本發(fā)明屬于家禽分子標(biāo)記選擇方法，特別是蛋鴨晝夜節(jié)律行為關(guān)聯(lián)基因cry1分子標(biāo)記篩選方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

行為作為復(fù)雜的數(shù)量性狀受多基因的調(diào)控和多種環(huán)境因子的影響。在這些多種行為中，家禽的晝夜節(jié)律行為常常被人們忽視，但是卻影響歐美和國內(nèi)大型集約化養(yǎng)殖業(yè)中的家禽福利，它不僅影響家禽的產(chǎn)蛋量，對(duì)家禽的生長也有影響。研究表明，適當(dāng)?shù)墓庹諒?qiáng)度和時(shí)間使蛋禽感到舒適，能較好地發(fā)揮家禽的生產(chǎn)力,這與隱花色素基因cry1有一定的關(guān)聯(lián)。

人們過去是把光照作為環(huán)境因子來研究它是如何影響家禽的生產(chǎn)力的，很少把它與晝夜節(jié)律行為基因聯(lián)系起來，事實(shí)上，晝夜節(jié)律行為關(guān)聯(lián)基因cry1與光照是密切相關(guān)的。因此，找到cry1基因的某種基因型后把它作為一種分子標(biāo)記并應(yīng)用于蛋鴨的分子標(biāo)記輔助選擇(mas)是一項(xiàng)可能的育種途徑。近年來，有關(guān)分子標(biāo)記并應(yīng)用于育種的研究已有大量的研究報(bào)道，但涉及晝夜節(jié)律行為性狀的分子標(biāo)記挖掘與應(yīng)用報(bào)道甚少，相對(duì)于其他動(dòng)物的分子標(biāo)記挖掘與應(yīng)用還是一個(gè)新的領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種蛋鴨晝夜節(jié)律行為關(guān)聯(lián)基因cry1分子標(biāo)記的篩選方法及其應(yīng)用，以獲得一種新的蛋鴨育種途徑。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的這種蛋鴨晝夜節(jié)律行為關(guān)聯(lián)基因cry1分子標(biāo)記的篩選方法包括如下步驟：

(1)dna提?。河醚?細(xì)胞/組織基因組dna試劑盒提取dna，然后測定od值和濃度；

(2)引物設(shè)計(jì)：運(yùn)用primerprimer5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，送生物公司合成；

(3)pcr擴(kuò)增：應(yīng)用20μl反應(yīng)體系，設(shè)置pcr擴(kuò)增條件進(jìn)行pcr擴(kuò)增，取產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測；

(4)擴(kuò)增產(chǎn)物片段純化、載體連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆篩選與測序；

(5)snp突變位點(diǎn)篩查與關(guān)聯(lián)分析，確定與蛋鴨的晝夜節(jié)律行為相關(guān)聯(lián)的snp；

在分子育種過程中，用上述方法檢測到的與晝夜節(jié)律行為關(guān)聯(lián)基因cry1的突變基因型即作為分子標(biāo)記。

其中，步驟(1)中測定od值和濃度時(shí)要求od260/od280比值<1.6。

步驟(3)中pcr反應(yīng)擴(kuò)增體系10μl包括：2×taqpcrmastermix試劑5μl，ddh2o2μl，forwardprimer、20pmol/l的reverseprimer各1μl，模板dna1μl。

步驟(3)中pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s；61.4℃/63.3℃30s；72℃35s，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存；1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物。

本發(fā)明的有益效果如下：蛋鴨的晝夜節(jié)律行為除了受環(huán)境因子(光照強(qiáng)度、光照時(shí)間)的影響，還受遺傳因子的影響，為了避免過強(qiáng)光照或過弱光照給生產(chǎn)帶來不良影響，有必要對(duì)與晝夜節(jié)律行為關(guān)聯(lián)基因cry1的相關(guān)基因型進(jìn)行選擇，選擇p值小于0.01的基因型蛋鴨群體，其晝夜節(jié)律行為就表現(xiàn)正常，反之則出現(xiàn)異常行為概率就大，種群即不符合要求。應(yīng)用上述方法尋找與晝夜行為節(jié)律相關(guān)的分子標(biāo)記(基因型)并應(yīng)用與分子標(biāo)記輔助選擇(mas)，可以從根本上消除蛋鴨的異常行為(對(duì)光照不敏感或過于敏感)。本發(fā)明可以為建立節(jié)律行為性狀的分子選擇方法提供分子依據(jù)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，實(shí)施例中有關(guān)數(shù)量份數(shù)、百分比、數(shù)量比例等，若無特殊說明，均指質(zhì)量單位。

實(shí)施例1：

蛋鴨晝夜節(jié)律行為關(guān)聯(lián)基因cry1分子標(biāo)記及應(yīng)用，包含以下步驟：

1.dna提取

對(duì)需檢測的蛋鴨血樣(50份)用血液/細(xì)胞/組織基因組提取盒進(jìn)行dna提取，dna提取之后，用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用紫外分光光度計(jì)測量其od值和樣品濃度，放于-20℃冰箱保存。構(gòu)建dna池最終獲得蛋鴨混合dna池。

2.引物設(shè)計(jì)

根據(jù)genebank數(shù)據(jù)庫中登載的鴨cry1基因序列(序列號(hào)為nw_004676465.1)運(yùn)用軟件oligo6.0與primer5.0設(shè)計(jì)和篩選引物，送生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息見表1：

cry1基因pcr擴(kuò)增引物序列

3.pcr擴(kuò)增

pcr反應(yīng)基本組成：引物、酶、模板、mg2+、dntp。其反應(yīng)的好壞與循環(huán)次數(shù)、引物的特異性、時(shí)間和tm值有關(guān)。設(shè)計(jì)梯度試驗(yàn)，以獲得最適tm值。實(shí)驗(yàn)可得cry1基因最適tm值為61.4℃。

pcr反應(yīng)擴(kuò)增體系(10μl)：2×taqpcrmastermix試劑5μl，ddh2o2μl，forwardprimer、reverseprimer(20pmol/l)各1μl，模板dna1μl。

pcr反應(yīng)擴(kuò)增程序：94℃5min；94℃30s；61.4℃/63.3℃30s；72℃35s，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產(chǎn)物。

4.基因克隆、篩選與測序

基因克隆試劑盒peasy-t1cloningkit購自生物技術(shù)有限公司，克隆體系：pcr產(chǎn)物0.5-4ul、peasy-t1cloningvector1ul，輕輕混勻，室溫(20℃-37℃)反應(yīng)5min。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上?？寺∞D(zhuǎn)化具體操作步驟：加連接產(chǎn)物于50ultrans1-t1感受態(tài)細(xì)胞中(剛解凍時(shí))，輕彈混勻，冰浴20-30min；42℃水浴熱激30s，立即轉(zhuǎn)至冰浴2min；加平衡至室溫的lb培養(yǎng)基250ul，200rpm、37℃培養(yǎng)1h；取500mmiptg8ul和20mg/mlx-gal40ul混合，均勻涂抹至事先準(zhǔn)備好的平板上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min；待iptg和x-gal被吸收后，取菌液200ul均勻涂在平板上，37℃培養(yǎng)箱中過夜。

牙簽挑選白色陽性菌落至5ml含氨芐青霉素是的lb液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm振蕩培養(yǎng)6h左右。

利用sanprep柱式質(zhì)粒dna小量抽提試劑盒(購自生物工程公司)進(jìn)行重組質(zhì)粒提取，并送至生物技術(shù)公司測序。

5.snp位點(diǎn)篩查與晝夜節(jié)律行為的關(guān)聯(lián)分析

利用dnastar中的seqman軟件查看測序結(jié)果，查找snp位點(diǎn)，分析其多態(tài)性。應(yīng)用最小二乘分析法分析與晝夜節(jié)律行為的關(guān)聯(lián)，根據(jù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，找出與晝夜節(jié)律行為關(guān)系緊密的基因型。

本發(fā)明的應(yīng)用：

在分子育種過程中，用上述方法檢測到的與晝夜節(jié)律行為關(guān)聯(lián)基因cry1的突變基因型即作為分子標(biāo)記，其判斷標(biāo)準(zhǔn)為：基因型與晝夜節(jié)律行為必須顯著關(guān)聯(lián)(p<0.01)。

當(dāng)然，以上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實(shí)施方式，凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>貴州大學(xué)

<120>蛋鴨晝夜節(jié)律行為關(guān)聯(lián)基因cry1分子標(biāo)記篩選方法

<130>nm:

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<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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