)和沒有酶解的大分子除去，使得酶解液得到純化，有利于限進(jìn)親和介質(zhì)吸附目標(biāo)小分子多肽；

s4.采用hplc對(duì)s3中所述濃縮液進(jìn)行分離，流動(dòng)相為：a相為水(1％tfa)，b相為乙腈(1％tfa)；分離程序?yàn)椋?～40min，b相乙腈體積由5％到30％，流速為0.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，分離收集到氨基酸序列為leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。

作為優(yōu)選，s2中所述氨基化微球的制備方法為：取0.2gs1中的磁性二氧化硅微球置于三口瓶中，加入200ml乙醇，2ml去離子水，然后超聲分散30min，再以400～600r/min的轉(zhuǎn)速攪拌10min，向三口瓶中逐滴加入1.8～2.2mlaptes，在72～78℃下回流8～10h，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵在瓶底吸附，傾去上清液，再加入無(wú)水乙醇，經(jīng)超聲、洗滌，最后磁性分離得到氨基化微球。

作為優(yōu)選，s2所述螯合微球的制備方法為：稱取0.15gs2中的氨基化微球，加入2.5ml濃度為0.4mol/l的naoh和2.5ml濃度為2.5mol/l環(huán)氧氯丙烷，接著加入0.9～1.1ml的dmso，在30～40℃下?lián)u床振蕩4h，然后去離子水洗滌去除未反應(yīng)的環(huán)氧氯丙烷得到環(huán)氧化微球，將制備出的環(huán)氧化微球加入20ml濃度為0.5mol/l的na2co3溶液中，再加入0.05～0.1g亞氨基二乙酸(ida)，在40～50℃下反應(yīng)8h，cu²⁺與ida發(fā)生配位反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入20ml濃度為0.05mol/l的cuso4溶液，搖床震蕩2h得到螯合微球。

作為優(yōu)選，所述胰蛋白酶和胃蛋白酶的質(zhì)量比為1：1，所述胰蛋白酶與酪蛋白的質(zhì)量比為1:60～100。

作為優(yōu)選，所述限進(jìn)親和介質(zhì)的cu²⁺螯合密度不低于50μmol/g，保障限進(jìn)親和介質(zhì)對(duì)小分子肽特異性吸附性能；mpeg-5000的接枝率為10％～50％，接枝率太低無(wú)法形成體積排阻效應(yīng)，接枝率過高則會(huì)不利于小分子肽的吸附。

本發(fā)明提供所述血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽在制備減緩高血壓癥狀的功能食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明制備的限進(jìn)親和介質(zhì)能特異性吸附小分子多肽的同時(shí)阻拒大分子雜蛋白的吸附，相對(duì)于imac其活性組分的含量提高20％～30％。利用制備的限進(jìn)親和介質(zhì)快速的從酪蛋白酶解液中分離純化的ace抑制肽具有良好的ace抑制效果。本發(fā)明制備的限進(jìn)親和介質(zhì)非常適用于從復(fù)雜的生物基質(zhì)樣品中快速、有效的分離出小分子活性物，提高分離效果。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中酪蛋白酶解液(a)、親和介質(zhì)洗脫液(b)和限進(jìn)親和介質(zhì)洗脫液(c)的凝膠色譜圖。測(cè)試條件：色譜柱：shodexptoteninkw-802.5，檢測(cè)器：dad二極管陣列檢測(cè)器，流動(dòng)相：0.01mpbs緩沖液(ph＝7)，檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm，流速：0.5ml/min；

圖2為實(shí)施例1中酪蛋白酶解液(a)、親和介質(zhì)洗脫液(b)和限進(jìn)親和介質(zhì)洗脫液(c)的高效液相色譜圖。測(cè)試條件：色譜柱：agilentsb-c18，檢測(cè)器：dad二極管陣列檢測(cè)器，流動(dòng)相：a相：水(0.1％tfa)，b相：乙腈(0.1％tfa)，流動(dòng)相：5％～30％b相(0～40min)，流速：0.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；

圖3為實(shí)施例1中限進(jìn)親和介質(zhì)從酪蛋白酶解液中純化的多肽leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

參照附圖對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施例做進(jìn)一步說明。

本發(fā)明的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的氨基酸序列為：leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg。

實(shí)施例1

一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備提取方法，包括以下步驟：

(1)磁性二氧化硅微球的制備：取0.03g平均粒徑為10nm的fe3o4、1ml正硅酸乙酯(teos)和0.1ml聚乙二醇單辛基苯基醚(tritionx-100)加入100ml乙醇/水混合液(乙醇和水的體積比為1：1)中并以50khz功率超聲分散10min，然后加入9ml濃度為25％的氨水，反應(yīng)2h后利用外加磁場(chǎng)分離出固體產(chǎn)品得到磁性二氧化硅微球；

(2)氨基化微球的制備：取0.2g(1)中制備的磁性二氧化硅微球置于三口瓶中，加入200ml乙醇，2ml去離子水，然后超聲分散30min，再以500r/min的轉(zhuǎn)速攪拌10min，向三口瓶中逐滴加入2mlaptes，在75℃下回流8h，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵在瓶底吸附，傾去上清液，再加入無(wú)水乙醇，經(jīng)超聲、洗滌，磁性分離得到氨基化微球；

(3)螯合微球的制備：稱取0.15g(2)中制備的氨基化微球，加入2.5ml濃度為0.4mol/l的naoh和2.5ml濃度為2.5mol/l環(huán)氧氯丙烷，接著加入1ml的dmso，在30℃下?lián)u床振蕩4h，然后去離子水洗滌得到環(huán)氧化微球，將制備出的環(huán)氧化微球加入20ml濃度為0.5mol/l的na2co3溶液中，再加入0.05g亞氨基二乙酸(ida)，在50℃下反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后加入20ml濃度為0.05mol/l的cuso4溶液，搖床震蕩2h得到螯合微球；

(4)限進(jìn)親和介質(zhì)的制備：將1g聚乙二醇單甲醚5000(mpeg-5000)加入裝有4ml二甲基亞砜(dmso)的三口瓶中，再向三口瓶中加入1.5ml氯仿及0.6ml乙酸酐并在40℃反應(yīng)12h，得到mpeg-cho；將0.2g(3)中制備的的螯合微球溶于50ml乙醇/水(乙醇和水的體積比為1:1)混合溶液中，加入1g的mpeg-cho，在室溫下攪拌反應(yīng)24h后再加入0.05g還原劑nabh3，繼續(xù)反應(yīng)48h，將反應(yīng)后產(chǎn)物置于透析袋中，在蒸餾水中透析48h，最后磁性分離得到限進(jìn)親和介質(zhì)。

(5)將60g酪蛋白用1g胰蛋白酶和1g胃蛋白酶在55℃下酶解2h以上得到酶解液，然后采用超濾離心管(10kda)對(duì)酶解液進(jìn)行超濾得到濾液，將10mg(4)中制備的限進(jìn)親和介質(zhì)加入2ml濾液中進(jìn)行吸附2h，然后利用外加磁場(chǎng)分離出限進(jìn)親和介質(zhì),再用0.5ml濃度為0.5mol/l的氯化銨和0.5ml濃度為0.5mol/l的氯化鈉對(duì)其洗脫1h得到洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)洗脫液得到濃縮液；

(6)采用hplc對(duì)(5)中濃縮液進(jìn)行分離，流動(dòng)相為：a相為水(1％tfa)，b相為乙腈(1％tfa)；分離程序?yàn)椋?～40min，b相乙腈體積由5％到30％，流速為0.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，分離收集到氨基酸序列為leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。

所述限進(jìn)親和介質(zhì)的cu²⁺螯合密度為52μmol/g，mpeg-5000的接枝率為10.3％。

實(shí)施例2

一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備提取方法，包括以下步驟：

(1)磁性二氧化硅微球的制備：取0.04g平均粒徑為15nm的fe3o4、1.05ml正硅酸乙酯(teos)和0.12ml聚乙二醇單辛基苯基醚(tritionx-100)加入100ml乙醇/水混合液(乙醇和水的體積比為1：1)中并以60khz功率超聲分散15min，然后加入9ml濃度為25％的氨水，反應(yīng)3h后利用外加磁場(chǎng)分離出固體產(chǎn)品得到磁性二氧化硅微球；

(2)氨基化微球的制備：取0.2g(1)中制備的磁性二氧化硅微球置于三口瓶中，加入200ml乙醇，2ml去離子水，然后超聲分散30min，再以400r/min的轉(zhuǎn)速攪拌10min，向三口瓶中逐滴加入1.8mlaptes，在72℃下回流10h，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵在瓶底吸附，傾去上清液，再加入無(wú)水乙醇，經(jīng)超聲、洗滌，磁性分離得到氨基化微球；

(3)螯合微球的制備：稱取0.15g(2)中制備的氨基化微球，加入2.5ml濃度為0.4mol/l的naoh和2.5ml濃度為2.5mol/l環(huán)氧氯丙烷，接著加入0.9ml的dmso，在40℃下?lián)u床振蕩4h，然后去離子水洗滌得到環(huán)氧化微球，將制備出的環(huán)氧化微球加入20ml濃度為0.5mol/l的na2co3溶液中，再加入0.08g亞氨基二乙酸(ida)，在40℃下反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后加入20ml濃度為0.05mol/l的cuso4溶液，搖床震蕩2h得到螯合微球；

(4)限進(jìn)親和介質(zhì)的制備：將2g聚乙二醇單甲醚5000(mpeg-5000)加入裝有8ml二甲基亞砜(dmso)的三口瓶中，再向三口瓶中加入2.8ml氯仿及0.8ml乙酸酐并在38℃反應(yīng)12h，得到mpeg-cho；將0.2g(3)中制備的的螯合微球溶于100ml乙醇/水(乙醇和水的體積比為1:1)混合溶液中，加入1g的mpeg-cho，在室溫下攪拌反應(yīng)24h后再加入0.08g還原劑nabh3，繼續(xù)反應(yīng)48h，將反應(yīng)后產(chǎn)物置于透析袋中，在蒸餾水中透析48h，最后磁性分離得到限進(jìn)親和介質(zhì)。

(5)將80g酪蛋白用1g胰蛋白酶和1g胃蛋白酶在55℃下酶解2h以上得到酶解液，然后采用超濾離心管(10kda)對(duì)酶解液進(jìn)行超濾得到濾液，將10mg(4)中制備的限進(jìn)親和介質(zhì)加入2ml濾液中進(jìn)行吸附1.5h，然后利用外加磁場(chǎng)分離出限進(jìn)親和介質(zhì),再用1ml濃度為1mol/l的氯化銨和1ml濃度為1mol/l的氯化鈉對(duì)其洗脫0.5h得到洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)洗脫液得到濃縮液；

(6)采用hplc對(duì)(5)中濃縮液進(jìn)行分離，流動(dòng)相為：a相為水(1％tfa)，b相為乙腈(1％tfa)；分離程序?yàn)椋?～40min，b相乙腈體積由5％到30％，流速為0.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，分離收集到氨基酸序列為leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。

所述限進(jìn)親和介質(zhì)的cu²⁺螯合密度為61μmol/g，mpeg-5000的接枝率為12.4％。

實(shí)施例3

一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備提取方法，包括以下步驟：

(1)磁性二氧化硅微球的制備：取0.05g平均粒徑為30nm的fe3o4、0.95ml正硅酸乙酯(teos)和0.08ml聚乙二醇單辛基苯基醚(tritionx-100)加入100ml乙醇/水混合液(乙醇和水的體積比為1：1)中并以55khz功率超聲分散8min，然后加入9ml濃度為25％的氨水，反應(yīng)2.5h后利用外加磁場(chǎng)分離出固體產(chǎn)品得到磁性二氧化硅微球；

(2)氨基化微球的制備：取0.2g(1)中制備的磁性二氧化硅微球置于三口瓶中，加入200ml乙醇，2ml去離子水，然后超聲分散30min，再以600r/min的轉(zhuǎn)速攪拌10min，向三口瓶中逐滴加入2.2mlaptes，在78℃下回流9h，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵在瓶底吸附，傾去上清液，再加入無(wú)水乙醇，經(jīng)超聲、洗滌，磁性分離得到氨基化微球；

(3)螯合微球的制備：稱取0.15g(2)中制備的氨基化微球，加入2.5ml濃度為0.4mol/l的naoh和2.5ml濃度為2.5mol/l環(huán)氧氯丙烷，接著加入1.1ml的dmso，在35℃下?lián)u床振蕩4h，然后去離子水洗滌得到環(huán)氧化微球，將制備出的環(huán)氧化微球加入20ml濃度為0.5mol/l的na2co3溶液中，再加入0.1g亞氨基二乙酸(ida)，在45℃下反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后加入20ml濃度為0.05mol/l的cuso4溶液，搖床震蕩2h得到螯合微球；

(4)限進(jìn)親和介質(zhì)的制備：將1.6g聚乙二醇單甲醚5000(mpeg-5000)加入裝有6ml二甲基亞砜(dmso)的三口瓶中，再向三口瓶中加入3ml氯仿及0.7ml乙酸酐并在35℃反應(yīng)12h，得到mpeg-cho；將0.2g(3)中制備的的螯合微球溶于80ml乙醇/水(乙醇和水的體積比為1:1)混合溶液中，加入1g的mpeg-cho，在室溫下攪拌反應(yīng)24h后再加入0.07g還原劑nabh3，繼續(xù)反應(yīng)48h，將反應(yīng)后產(chǎn)物置于透析袋中，在蒸餾水中透析48h，最后磁性分離得到限進(jìn)親和介質(zhì)。

(5)將100g酪蛋白用1g胰蛋白酶和1g胃蛋白酶在55℃下酶解2h以上得到酶解液，然后采用超濾離心管(10kda)對(duì)酶解液進(jìn)行超濾得到濾液，將10mg(4)中制備的限進(jìn)親和介質(zhì)加入2ml濾液中進(jìn)行吸附1h，然后利用外加磁場(chǎng)分離出限進(jìn)親和介質(zhì),再用0.7ml濃度為0.8mol/l的氯化銨和0.8ml濃度為0.7mol/l的氯化鈉對(duì)其洗脫0.6h得到洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)洗脫液得到濃縮液；

(6)采用hplc對(duì)(5)中濃縮液進(jìn)行分離，流動(dòng)相為：a相為水(1％tfa)，b相為乙腈(1％tfa)；分離程序?yàn)椋?～40min，b相乙腈體積由5％到30％，流速為0.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，分離收集到氨基酸序列為leu-leu-tyr-gln-glu-pro-val-leu-gly-pro-val-pro-arg的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。

所述限進(jìn)親和介質(zhì)的cu²⁺螯合密度為57μmol/g，mpeg-5000的接枝率為14.2％。

本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實(shí)施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明原理前提下的若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。