本發(fā)明涉及微藻及其培養(yǎng)技術(shù)，更特別地，涉及一種具有高gla含量的柵藻、其培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，pufa)是指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳長度為18-22個碳原子的直鏈脂肪酸，主要包括亞油酸(la)、γ-亞麻酸(gla)、α-亞麻酸(ala)、花生四烯酸(aa)、二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸(dha)等。在pufa中，距羧基端最遠的雙鍵在第3個碳原子上則成為ω-3(n-3)系列，如在第6個碳原子上則稱為ω-6(n-6)系列。

γ-亞麻酸(γ-linolenicacid，gla)為ω-6系列多不飽和脂肪酸，是人體的必需脂肪酸，參與到多種代謝途徑和組織結(jié)構(gòu)中，它在人體組織中存在時間很短，且含量很少。正常人從食物中攝取的亞油酸(linoleicacid，la)經(jīng)δ-6脫氫酶化為gla，進而代謝為二高-γ-亞麻酸(doom-γ-linolenicacid，dgla)，再轉(zhuǎn)變成前列腺素e1(pge1)，或經(jīng)δ-5脫氫酶轉(zhuǎn)化為花生四烯酸(arachidonicacid，aa)生成其它前列腺素(pgs)。但當人體攝取過量的飽和脂肪酸或出現(xiàn)脂肪酸代謝紊亂時，δ-6脫氫酶受到抑制，則影響亞油酸向gla的轉(zhuǎn)化，可造成體內(nèi)前列腺素缺乏，導致多種疾病產(chǎn)生。此時，需要及時補充gla來防止或治療相應(yīng)的疾病。因此，gla可在抗炎、降血脂、抗腫瘤、改善糖尿病并發(fā)癥、防治高血壓和動脈粥樣硬化、抗心腦血管疾病等方面起重要作用。

目前，在一些高等植物、藍藻和異養(yǎng)微生物中均發(fā)現(xiàn)有g(shù)la的存在。月見草(oenotherabiennisl1)種子中油脂含量為15-25％，其中g(shù)la占7-11.22％。玻璃苣(boragoofficinalisl1)種子中的油脂含量20-30％，其中g(shù)la占15-25％。螺旋藻平均油脂含量為4-7％，在鈍頂螺旋藻中g(shù)la占總脂的8-25％，極大螺旋藻中g(shù)la占總脂的24％左右。

在真菌中，被孢霉屬(mortierellaramannianavar)被認為是gla的潛在工業(yè)生產(chǎn)原料，其總脂中80％左右為不飽和脂肪酸，gla占總脂的10％左右。1985年，日本學者鈴木修利用被孢霉發(fā)酵產(chǎn)gla，發(fā)酵150h后,gla的產(chǎn)量最高達到2.9gl^-1，gla產(chǎn)率為0.464gl^-1d^-1(鈴木修,1985)。

深黃被孢霉(mortierellaisabellina)是毛霉目中具有較高經(jīng)濟價值的絲狀真菌，其菌體中油脂含量為55％-86％，油脂中g(shù)la含量為3％-11％。有研究表明，將通過選育得到的深黃被孢霉菌株，在200l發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)96h，發(fā)酵菌體干重可達到25gl^-1，菌體中油脂含量為67％，gla含量為8％，最終可獲得1.34gl^-1的gla，gla產(chǎn)率為0.335gl^-1d^-1(邢來君和張寶文,1996)。何東平等通過誘變技術(shù)得到一種深黃被孢霉的突變株，突變株在86-125h的發(fā)酵周期內(nèi)，每升發(fā)酵液生物量干重為27.5-34.1g，油脂占干重的55.9-60.3％，gla占總脂的8.5-10.3％(何東平等,2014)。

但是由真菌來源獲得的gla中含有其α異構(gòu)體，提高了生產(chǎn)和純化的成本。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明人在研究過程中發(fā)現(xiàn)了一株柵藻，該藻株在不同條件下能進行光照自養(yǎng)生長、光照混養(yǎng)生長(自養(yǎng)/異養(yǎng)混合生長)和純異養(yǎng)生長，在生長過程中能夠積累高含量的油脂，并且，gla占總脂含量的20％以上，當調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分后，gla在總脂中含量最高可達45％，因此，該藻株可用于生產(chǎn)gla。

基于以上發(fā)現(xiàn)和研究，本發(fā)明提供了一種柵藻，該藻株于2017年5月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：cctccno：m2017282。

本發(fā)明的柵藻總脂的脂肪酸主要由十六碳、油酸、亞油酸和gla組成，并且總脂中g(shù)la的含量在優(yōu)化培養(yǎng)條件下穩(wěn)定在35-45％。例如，進行3l的發(fā)酵實驗，120h后，培養(yǎng)物的細胞干重可達到19.48gl^-1，總脂含量為12.1％，總脂中g(shù)la的含量為42.42％，gla的產(chǎn)率為0.2gl^-1d^-1。因此，該藻株具有作為工業(yè)化生產(chǎn)gla原料的潛力。

本發(fā)明還提供了上述柵藻的培養(yǎng)方法，所述柵藻通過光照培養(yǎng)或異養(yǎng)培養(yǎng)。

在一個實施方案中，所述柵藻進行異養(yǎng)培養(yǎng)，所述柵藻進行異養(yǎng)培養(yǎng)，包括使用添加有碳源和氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在黑暗條件下培養(yǎng)所述柵藻的步驟。在黑暗條件下，該藻株能夠完全異養(yǎng)，生長速度比光照條件下更快。

在一個優(yōu)選實施方案中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為包含以下成分的水溶液：kh2po4，0.7gl^-1；k2hpo4，0.3gl^-1；mgso47h2o，0.3gl^-1；feso47h2o，3mgl^-1；甘氨酸，0.1gl^-1；vitaminb1，0.01mgl^-1；a5，1mll^-1。其中a5的成分為硼酸(h3bo3)2.86g/l，四水氯化錳(mncl2·4h2o)1.81g/l，七水硫酸鋅(znso4·7h2o)0.22g/l，二水鉬酸鈉(na2moo4·2h2o)0.39g/l，五水硫酸銅(cuso4·5h2o)0.08g/l，六水氯化鈷(cocl2·6h2o)0.01g/l。該基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分僅用于試驗本發(fā)明的柵藻適合的氮源和碳源的種類和含量，而非限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇任何需要的基礎(chǔ)培養(yǎng)基來培養(yǎng)本發(fā)明的柵藻,例如，還可選擇bg11培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

在一個優(yōu)選實施方案中，所述碳源為10-40gl^-1的葡萄糖。葡萄糖的添加量對該藻株初期的生長速度影響不大，但是，培養(yǎng)到96h后，添加了20-40gl^-1葡萄糖的培養(yǎng)基中，藻株仍然處于指數(shù)生長階段，使得藻株最終能夠達到更高的濃度，從而提高單位體積培養(yǎng)液中的脂肪酸產(chǎn)量。

在一個優(yōu)選實施方案中，所述氮源為尿素、硝酸鉀和/或酵母提取物。以尿素、硝酸鉀和酵母提取物中的任一種或幾種組合。適當?shù)牡从欣谠逯甑纳L。

在一個優(yōu)選實施方案中，所述氮源為1-10gl^-1尿素。與其他氮源相比，尿素更便宜。尿素的添加量在1-10gl^-1的范圍內(nèi)對總脂含量影響不大。但是，當尿素含量在4-7gl^-1的范圍內(nèi)時，gla的含量較高。

在一個優(yōu)選實施方案中，所述柵藻的培養(yǎng)溫度為25-35℃。該藻株在25-35℃下均能有良好生長，尤其在30-35℃之間，生長速度更快，狀態(tài)更好，溫度低于20℃時，藻株的生長速度顯著降低。在25-30℃的范圍內(nèi)時，gla的含量較高。

本發(fā)明還提供了上述柵藻在制備脂肪酸中的應(yīng)用。

在一個優(yōu)選實施方案中，所述脂肪酸為gla。

本發(fā)明還提供了使用上述柵藻來制備脂肪酸，尤其是gla的方法。

在一個優(yōu)選實施方案中，用于制備脂肪酸的所述柵藻通過上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到。

微生物保藏

本發(fā)明涉及的柵藻于2017年5月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號為：cctccno：m2017282。中國典型培養(yǎng)物保藏中心于2017年6月8日對該柵藻的存活性檢測完畢，結(jié)果為存活。

附圖說明

圖1為柵藻hsj296的光學顯微照片；

圖2為柵藻hsj296在不同氮源下的生長曲線；

圖3為柵藻hsj296在不同尿素濃度下的生長曲線；

圖4為柵藻hsj296在不同尿素濃度下的總脂含量；

圖5為柵藻hsj296在不同溫度下的生長曲線；

圖6為柵藻hsj296在不同溫度下的總脂含量；

圖7為柵藻hsj296在不同葡萄糖濃度下的生長曲線；

圖8為柵藻hsj296在不同葡萄糖濃度下的總脂含量；

圖9為柵藻hsj296在發(fā)酵罐中的生長曲線。

具體實施方式

以下結(jié)合實例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.藻株篩選和保藏

研究人員通過分離純化的方法從野外采集的水樣中分離得到232株綠藻，用于篩選能夠完全異養(yǎng)生長的gla含量較高的綠藻。

發(fā)明人將232株除菌純化的綠藻，接種到裝有5ml葡萄糖濃度為30gl^-1的bg11的試管中，利用控溫搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)置為30℃，轉(zhuǎn)速設(shè)置為150rpm，培養(yǎng)時間為5天。通過觀察，篩選出30株能夠完全異養(yǎng)的綠藻。將能夠異養(yǎng)培養(yǎng)的30株綠藻，分別接種到裝有120mlbg11的500ml三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如前所述。培養(yǎng)5天后，離心收集藻液，冷凍干燥至恒重，分別稱取0.1g藻粉并提取其油脂。將其油脂甲酯化，利用氣相色譜測其油脂中脂肪酸組成及各成分的相對含量。

通過以上方法篩選出gla占總脂含量最高的藻株，在培養(yǎng)條件未優(yōu)化時gla占總脂含量為25.78％。使用光學顯微鏡觀察藻細胞形態(tài)，顯示其具有柵藻屬特征(圖1)。提取藻細胞dna為模板，用18srdna通用pcr引物擴增得到18srdna，進行測序，其序列如seqidno:1所示。經(jīng)序列比對，確認其屬于柵藻屬(scenedesmus)，將其命名為柵藻hsj296(scenedesmussp.hsj296)

發(fā)明人于2017年5月24日將該藻株送至湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學校內(nèi)的典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)進行微生物保藏，保藏編號為：cctccno：m2017282。

2.柵藻hsj296培養(yǎng)條件的優(yōu)化

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：kh2po4，0.7gl^-1；k2hpo4，0.3gl^-1；mgso47h2o，0.3gl^-1；feso47h2o，3mgl^-1；甘氨酸，0.1gl^-1；vitaminb1，0.01mgl^-1；a5，1mll^-1。該基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分僅用于為柵藻hsj296提供一些必須營養(yǎng)元素，并用于試驗培養(yǎng)柵藻hsj296時需要的最佳碳源和氮源，及其濃度，而非限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)自己條件和需要使用其他基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分組合。

2.1氮源的優(yōu)化

在30℃黑暗異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)柵藻hsj296時，比較了5種氮源，即尿素、硝酸鉀、硝酸銨、甘氨酸和酵母提取物對藻株生長的影響。培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖濃度均為6gl^-1，5種氮源的濃度均為1gl^-1，振蕩培養(yǎng)120h。

結(jié)果如圖2所示，相比其他氮源，尿素最適合柵藻hsj296的生長。其次，以酵母提取物或硝酸鉀作為氮源時，柵藻hsj296生長良好。但以硝酸銨或甘氨酸作為氮源時，柵藻hsj296生長很慢。

為了進一步研究尿素對柵藻hsj296生長的影響，我們設(shè)置了1-10gl^-1范圍內(nèi)的四個尿素濃度梯度，進行藻株培養(yǎng)。柵藻hsj296在不同尿素濃度下的生長曲線如圖3所示，1-10gl^-1的尿素濃度范圍內(nèi)，藻株生長速率的差距不大，尿素濃度為4gl^-1時稍好?？傊咳鐖D4所示，尿素濃度為1、4、7和10gl^-1時，其總脂含量分別為9.83％、10.93％、10.33％和10.78％。尿素濃度為4gl^-1，其總脂含量稍高。

因此，尿素濃度為4gl^-1時，最適合柵藻hsj296的培養(yǎng)。

不同尿素濃度下柵藻hsj296總脂的脂肪酸組成如表1所示。

表1不同尿素濃度下柵藻hsj296總脂的脂肪酸組成(mol％)

2.2培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

在黑暗異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)柵藻hsj296時，基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)尿素濃度為4gl^-1，葡萄糖濃度為20gl^-1，研究了溫度對藻株生長的影響。我們設(shè)置了四個溫度梯度，振蕩培養(yǎng)120h。

柵藻hsj296在不同溫度下的生長速率如圖5所示，培養(yǎng)溫度為30℃時，柵藻hsj296的生長速率最快；在20℃和25℃時，柵藻hsj296的生長速率都較慢；在35℃時其生長狀態(tài)良好。該實驗結(jié)果證明溫度對柵藻hsj296的生長速率影響較大?？傊咳鐖D6所示，，溫度為30℃時，柵藻hsj296的總脂含量為11.43％；溫度為20℃、25℃和35℃時，總脂含量分別為10.63％、10.87％和10.93％。溫度為30℃，該藻的油脂含量為最高。該實驗結(jié)果證明，溫度對柵藻hsj296的油脂積累的影響不大。

因此，從生長速率和油脂含量兩方面考慮，30℃都為柵藻hsj296的最適培養(yǎng)溫度。

不同溫度下柵藻hsj296總脂的脂肪酸組成如表2所示。

表2不同溫度下柵藻hsj296總脂的脂肪酸組成(mol％)

2.3糖濃度優(yōu)化

葡萄糖是維持藻株異養(yǎng)生長的最常見的碳源。在探索初始葡萄糖濃度對柵藻hsj296生物量積累的影響時，我們將葡萄糖濃度梯度設(shè)置為10、20、30和40gl^-1，在黑暗異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，利用搖瓶振蕩培養(yǎng)柵藻hsj296。基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的尿素濃度為4gl^-1，培養(yǎng)溫度為30℃。當然，葡萄糖只是用作藻細胞生長的碳源的一種例子，并非用于限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)自己條件和需要使用其他碳源。

柵藻hsj296在不同的葡萄糖濃度下的生長曲線如圖7所示，在10-40gl^-1初始葡萄糖濃度范圍，在96h以內(nèi)對柵藻hsj296的生長影響不大。但初始葡萄糖為10gl^-1時，培養(yǎng)到96h以后，藻株基本不生長；而初始糖濃度為20、30和40gl^-1時，培養(yǎng)到96h以后，藻株仍呈指數(shù)期生長。

由以上數(shù)據(jù)可知，當基礎(chǔ)培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度為10gl^-1時，培養(yǎng)到96h后，培養(yǎng)基內(nèi)的葡萄糖被基本消耗，培養(yǎng)基內(nèi)缺乏碳源，藻株停止生長。培養(yǎng)120h后，藻株的產(chǎn)量分別為4.97、9.34、10.4和11.02gl^-1(圖中未顯示)。以上數(shù)據(jù)說明，在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，葡萄糖對微藻生長的影響較大。

對于總脂的積累，如圖8所示，當葡萄糖濃度在10-40gl^-1之間時，總脂含量分別為10.43％、10.22％、10.42％和10.06％，略有波動。初始葡萄糖濃度對該藻油脂的積累影響不大。

不同葡萄糖濃度下柵藻hsj296的總脂脂肪酸組成如表3所示。

表3不同葡萄糖濃度下柵藻hsj296總脂的脂肪酸組成(mol％)

根據(jù)以上實驗結(jié)果，在后續(xù)的發(fā)酵培養(yǎng)實驗中，我們可以根據(jù)發(fā)酵需要在20-40gl^-1的葡萄糖濃度范圍內(nèi)選擇合適的糖濃度，進行發(fā)酵。

3.發(fā)酵罐培養(yǎng)

利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基異養(yǎng)培養(yǎng)柵藻hsj296120h,培養(yǎng)溫度為30℃，初始葡萄糖濃度為20gl^-1，尿素濃度為4gl^-1，轉(zhuǎn)速為200rpm，不控制ph。

如圖9所示，培養(yǎng)時間在52-88h之間，細胞開始呈指數(shù)生長，第90h之后，該藻進入平臺期。在第52h，葡萄糖也開始被快速消耗，在第76小時，葡萄糖濃度下降到4gl^-1(數(shù)據(jù)未顯示)。培養(yǎng)至120h，柵藻hsj296停止生長，細胞干重達到19.48gl^-1，總脂含量為12.1％，總脂中g(shù)la的含量為42.42％。gla的產(chǎn)量可達到1gl^-1，即gla的產(chǎn)率為0.2gl^-1d^-1。

發(fā)酵罐培養(yǎng)的柵藻hsj296的總脂脂肪酸組成如表4所示。

表4發(fā)酵罐培養(yǎng)的柵藻hsj296的總脂脂肪酸組成(mol％)

通過改良微藻的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式來提高微藻的生長速率和gla的產(chǎn)量，結(jié)果顯示柵藻hsj296的最適培養(yǎng)溫度為30℃，最佳氮源為4gl^-1尿素，葡萄糖初始濃度在20-40gl^-1范圍內(nèi)都適合該藻的生長。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，柵藻hsj296總脂的脂肪酸主要由十六碳(c16:0)、油酸(c18:1)、亞油酸(c18:2)和gla組成，并且總脂中g(shù)la的含量穩(wěn)定在35-45％之間。

進行3l的發(fā)酵實驗，120h后，柵藻hsj296的細胞干重可達到19.48gl^-1，總脂含量為12.1％，總脂中g(shù)la的含量為42.42％，gla的產(chǎn)率為0.2gl^-1d^-1。將來，隨著發(fā)酵條件的進一步優(yōu)化，gla的產(chǎn)量有望獲得顯著提高。柵藻hsj296具有作為工業(yè)化生產(chǎn)gla原料的潛力。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110>中國科學院水生生物研究所

<120>一種具有高gla含量的柵藻、其培養(yǎng)方法及其應(yīng)用

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1849

<212>dna

<213>scenedesmushsj296

<400>1

gcttgcatgcctgcaggtcgacgatttgatccttctgcaggttcacctacggaaaccttg60

ttacgacttctccttcctctaggtgggagggtttaatgaacttctcggcagacctgaggt120

gttgccaccctaagctgccaatccgaacacttcaccagcacacccaatcggtaggagcga180

cgggcggtgtgtacaaagggcagggacgtaatcgacgcaagctgatgacttgcgcctact240

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tagtaaggtaccaccaaataaactataactgatttaatgagccattcgcagtttcacagt1740

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gcaggatcaaccaaatctctagaggatccccgggtaccgagctcgaatc1849