本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)，尤其涉及一種僵蠶蛋白多肽酒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：僵蠶（bombyxbatryticatus）是蠶蛾科昆蟲家蠶bombyxmorilinnaeus4-5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌beauveriabassiana(bals.)vuillant而致死的干燥體。產(chǎn)于春秋二季。僵蠶又稱白僵蠶、僵蟲、姜蟲等，以蠶體粗壯、質(zhì)地堅硬、色澤潔白、橫切斷面光亮者為佳。多產(chǎn)于四川、廣西、江蘇、浙江、安徽、山東等省份，其中四川省出產(chǎn)的僵蠶為道地藥材。僵蠶的形成過程為，在環(huán)境適宜的情況下，白僵菌的分生孢子附著在蠶體上，發(fā)芽生出發(fā)芽管，進入蠶體組織，在蠶體內(nèi)形成大量的菌絲。菌絲大量吸收蠶體中的養(yǎng)分和水分，直到蠶體死亡，且因菌絲分泌產(chǎn)生的草酸鈣結(jié)晶體堆積，使得蠶體僵硬呈干燥狀。蠶體表面生出白色擔子梗形成白色分生孢子，由此得名僵蠶。僵蠶的藥用歷史悠久，具有祛風解痙，化痰散結(jié)的功效，主治中風失音，驚癇，頭風，喉風，喉痹等癥。研究發(fā)現(xiàn)，僵蠶中含有豐富的蛋白質(zhì)、草酸銨、脂肪和有機酸、微量元素、維生素等成分，蛋白質(zhì)是主要活性成分之一。僵蠶中測定蛋白質(zhì)含量介于29.74%-64.73%。此外，研究表明僵蠶生品和炮制品的蛋白質(zhì)含量各不相同。僵蠶的藥理作用研究發(fā)現(xiàn)僵蠶具有抗驚厥、抗癲癇、抗凝、抗血栓、促纖溶、抑菌作用等重要的營養(yǎng)保健作用和臨床藥用價值。僵蠶本身藥用價值高，高蛋白、低脂肪，是一種潛在的動物蛋白資源。但是目前對僵蠶的研究主要集中在僵蠶水提取物、醇提取物等方面，而對僵蠶豐富蛋白質(zhì)資源的研究卻報道尚少。因此利用現(xiàn)代食品生物技術(shù)對僵蠶蛋白進行深度開發(fā)，制備出具有保健作用的功能食品，不僅可提高現(xiàn)有資源的利用率，為僵蠶的深度加工提供一條新的途徑；而且可增強僵蠶中藥產(chǎn)業(yè)科技含量和市場競爭力，對提高我國中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化綜合利用技術(shù)水平和發(fā)展保健食品工業(yè)具有重要的社會意義和經(jīng)濟效益。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種僵蠶蛋白多肽酒。本發(fā)明以僵蠶蛋白多肽為主要成分，配以全蝎、蟬蛻、川芎、天麻、透骨草、地龍的中藥輔藥，制備得到具有延長凝血酶時間，即可抑制凝血酶-纖維蛋白原反應(yīng)物，作為具有抗凝、抗血栓作用的保健藥酒，兩者配合使用，能夠起到協(xié)同增效的作用，能夠具有抗凝、抗血栓作用，適用于中老年人作為日常保健用品實用，實用性強，安全可靠。本發(fā)明的目的之二在于一種僵蠶蛋白多肽酒的制備方法，該制備方法操作簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)得到的僵蠶蛋白多肽酒效果顯著。本發(fā)明的目的之一采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種僵蠶蛋白多肽酒，由如下重量份的組分制備而成：僵蠶蛋白多肽0.5-1.8份、全蝎5-8份、蟬蛻5-8份、川芎4-6份、天麻4-6份、透骨草4-6份、地龍4-6份以及酒精濃度為10-15%的黃酒75-85份。進一步地，所述僵蠶蛋白多肽為分子量介于800-1100da的僵蠶蛋白多肽，該僵蠶蛋白多肽由如下步驟制得：（1）超聲提取：以水為提取溶劑，料液比為1:（10-15），浸泡15min，用勻漿機勻漿后，超聲提取40-50min，得到提取液；（2）蛋白質(zhì)改性：步驟（1）得到的提取液，用tris-hcl調(diào)ph值至7.3-7.5，在60-65℃下，微波處理10分鐘得到改性蛋白溶液；（3）一次酶解：以改性蛋白溶液為底物，用tris-hcl調(diào)ph值至7.3-7.5，按照底物質(zhì)量百分比為2-3%加入復(fù)合酶拌勻，然后在50-55℃下，微波處理10分鐘，得到一次酶解液；（4）二次酶解：經(jīng)過第一次酶解處理后，將一次酶解液降至常溫，再次用tris-hcl調(diào)節(jié)ph值至7.3-7.5，以改性蛋白溶液為底物，加入中性蛋白酶拌勻，然后在50-55℃下，微波處理10分鐘，酶解結(jié)束，得到酶解物；（5）分離純化的步驟：將酶解物降至室溫，取上清液，經(jīng)超濾膜超濾，然后再將所得濾液經(jīng)納濾膜截留，收集截留液冷凍干燥，即得僵蠶蛋白多肽。進一步地，在步驟（1）中，所述超聲條件為超聲功率為160-180w，超聲溫度為60-65℃。進一步地，在步驟（3）中，所述復(fù)合酶為由胃蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶a復(fù)合而成的復(fù)合酶，所述胃蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶a的質(zhì)量比為3:1.5:1。進一步地，在步驟（4）中，所述中性蛋白酶的加酶量為1800μ/g。進一步地，在步驟（5）中，所述超濾膜的截留分子量為3000da，所述納濾膜采用芳族聚酰胺復(fù)合膜。進一步地，在步驟（2）、（3）和（4）中所述微波功率為200-300w。本發(fā)明的目的之二采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：提供一種如上所述的僵蠶蛋白多肽酒的制備方法，包括如下步驟：（1）將按照配方量的全蝎、蟬蛻、川芎、天麻、透骨草、地龍配料，然后倒入部分黃酒浸提2-3個月，然后過濾，取上清液，得到藥材浸提液；（2）將僵蠶蛋白多肽加入至黃酒中，攪拌均勻，并密封儲存1個月，得到僵蠶蛋白多肽混合酒；（3）將步驟（1）的藥材浸提液和步驟（2）的僵蠶蛋白多肽混合酒進行勾兌，攪拌均勻，并密封儲存1個月，即得僵蠶蛋白多肽酒。進一步地，步驟（1）中與步驟（2）中所述黃酒的用量比例為2:1。進一步地，步驟（2）中所述僵蠶蛋白多肽的制備方法如下：超聲提?。阂运疄樘崛∪軇弦罕葹?:（10-15），浸泡15min，用勻漿機勻漿后，超聲提取40-50min，得到提取液；蛋白質(zhì)改性：提取液用tris-hcl調(diào)ph值至7.3-7.5，在60-65℃下，微波處理10分鐘得到改性蛋白溶液；一次酶解：以改性蛋白溶液為底物，用tris-hcl調(diào)ph值至7.3-7.5，按照底物質(zhì)量百分比為2-3%加入復(fù)合酶拌勻，然后在50-55℃下，微波處理10分鐘，得到一次酶解液；二次酶解：經(jīng)過第一次酶解處理后，將一次酶解液降至常溫，再次用tris-hcl調(diào)節(jié)ph值至7.3-7.5，以改性蛋白溶液為底物，加入中性蛋白酶拌勻，然后在50-55℃下，微波處理10分鐘，酶解結(jié)束，得到酶解物；分離純化的步驟：將酶解物降至室溫，取上清液，經(jīng)超濾膜超濾，然后再將所得濾液經(jīng)納濾膜截留，收集截留液冷凍干燥，即得僵蠶蛋白多肽。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：（1）本發(fā)明以僵蠶蛋白多肽為主要成分，配以全蝎、蟬蛻、川芎、天麻、透骨草、地龍的中藥輔藥，制備得到具有延長凝血酶時間，即可抑制凝血酶-纖維蛋白原反應(yīng)物，作為具有抗凝、抗血栓作用的保健藥酒，兩者配合使用，能夠起到協(xié)同增效的作用，能夠具有抗凝、抗血栓作用，適用于中老年人作為日常保健用品實用，實用性強，安全可靠。（2）此外，通過改進僵蠶蛋白多肽的提取、酶解、純化分離技術(shù)，以超聲提取、超波輔助酶解和超濾結(jié)合納濾分離純化，制備具有抗凝、抗血栓活性的多肽，本發(fā)明制備的僵蠶蛋白多肽的肽得率高，純度高，可以作為添加劑或活性藥物添加至到人類食品、醫(yī)藥、保健品等多種行業(yè)和領(lǐng)域，無疑對延長中草藥進一步開發(fā)的產(chǎn)業(yè)鏈，全面提高僵蠶產(chǎn)業(yè)綜合效益，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)增效農(nóng)民增收農(nóng)村繁榮，對推動一帶一路建設(shè)有重大意義。（3）本發(fā)明整個僵蠶蛋白多肽的制備工藝以及僵蠶蛋白多肽酒的流程短、時間短，能耗低、污染少、不使用有毒試劑、無污染物排放，達到清潔生產(chǎn)目標。（4）在控制酶解過程中酶的選擇是關(guān)鍵，它不僅影響最后僵蠶蛋白多肽的生理功能、僵蠶原料利用率，而且也直接影響僵蠶蛋白多肽酒的風味和物理化學(xué)特性。酶的選擇、酶解過程的控制是酶解法制備僵蠶蛋白多肽的關(guān)鍵技術(shù)。本發(fā)明經(jīng)過大量試驗篩選出復(fù)合酶和中性蛋白酶來水解僵蠶蛋白，并且篩選出最優(yōu)的用酶條件，對僵蠶蛋白的酶解效果最好。由于各種酶由于酶作用位點的特異性，對同一底物僵蠶蛋白具有不同的水解能力。胃蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶a是一種含內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶的復(fù)合蛋白酶，它的專一性較弱，能廣泛水解多個位點，如arg-，lys-，phe-，try-。中性蛋白酶是一種內(nèi)切酶，在一定溫度、ph值下，本品能將大分子蛋白質(zhì)水解為氨基酸等產(chǎn)物。因此多位點的切割，使其水解產(chǎn)物的水解度和肽得率都較高。（5）由本發(fā)明截留分子量為3000da的超濾膜進行分離純化，再經(jīng)過芳族聚酰胺復(fù)合膜的納濾膜進行除雜，既可降低能耗，還能將有機污染物和鹽分除去，達到提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的，得到的僵蠶蛋白多肽分子量介于800-1100da，該僵蠶蛋白多肽組分抗凝、抗血栓作用強，研究發(fā)現(xiàn)，并非肽分子量越小或越大其抗凝、抗血栓活性越強，肽的活性也受其氨基酸的組成、排序或肽的空間結(jié)構(gòu)等因素的影響，由本發(fā)明純化得到的分子量介于800-1100da僵蠶蛋白多肽其活性最強。另外，本發(fā)明的分離條件溫和、樣品回收率高、實驗結(jié)果重現(xiàn)性高、設(shè)備簡便經(jīng)濟。具體實施方式下面，結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明做進一步描述，需要說明的是，在不相沖突的前提下，以下描述的各實施例之間或各技術(shù)特征之間可以任意組合形成新的實施例。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實施例1一種僵蠶蛋白多肽酒，由如下重量份的組分制備而成：僵蠶蛋白多肽1.5份、全蝎6份、蟬蛻6份、川芎5份、天麻5份、透骨草5份、地龍5份以及酒精濃度為15%的黃酒80份。實施例2一種僵蠶蛋白多肽酒，由如下重量份的組分制備而成：僵蠶蛋白多肽0.5份、全蝎5份、蟬蛻5份、川芎4份、天麻4份、透骨草4份、地龍4份以及酒精濃度為10%的黃酒75份。實施例3一種僵蠶蛋白多肽酒，由如下重量份的組分制備而成：僵蠶蛋白多肽1.8份、全蝎8份、蟬蛻8份、川芎6份、天麻6份、透骨草6份、地龍6份以及酒精濃度為15%的黃酒85份。實施例4實施例1-3的僵蠶蛋白多肽酒制備方法如下：（1）將按照配方量的全蝎、蟬蛻、川芎、天麻、透骨草、地龍配料，然后倒入總量三分之二的黃酒浸提2.5個月，然后過濾，取上清液，得到藥材浸提液；（2）將僵蠶蛋白多肽加入總量三分之一的黃酒中，攪拌均勻，并密封儲存1個月，得到僵蠶蛋白多肽混合酒；所述僵蠶蛋白多肽為分子量介于800-1100da的僵蠶蛋白多肽，該僵蠶蛋白多肽由如下步驟制得：（a）超聲提取：以水為提取溶劑，料液比為1:12，浸泡15min，用勻漿機勻漿后，超聲提取45min，超聲條件為超聲功率為170w，超聲溫度為65℃，得到提取液；（b）蛋白質(zhì)改性：步驟（1）得到的提取液，用tris-hcl調(diào)ph值至7.4在63℃下，微波處理10分鐘，微波功率為250w，得到改性蛋白溶液；（c）一次酶解：以改性蛋白溶液為底物，用tris-hcl調(diào)ph值至7.4，按照底物質(zhì)量百分比為2-3%加入復(fù)合酶拌勻，復(fù)合酶為由胃蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶a復(fù)合而成的復(fù)合酶，所述胃蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶a的質(zhì)量比為3:1.5:1。然后在53℃下，微波處理10分鐘，微波功率為250w，得到一次酶解液；（d）二次酶解：經(jīng)過第一次酶解處理后，將一次酶解液降至常溫，再次用tris-hcl調(diào)節(jié)ph值至7.4，以改性蛋白溶液為底物，加入中性蛋白酶拌勻，中性蛋白酶的加酶量為1800μ/g，然后在53℃下，微波處理10分鐘，微波功率為250w，酶解結(jié)束，得到酶解物；（e）分離純化的步驟：將酶解物降至室溫，取上清液，經(jīng)超濾膜超濾，超濾膜的截留分子量為3000da，然后再將所得濾液經(jīng)采用芳族聚酰胺復(fù)合膜的納濾膜截留，收集截留液冷凍干燥，即得僵蠶蛋白多肽。（3）將步驟（1）的藥材浸提液和步驟（2）的僵蠶蛋白多肽混合酒進行勾兌，攪拌均勻，并密封儲存1個月，即得僵蠶蛋白多肽酒。對比例1與實施例1的區(qū)別在于在僵蠶蛋白多肽過程中，一次酶解的復(fù)合酶中胃蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶a的質(zhì)量比不在本發(fā)明限定的范圍內(nèi)，即為胃蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶a的質(zhì)量比1:1:1。對比例2與實施例1的區(qū)別在于在僵蠶蛋白多肽過程中，去除超聲提取的步驟，其余步驟與參數(shù)相同。對比例3與實施例1的區(qū)別在于在僵蠶蛋白多肽過程中，去除分離純化的步驟，即去除超濾膜超濾、納濾膜截留的步驟，其余步驟與參數(shù)相同。下面，對本發(fā)明制備的僵蠶蛋白多肽的肽得率、純度以及抗凝作用進行測定與驗證。1、肽得率的測定采用三氯乙酸(tca)沉淀法與甲醛滴定法相結(jié)合進行測定。取10ml酶解液加10ml20%(g/g)tca，攪勻靜置半小時后在4800r/min下離心10min，所得的上清液記作上清液tca，分別用凱氏定氮法和甲醛滴定法測定上清液中的總氮含量和氨態(tài)氮含量，則肽氮量和肽得率按下式進行計算，結(jié)果如表1：上清液總肽氮量=上清液tca總氮量－上清液tca總氨態(tài)氮量，肽得率=上清液總肽氮含量/原料總蛋白氮含量×100%。2、純度的測定以牛血清白蛋白（bsa）為標準品，制成不同濃度的bsa溶液。向7支試管中分別加入5ml考馬斯亮藍染色溶液染色5min。以第1支試管中的溶液為空白對照，測定其余6支試管中溶液在595nm處的吸光度。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g·l-1)為橫坐標，吸光度為縱坐標，進行線性回歸分析。得到的線性回歸方程為y=6.132+0.035(r=0.999)，線性范圍為0-100μg。結(jié)果表明，線性關(guān)系良好，可以用來進行蛋白質(zhì)含量的測定。分別吸取實施例1-3所得的僵蠶蛋白多肽作為供試品，在595nm處測定吸光度，并根據(jù)標準曲線計算蛋白質(zhì)含量，計算蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)/%，結(jié)果如表1。3、抗凝作用的驗證血檢性疾病是一類嚴重危害人類健康的疾病，它包括冠心病，急性心肌梗塞，缺血性腦中風，靜脈血栓形成及肺血檢檢塞等許多常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率、致殘率和死亡率都很高。僵蠶早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中已有記載，具熄風止痙，活血通絡(luò)，化疾散結(jié)等功效，目前多用于治療癲癰，頑固性頭痛等疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為這類疾病與體內(nèi)血小板活化，凝血酶形成等高凝狀態(tài)，甚至血檢形成等有密切關(guān)系，因此推測其作用可能與改善體內(nèi)高凝狀態(tài)有關(guān)。本申請通過體外測定凝血酶時間(tt)，證明僵蠶蛋白多肽酒具有抗凝血及抑制血栓形成的作用。測定方法:取干凈的反應(yīng)杯,在其中各孔中加入0.lml新鮮兔血漿，37℃孵育3分鐘后，分別加入實施例1-3以及對比例1-3制備的僵蠶蛋白多肽酒,生理鹽水各0.lml，與反應(yīng)杯中的血漿混勻后再分別加入0.lml凝血酶,用start-4半自動四通道血凝儀測其凝血酶時間(tt),每個樣品測10次,取平均值，分析結(jié)果見表1。表1僵蠶蛋白多肽的肽得率、純度以及抗凝效果肽得率（%）純度（%）凝血酶時間/s空白組（生理鹽水）--17.8實施例166.963.877.8實施例265.162.565.1實施例364.260.661.9對比例141.223.624.6對比例235.621.835.8對比例328.924.840.1表1結(jié)果顯示，與空白組比較，實施例1-3以及對比例1-3均能一定程度延長凝血酶的凝血時間，尤其實施例1-3能明顯延長凝血酶的凝血時間，凝血時間能夠達到60s以上。本發(fā)明實施例1-3制備的僵蠶蛋白多肽的肽得率高，純度高，可以作為添加劑或活性藥物添加至到人類食品、醫(yī)藥、保健品等多種行業(yè)和領(lǐng)域，無疑對延長中藥產(chǎn)業(yè)鏈，全面提高僵蠶產(chǎn)業(yè)綜合效益，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)增效農(nóng)民增收農(nóng)村繁榮，對推動一帶一路建設(shè)有重大意義。而對比例1凝血酶的凝血時間有一定的延長，但是其效果與實施例1-3相比，卻大打折扣，這可能由于在僵蠶蛋白多肽過程中，一次酶解的復(fù)合酶中胃蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶a的質(zhì)量比不在本發(fā)明限定的范圍內(nèi)導(dǎo)致，說明復(fù)合酶的篩選對本發(fā)明僵蠶蛋白多肽的提取率以及純度有一定的影響。而對比例2凝血酶的凝血時間也有一定的延長，但是其效果與實施例1-3相比，卻也大打折扣，這可能由于在僵蠶蛋白多肽過程中，去除超聲提取步驟的緣故導(dǎo)致，說明超聲提取對本發(fā)明僵蠶蛋白多肽的提取率以及純度有一定的影響。而對比例3凝血酶的凝血時間也有一定的延長，但是其效果與實施例1-3相比，卻也大打折扣，這可能由于在僵蠶蛋白多肽過程中，去除分離純化的步驟，即去除超濾膜超濾、納濾膜截留的步驟的緣故導(dǎo)致，說明超濾膜超濾、納濾膜截留對僵蠶蛋白多肽的提取率以及純度有一定的影響。綜上所述，在制備僵蠶蛋白多肽過程中，各個步驟是相輔相成的，各個步驟的綜合才能得到本發(fā)明具有明顯抗凝血作用的僵蠶蛋白多肽酒。上述實施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護的范圍。當前第1頁12