本發(fā)明涉及抗腫瘤化合物及其制備方法與用途，具體而言，該抗腫瘤化合物為嘧啶類化合物，屬于醫(yī)藥
技術領域：
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背景技術：
：蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,ptks)通過控制細胞的信號傳導通路調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、凋亡等一系列生理生化過程。受體型酪氨酸激酶是一類橫跨細胞膜相對較大的激酶，其具有配體結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和起激酶作用—在磷酸化特定酪氨酸殘基并且由此影響細胞增殖的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一般人類癌癥中(如肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤)已發(fā)現(xiàn)所述激酶的異常表達。蛋白酪氨酸激酶已成為抗腫瘤藥物研究開發(fā)的重要靶點之一。表皮生長因子受體酪氨酸激酶(epidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinase，egfr)是最早發(fā)現(xiàn)的蛋白酪氨酸激酶之一，egfr的胞內(nèi)區(qū)有atp結(jié)合位點，egfr抑制劑可以競爭性與atp結(jié)合位點相結(jié)合，從而抑制egfr的磷酸化過程，阻斷下游信號的傳導，進而抑制腫瘤細胞的生長、分化和轉(zhuǎn)移(yun,etal.cancercell2007,11,217-227)。egfr作為抗腫瘤靶點的生化過程已被闡明，其晶體結(jié)構(gòu)和活性部位也已比較清楚，以此為靶點的藥物吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)等已經(jīng)應用于臨床，且隨著egfr結(jié)構(gòu)和活性關系的深入研究，許多效果更佳優(yōu)秀的egfr抑制劑(ep0566226、wo9961428、wo0051587、wo0375947、wo0132651、wo9633980、wo9630347、us7709479、us6716847、us6593333、us6251912、cn201080060451.4、cn201110191525.4等)已被發(fā)現(xiàn)。然而這些藥物不可避免地存在著抗耐藥性差的問題。研究表明：790位點的蘇氨酸到790位點的甲硫氨酸的突變(t790m)是此類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要誘因。有臨床案例數(shù)據(jù)顯示，大約有60％的患者獲得性耐藥都源于t790m位點的突變所致。因此開發(fā)抗耐藥性更強、毒性更小、活性更強的新型egfr抑制劑具有非常重要現(xiàn)實價值。azd9291(osimertinib)是口服不可逆的，t790m突變選擇性egfr抑制劑，在lovo細胞中對外顯子19位缺失的egfrl858r/t790m和egfrwt的ic50分別為11.44和493.8nm，于2015年12被美國fda批準上市(wo2013014448)用于治療egfrt790m耐藥型肺癌。co-1686(rociletinib,avl-301)是另一種不可逆的，突變選擇性egfrt790m抑制劑，在無細胞試驗中作用于egfrt790m和egfrwt的ic50分別為21.5nm和303.3nm，目前處于臨床iii期研究研究(wo2012061299)。其它如hm61713，egf816，pf-06747775，avitinib，asp8273也是進入臨床研究的新型egfr抑制劑(maetal.,j.med.chem.,2016，doi:10.1021/acs.jmedchem.5b00840.)，涉及的專利如：us20120157426、us8563568b2、cn102740847、cn102083800。黏著斑激酶(focaladhesionkinase，fak)是一種細胞內(nèi)的非受體酪氨酸激酶，fak是細胞內(nèi)一種非受體酪氨酸激酶，參與胞內(nèi)多條信號通路的傳導。fak在多種類型的腫瘤細胞中都出現(xiàn)表達量和活性上調(diào)現(xiàn)象，通過激酶依賴和非激酶依賴機制參與腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、生長和抗凋亡等多個過程，是目前研究較多的抗腫瘤靶點之一。鑒于治療癌癥的迫切需要，本領域有必要開發(fā)新型作用機制、且效果更佳良好的抗腫瘤藥物。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一個抗腫瘤化合物或其藥學上可接受的鹽，該抗腫瘤化合物具體為含嗎啡啉的嘧啶類化合物，該類化合物具有良好的抗腫瘤活性。本發(fā)明的另一目的在于提供前述抗腫瘤化合物的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供含所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物。本發(fā)明的再一目的在于提供所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學上可接受的鹽，或所述組合物的用途。為此，一方面，本發(fā)明提供一種抗腫瘤化合物或其藥學上可接受的鹽，該抗腫瘤化合物具有式(i)所示的結(jié)構(gòu)：式(i)所示結(jié)構(gòu)化合物為含嗎啡啉的嘧啶類化合物，命名為dm3001，本發(fā)明抗腫瘤活性篩選顯示，該化合物具有強的抑制非小細胞肺癌(nsclc)細胞增殖能力，顯示出比rociletinib更加優(yōu)良的抗egfrt790m活性，且能夠作用于fak激酶。作為一類結(jié)構(gòu)新穎的分子，本發(fā)明中研究化合物具有開發(fā)成新型高效egfr和fak雙靶點抑制劑的潛力，對治療相關的腫瘤疾病尤其是非小細胞肺癌、小細胞肺癌有較大的應用價值。前述式(i)所示的結(jié)構(gòu)具有如下名稱：(i)n-[1-[[5-氯-2-[[4-[(4-嗎啡啉基)甲基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺。另一方面，本發(fā)明提供前述抗腫瘤化合物的制備方法，該抗腫瘤化合物按如下路線制備：本發(fā)明所述化合物由于它們在藥物中的可能用途，式(i)所示化合物的鹽優(yōu)選藥物可接受的鹽。本發(fā)明的化合物為堿，其中所需鹽形式可以通過本領域已知的合適方法制備，包括用無機酸處理游離堿，所述無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或用有機酸處理游離堿、所述有機酸例如乙酸、三氟乙酸、馬來酸、琥珀酸、扁桃酸、富馬酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羥基乙酸、水楊酸、吡喃糖苷酸(pyranosidylacid)，例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸，α-羥基酸，例如檸檬酸或酒石酸，氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸，芳香酸，例如苯甲酸或肉桂酸，磺酸，例如p-甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。藥學上可接受的鹽的實施例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙酸鹽(propiolates)、草酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、苯基乙酸鹽、苯基丙酸鹽、苯基丁酸鹽(phenylbutrates)、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、羥基乙酸鹽、酒石酸鹽、苦杏仁酸鹽和磺酸鹽、例如二甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽和萘-2-磺酸鹽。另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其含有有效劑量的本發(fā)明所述式(i)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽，及藥用載體。本發(fā)明的藥物組合物通常含有一種本發(fā)明化合物。然而，在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有超過一種本發(fā)明的化合物。另外，本發(fā)明的藥物組合物還可任選包括一種或多種其它藥學活性化合物。本發(fā)明所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學上可接受的載體具有良好的抑制egfr表皮因子受體酪氨酸激酶的活性，因此，本發(fā)明還提供所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學上可接受的載體，或所述藥物組合物在制備egfr表皮因子受體酪氨酸激酶抑制劑中的應用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學上可接受的載體具有良好的抑制fak黏著斑激酶的活性，因此，本發(fā)明還提供所述含嗎啡啉的嘧啶類化合物或其藥學上可接受的載體，或所述藥物組合物在制備fak黏著斑激酶抑制劑中的應用。本發(fā)明還提供所述式(i)所示的化合物或其藥學上可接受的鹽，或本發(fā)明所述的藥物組合物在制備治療腫瘤的藥物中的用途。優(yōu)選地，所述腫瘤選自非小細胞肺癌、小細胞肺癌，進一步優(yōu)選非小細胞肺癌。更優(yōu)選地，所述用途主要通過抑制egfr表皮因子受體蛋白酪氨酸激酶和fak黏著斑激酶實現(xiàn)的。附圖說明圖1為不同處理組h1975，a431細胞dapi染色情況。圖2為不同處理組h1975、a431細胞ao/eb染色情況。圖3為不同處理組h1975、a431細胞劃痕和細胞遷移實驗結(jié)果。圖4為dm3001在h1975(a)和a431(b)兩種細胞中對egfr下游相關信號蛋白表達的情況。具體實施方式以下結(jié)合具體實施例進一步描述解釋本發(fā)明，但這些實施例并非意味著限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照原料或商品制造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規(guī)試劑。實施例1目標分子的制備薄層層析硅膠板使用煙臺黃海gf254或青島gf254硅膠板，薄層色譜法(tlc)使用的硅胺板采用的規(guī)格是0.15mm-0.2mm，薄層層析分離純化產(chǎn)品采用的規(guī)格是0.4mm-0.5mm。本發(fā)明使用的原料主要購自可購買自國藥集團化學試劑有限公司，北京偶合科技有限公司、阿拉丁化學試劑有限公司、達瑞化學品等公司。實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫，為20℃-30℃。本發(fā)明采用的技術方案如下：化合物(i)的合成路線.試劑及條件:(a)對硝基苯氨,dipea,1,4-二氧六環(huán),rt,2h,91％；b)4-嗎啡啉基甲基苯胺,dipea,1,4-二氧六環(huán),60℃,2h,49–72％；(c)fe-nh4cl,meoh-h2o,80℃至rt,62–85％；(d)丙烯酰氯,nahco3,丙酮,10min,43–68％。i-b的合成取i-a(23.44mmol)和dipea(4.5g,35.16mmol)于50ml二氧六環(huán)中，慢慢加入4-硝基苯胺(3.8g,23.44mmol)，升溫60℃，反應5小時后，反應完畢，冷卻，加入400ml水，析出黃白色固體，抽濾，烘干，得黃白色固體，未純化直接下一步反應。i-c的合成取i-b(23.44mmol)和三氟乙酸(4.5g,35.16mmol)于2-buoh(50ml)中，慢慢加入4-嗎啡啉基甲基苯胺(23.44mmol)，升溫100℃，反應8小時后，反應完畢，冷卻，倒入飽和碳酸氫鈉溶液中，析出固體，抽濾，水洗，烘干硅膠柱層析分離，得淺褐色固體。i-d的合成取i-c(1.9g,6.8mmol)和氯化銨(0.73g,13.6mmol)于反應瓶，加入meoh(15ml)和水(15ml)，攪拌下加入鐵粉(1.5g,27.2mmol)，升溫60℃反應2小時，趁熱抽濾，水相用乙酸乙酯萃取(100ml×3)，合并乙酸乙酯層，飽和食鹽水洗一次，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干得黃色半固體i-d。目標物(i)的合成取i-d(2.1g,9.7mmol)溶于20ml乙腈中，加入碳酸氫鈉(1.6g,19.4mmol)，和甲基哌嗪(1.2g,11.64mmol)，升溫60℃反應5小時，反應完畢后抽干溶劑，加水200ml，未析出固體，水相用乙酸乙酯萃取(100mlx3)，合并乙酸乙酯層，飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干得目標分子(i)。根據(jù)以上方法合成了目標分子，所合成目標分子的理化數(shù)據(jù)如下：(i)n-[1-[[5-氯-2-[[4-[(4-嗎啡啉基)甲基]苯基]胺]-4-嘧啶基]胺]苯基]-2-丙烯酰胺產(chǎn)率40.8％；黃白色固體。1hnmr(dmso-d6):δ10.20(s,1h),9.32(s,1h),8.96(s,1h),8.15(s,1h),7.91(s,1h),7.56(d,j＝8.4hz,3h),7.31(d,j＝6.0hz,2h),7.04(d,j＝8.4hz,2h),6.48(dd,j＝17.2,10.4hz,1h),6.27(dd,j＝16.8,2.0hz,1h),5.76(dd,j＝10.0,2.0hz,1h),3.55(br,4h),3.32(s,2h),2.29(s,4h).13cnmr(dmso-d6)δ163.6,158.2,156.7,155.3,139.8,139.7,139.6,139.3,132.4,130.6,129.4(2c),129.0,127.3,119.8,119.3(2c),115.8,104.2,66.7(2c),62.6,53.6(2c).hrms(esi)forc24h25cln6o2,[m+h]+理論計算:465.1800,實測:465.1808。目標分子成鹽的方法無機酸鹽的制備方法：取目標分子(1mmol)溶于10ml無水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加無機酸(1mmol)的5ml無水甲醇溶液，滴加完畢，于此溫度下攪拌30分鐘，然后常溫蒸除甲醇，即得目標分子的無機酸鹽。通過該方法制備了化合物i的鹽酸鹽(i-1)、氫溴酸鹽(i-2)、硫酸鹽(i-3)及磷酸鹽(i-4)；有機酸鹽的制備方法：取目標分子(1mmol)溶于10ml無水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加有機酸(1mmol)的5ml干燥乙醚，滴加完畢，于此溫度下攪拌30分鐘，然后常溫蒸除溶劑，即得目標分子的有機酸鹽。通過該方法制備了化合物i的馬來酸鹽(i-5)、琥珀酸鹽(i-6)及富馬酸鹽(i-7)。實施例2目標分子生物活性評價1、體外對受體酪氨酸激酶抑制活性測試方法制備激酶檢測緩沖液①在室溫融解激酶檢測緩沖液(kinasedetectionbuffer)，觀察是否有沉淀。②如果出現(xiàn)沉淀，就在37℃孵育激酶檢測緩沖液(kinasedetectionbuffer)15分鐘并經(jīng)常搖動，溶解沉淀?；蛘?，小心吸走上清，去除沉淀。制備激酶檢測試劑①使用前在室溫平衡激酶檢測緩沖液(kinasedetectionbuffe)和激酶檢測底物(kinasedetectionsubstrate)。②將激酶檢測緩沖液(kinasedetectionbuffer)全部倒進裝有激酶檢測底物(kinasedetectionsubstrate)的棕色瓶中，使凍干粉底物溶解，這樣就制成了激酶檢測試劑。③輕輕震蕩、渦旋或顛倒混勻，成為均質(zhì)溶液，底物應在1分鐘內(nèi)溶解。④激酶檢測試劑配好后應立即使用，或分裝存于-20℃，配好的試劑經(jīng)過幾次凍融后循環(huán)信號活性都沒有損失。制作atp轉(zhuǎn)化成adp的標準曲線①用1×激酶反應緩沖液(kinasereactionbuffer)稀釋試劑盒提供的ultrapureatp和adp，制成900μl50μmatp和500μl50μmadp。②將上一步配好的50μmatp和50μmadp溶液按表1所示在384孔板a1-a12中混合，模擬每個轉(zhuǎn)化百分比的atp和adp的濃度，混合好。表1.制備50μm系列atp+adp標準品③每孔加入5μl的adp-glotm試劑來終止激酶反應。在室溫孵育40分鐘。④每孔加入10μl激酶檢測試劑(kinasedetectionreagent)將adp轉(zhuǎn)化成atp，并引進螢光素酶和螢光素來檢測atp。⑤在室溫孵育30-60分鐘，用多功能酶標儀測量螢光并記錄螢光值。⑥繪制atp轉(zhuǎn)化成adp的標準曲線。確定激酶抑制物的ic50值①按照promega試劑盒說明書配制1×激酶反應緩沖液(kinasereactionbuffer)，2.5×50ng/μl激酶和2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。②在無酶對照孔中加入3μl1×激酶反應緩沖液(kinasereactionbuffer)，2μl2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。在陰性對照孔中加入1μl1×激酶反應緩沖液(kinasereactionbuffer)，2μl2.5×50ng/μl激酶，2μl2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。在測試孔中加入1μl5×待測藥物，2μl2.5×50ng/μl激酶，2μl2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。③混合好平板，孵育60分鐘。④每孔加入5μl的adp-glotm試劑來終止激酶反應。在室溫孵育40分鐘。⑤每孔加入10μl激酶檢測試劑(kinasedetectionreagent)將adp轉(zhuǎn)化成atp，并引進螢光素酶和螢光素來檢測atp。在室溫孵育30-60分鐘，用多功能酶標儀測量螢光并記錄螢光值。⑥結(jié)果分析，結(jié)果是表2所示。2、細胞生長實驗(mtt檢測法)細胞接種：收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度,以每孔7x103個細胞,每孔體積100μl接種到96孔板，每組設4個復孔(邊緣孔用無菌pbs填充)；細胞培養(yǎng)：細胞貼壁后，0％fbsrpmi-1640饑餓8h,對照組用10％fbsrpmi-1640培養(yǎng),，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(按實驗要求分別培養(yǎng)不同時間)；呈色：三組細胞分別于培養(yǎng)72h后加入10μlmtt溶液(5mg/ml)，4h后終止培養(yǎng)，每孔加入100μl三聯(lián)液，于搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解；比色：在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光度值(od值)，選擇570nm波長，以無細胞的即rpml-1640培養(yǎng)液空白孔調(diào)零，測各孔的吸光度值。實驗重復三次記錄結(jié)果：細胞生長抑制率＝(對照組吸光度值一實驗組吸光度值)/對照組吸光度值×100％，細胞增殖率＝(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100；繪制細胞生長曲線：以時間為橫坐標，抑制率/增殖率為縱坐標繪制細胞生長曲線。在graphpad軟件中的graphpadprism作圖軟件中針對抑制劑濃度做圖，以便由log[抑制劑]相對于反應，可變斜率模型估算出ic50。測試結(jié)果如表3所示，表2及表3顯示所獲得的化合物抗腫瘤細胞增殖中的活性效果a。表2表3a:h1975為egfrt790m突變細胞株，a431egfrwt細胞，hcc827為egfrdele746_a750突變細胞株，hbe為人正常支氣管上皮細胞.b:ic50：半數(shù)有效抑制濃度.3、細胞染色實驗3.1實驗材料和試劑h1975細胞，a431細胞，rapi1640基礎培養(yǎng)基，dmem基礎培養(yǎng)基(hyclone公司，cat:sh30022.01b)，fbs胎牛血清(gibco公司，cat:16400-044)，雙抗(北京夏斯生物科技有限公司，prospeccat:sv30010)，低速離心機(上海貝恩生物科技有限公司，cat:tdz4b-ws)，co2培養(yǎng)箱(上海博訊，cat:bc-j160s)，超凈工作臺(上海博訊型號sw-cj-2fd)，倒置熒光電子顯微鏡(leicadmi3000b)，ao/eb雙染試劑盒，dapi試劑盒(碧云天)。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)：常規(guī)擴大培養(yǎng)a431、h1975細胞，取對數(shù)生長期的細胞以2x105cells/孔的密度接種于6孔板中；3.2.2藥物處理：于次日用不同濃度的藥物(抑制劑)處理貼壁良好的細胞48小時；具體藥物及使用濃度如下表4：表43.2.3dapi染色：棄去培養(yǎng)液，用pbs洗兩次，每孔以1ml4％多聚甲醛固定15min，棄去固定液后再用pbs洗一次；加入1μg/ml的dapi染色液1ml/孔，37℃孵育5min，pbs清洗后用倒置熒光顯微鏡進行觀察、拍照。結(jié)果如圖1所示。ao-eb染色3.2.4細胞培養(yǎng)：常規(guī)擴大培養(yǎng)a431、h1975細胞，取對數(shù)生長期的細胞以2x105cells/孔的密度接種于6孔板中；3.2.5藥物處理：于次日用不同濃度的藥物(抑制劑)處理貼壁良好的細胞48小時；具體藥物及使用濃度如下表5：表53.2.6ao-eb染色：棄去培養(yǎng)液，用pbs洗兩次，每孔以20μlao-eb溶液(1μg/mlao+1μg/mlebinpbs)染色，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞各期凋亡、死亡等變化，拍照，結(jié)果如圖2所示。4、細胞遷移實驗4.1實驗材料和試劑h1975細胞，a431細胞，rapi1640基礎培養(yǎng)基，dmem基礎培養(yǎng)基(hyclone公司，cat:sh30022.01b)，fbs胎牛血清(gibco公司，cat:16400-044)，雙抗(北京夏斯生物科技有限公司，prospeccat:sv30010)，低速離心機(上海貝恩生物科技有限公司，cat:tdz4b-ws)，co2培養(yǎng)箱(上海博訊，cat:bc-j160s)，超凈工作臺(上海博訊型號sw-cj-2fd)，倒置熒光電子顯微鏡(leicadmi3000b)，直尺，記號筆，基質(zhì)膠(美國bd公司)，甲醇，結(jié)晶紫染液(中國武漢谷歌生物科技公司)4.2實驗方法4.2.1將腫瘤細胞以一定密度接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。4.2.2于單層培養(yǎng)細胞中進行劃痕實驗，用等滲pbs液洗去細胞碎片，再以不同濃度的抑制劑處理細胞48小時，具體藥物及使用濃度如下表6，之后用等滲pbs液洗去死亡細胞，顯微鏡下拍照，圖像分析，結(jié)果如圖3所示。表6transwell實驗檢測細胞的遷移能力4.2.3濾膜預處理：實驗前將濾膜用60μl的基質(zhì)膠(1：8稀釋)包被，再在小室頂部加入無血清培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱靜置0.5小時，進行再次水化處理；4.2.4細胞培養(yǎng)：a431、h1975細胞采用常規(guī)消化傳代方法，制成細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml；4.2.5于小室的上室加入200μl的上述細胞懸液，每孔細胞量為2×105個；4.2.6給予細胞藥物處理：以不同濃度的藥物(抑制劑)處理細胞24小時，具體藥物及使用濃度如下表7：表74.2.7在小室的下室(即24孔板底部)中加入600-800μl含10％胎牛血清的培養(yǎng)液；4.2.837℃培養(yǎng)箱加藥共孵育處理細胞24小時后，用鑷子小心取出小室，吸干上室液體，移到預先加有約800μl甲醇(4％多聚甲醛)的孔中，室溫固定10-30分鐘；4.2.9將小室移到預先加入約800μlgiemsa染液的孔中或2％結(jié)晶紫溶液中，室溫染色15-30分鐘；4.2.10用pbs清洗小室，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞；4.2.11徹底晾干小室后，倒置顯微鏡計數(shù)、拍照，結(jié)果如圖3所示。5、westernblotting5.1實驗材料和試劑h1975,a431細胞，rapi1640,dmem基礎培養(yǎng)基(hyclone公司，cat:sh30022.01b)，fbs胎牛血清(gibco公司，cat:16400-044)，雙抗(北京夏斯生物科技有限公司，prospeccat:sv30010)，低速離心機(上海貝恩生物科技有限公司，cat:tdz4b-ws)，co2培養(yǎng)箱(上海博訊，cat:bc-j160s)，超凈工作臺(上海博訊型號sw-cj-2fd)egfr一抗(bioworldtechnology),p-egfr一抗(bioworldtechnology),akt(bioworldtechnology),p-akt一抗(bioworldtechnology),erk(bioworldtechnology),p-erk一抗(bioworldtechnology),β-actin(中國杭州華安生物),蛋白裂解液(中國上海碧云天生物技術公司),bca蛋白濃度測定試劑盒(中國上海碧云天生物技術公司),脫脂奶粉(中國伊利公司)，beyoeclplus(超敏ecl化學發(fā)光試劑盒)(中國上海碧云天生物技術公司)，sds-page蛋白上樣緩沖液(5x)(中國上海碧云天生物技術公司)，beyocolortm彩色預染蛋白分子量標準(中國上海碧云天生物技術公司)，phs-3c型精密ph計(常州市國立試驗設備研究所),純水機(美國millipore),制冰機(美國forma)，凝膠電泳儀、濕式轉(zhuǎn)膜儀和干燥系統(tǒng)(美國bio-rad)、凝膠成像系統(tǒng)(美國uvp公司),脫色搖床(中國北京卓信偉業(yè)科技有限公司),倒置顯微鏡(日本olympas)。5.2實驗方法5.2.1細胞總蛋白提取1、a431、h1975細胞擴大培養(yǎng)后，分別給予如下表8常規(guī)藥物處理，處理48小時：表82、48小時后pbs洗細胞兩次，加入150ul蛋白裂解液，渦旋儀上渦旋8-10次，冰上裂解35-40min；3、裂解完成后，于4℃下12000rpm離心15min；4、測定蛋白質(zhì)濃度：采用碧云天bradford蛋白濃度測定試劑盒；5、將離心后的上清加入上樣緩沖液，100℃5min，然后放于-80℃保存、備用。5.2.2細胞總蛋白定量(bradford法)1、制作標準曲線(1)從-20℃取出1mg/mlbsa，室溫融化后，備用。(2)取6個1.5ml離心管，分別標記為0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。(3)按下表9在各管中加入各種試劑。表9管別0μg2.5μg5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg1mg/mlbsa－2.5μl5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl0.15mol/lnacl100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μl考馬斯亮藍溶液g2501ml1ml1ml1ml1ml1ml(4)混勻后，室溫放置2min。在96孔板中加入以上每組樣品，每孔200ul，每個濃度設三個復孔，于酶標儀595nm測定od值，制備標準曲線。2、檢測樣品蛋白含量(1)取足量的1.5ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。(2)取一管考馬斯亮藍加0.15mol/lnacl溶液100μl，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，同上法測定od值，實驗重復三次，取均值。(3)取一管考馬斯亮藍加95μl0.15mol/lnacl溶液和5μl待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，同上法測定od值，實驗重復三次，取均值。(4)根據(jù)標準曲線和樣本吸光度換算得到待測樣品蛋白質(zhì)濃度。5.2.3sds－page電泳測定完蛋白含量后，計算含100μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5ml離心管中，加入5×sds上樣緩沖液至終濃度為1×。(上樣總體積一般不超過15μl，加樣孔的最大限度可加20μl樣品。)上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性，然后置于冰上，備用。1、灌膠：在灌膠之前首先清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸取洗滌劑輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水反復沖洗干凈至不掛水，最后用蒸餾水沖洗干凈后站立晾干。(1)玻璃板對齊后放入制膠架中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。(操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。)(2)配制10％分離膠，加入temed后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml移液槍吸取5ml膠沿玻璃以一定速度放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后在膠面上加一層水，液封后的膠凝速度大大提高。(灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，以避免膠中出現(xiàn)氣泡。加水液封時速度要慢，否則分離膠會被沖散、變形。)(3)當水和膠之間出現(xiàn)折射線時，提示分離膠已凝。再等3min使膠充分凝固，傾去膠上層液封水，并用濾紙將水小心吸干，注意不要接觸膠面。(4)配制4％濃縮膠，加入temed后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免產(chǎn)生氣泡。插梳子時要盡量使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊垂直向上輕輕將其拔出。(5)用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。(小玻璃面向內(nèi)，大玻璃面向外。)2、加樣(1)向電泳槽中加入足夠的電泳緩沖液，準備上樣。(電泳液至少要浸沒內(nèi)側(cè)小玻璃上沿。)(2)取出預處理好的蛋白樣品，用微量進樣器貼壁吸取樣品，注意不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。3、電泳(1)插好電源，注意接頭電極方向(2)設置恒壓，60v(6v/cm)，當指示染料溴酚藍前沿進入分離膠后，時間約30min，將電壓提高到100－120v(15v/cm)，繼續(xù)電泳直至溴酚藍到達分離膠底部上方約1cm，關閉電源，終止電泳。5.2.4轉(zhuǎn)膜1、準備工作(1)轉(zhuǎn)一張膜需準備6張7.0-8.3cm的濾紙和1張7.3-8.6cm的pvdf膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，避免手部蛋白污染膜。將切好的pvdf膜做好標記，置于水中浸泡2小時。(用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。(2)將轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻璃棒、濾紙和浸濕的膜放入加有轉(zhuǎn)移緩沖液的搪瓷盤里。(3)將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻璃棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。)在墊子上墊三層濾紙(可三張紙先疊在一起在墊于墊子上)，一手固定濾紙一手用玻璃棒搟去其中的氣泡。2、取膠(1)于玻璃板兩個邊上輕輕將其撬開，小心取下玻璃板。將濃縮膠輕輕切去(濃縮膠影響操作)，避免把分離膠刮破，在分離膠的左上角切一個斜角作為標記。(2)將分離膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中進行平衡。3、轉(zhuǎn)膜(1)將平衡后的分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻璃棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠(膜蓋下后不可再移動)并除去氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。(轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗空間保持空氣流通。)(2)將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，可以在槽的一邊放置冰塊降溫(100v/100ma)。(3)轉(zhuǎn)膜完畢后將膜用1×麗春紅染液染色5min(于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可觀察膜上的蛋白。將膜晾干備用。5.2.5免疫反應1、封閉(1)配制封閉液(5％脫脂牛奶intbst)(2)將膜用tbst從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上緩慢搖動，室溫封閉2小時。2、一抗結(jié)合(1)配制一抗稀釋液：5％bsaintbst，調(diào)整ph為7.4，以保證抗原抗體反應于適宜的ph條件下進行)。(2)把膜從封閉液里取出，用tbst沖洗一遍后，浸沒于含一抗(如下表10)的雜交盒里，置于4℃搖床上緩慢搖動，孵育過夜。磷酸化抗體至少孵育12小時。其他抗體也可室溫孵育2-3h。表10一抗名稱來源稀釋倍數(shù)二抗egfr一抗bioworldtechnology1:3001:6000p-egfr一抗bioworldtechnology1:3001:6000aktbioworldtechnology1:3001:6000p-akt一抗bioworldtechnology1:3001:6000erk一抗bioworldtechnology1:3001:6000p-erkbioworldtechnology1:3001:60003、二抗結(jié)合(1)一抗孵育結(jié)束后，回收一抗，并于-20℃保存。將pvdf膜用tbst在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。(2)根據(jù)一抗的來源選擇相應的二抗，將二抗用封閉液進行一定比例的稀釋(1:2000-1:5000)，室溫孵育1-2h。4、化學發(fā)光，顯影，定影(1)二抗孵育結(jié)束后，可進行二抗的回收再利用，使用兩次后棄去。膜用tbst在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。(2)準備好曝光盒、顯色液及保鮮膜等。(3)將ecl-a和ecl-b兩種試劑在保鮮膜上進行等體積混合；1min后，將pvdf膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1min后，將膜移至另一保鮮膜上，去除殘余液體，包裹好，放入x-光片夾中。(4)在暗室中，將1×顯影液和定影液分別倒入塑料盤中；在紅燈下取出x-光片，用切紙刀剪裁適當大小(比膜的長和寬均需大1cm)；打開x-光片夾，把x-光片放在膜上，一旦放上，便不能再移動，關閉x-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強弱適當調(diào)整曝光時間，一般為1min或5min，也可選擇不同時間多次壓片，以取得最佳效果；曝光完成后，打開x-光片夾，取出x-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為1-2min(20-25℃)，溫度過低時(低于16℃)需適當延長顯影時間；顯影結(jié)束后，馬上將x-光片浸入定影液中，定影時間一般為5-10min，以膠片呈透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。(注意：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿取膠片的一角，手指甲不要劃傷膠片，否則將會對結(jié)果產(chǎn)生影響。)5、凝膠圖象分析：將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象分析軟件(quantityone)分析目標條帶的分子量和光密度值，所得結(jié)果如圖4所示。以上生物活性結(jié)果表明，本發(fā)明中dm3001的體內(nèi)外作用效果顯著，主要表現(xiàn)在以下幾個方面:(1)dm3001對突變型egfr激酶(egfrl858r/t790m)有強烈抑制作用，ic50僅僅為0.71nm，明顯優(yōu)于參比化合物rociletinib(21.5nm)和吉非替尼(823.3nm)而對于野生型egfr激酶(egfrwild-type)ic50值高達448.7nm。與rociletinib(si＝21.4)比較，dm3001的選擇性指數(shù)(si＝632)高出21倍，結(jié)果預示著化合物dm3001作用更專一，因此可能的毒副作用會更小，同時，該化合物對fak黏著斑激酶的抑制效果僅為1.71nm，預示著dm3001可作用于雙靶點發(fā)揮更好的抗腫瘤活性。(2)抗細胞增殖活性結(jié)果揭示，dm3001對于攜帶突變型egfrt790m的h1975細胞有強烈的抑制作用，ic50值僅為0.037μm，而對于攜帶野生型egfrwild-type的細胞株a431的抑制作用很弱，ic50值分別為0.382μm。明顯優(yōu)于參比藥物rociletinib、吉非替尼。對于攜帶敏感突變的hcc827(egfrdele746_a750)，dm3001及參比藥物都有很好的抑制作用。另外，dm3001對人正常支氣管上皮細胞hbe的抑制作用較弱，在其發(fā)揮抑制h1975細胞的有效濃度下，幾乎對正常細胞沒有影響，證明此類化合物的毒性更小。(3)ao/eb熒光雙染法和dapi染色法結(jié)果表明dm3001作用于egfr野生株a431細胞和t790m突變株h1975細胞，均可引起細胞凋亡的形態(tài)學改變。同時dm3001對于h1975的誘導凋亡作用更顯著，證明其作用更專一。(4)細胞的遷移和侵襲實驗表明dm3001能夠強烈抑制h1975細胞和a431細胞。與rociletinib和osimertinib比較，同樣濃度下dm3001對h1975細胞侵襲能力的抑制作用更強，說明dm3001在抑制腫瘤細胞增殖的同時，還強烈抑制細胞的遷移。(5)westernblotting實驗表明，dm3001能夠顯著抑制egfr下游akt信號通路中相關蛋白的表達，隨著給藥濃度的依次增大，p-egfr、p-akt、p-erk表達水平依次下調(diào)，呈現(xiàn)出劑量依賴性；對h1975細胞的抑制作用優(yōu)于a431細胞，進一步在分子水平驗證了dm3001的選擇性更高。該化合物具有較強的抑制非小細胞肺癌(nsclc)細胞增殖能力，顯示出比rociletinib更加優(yōu)良的抗egfrt790m活性，且能夠作用于fak激酶。作為一類結(jié)構(gòu)新穎的分子，本發(fā)明中研究化合物具有開發(fā)成新型高效egfr和fak雙靶點抑制劑的潛力，對治療相關的腫瘤疾病尤其是非小細胞肺癌、小細胞肺癌有較大的應用價值。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)先實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12