本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種應(yīng)用高分辨率熔解曲線技術(shù)鑒定浙貝母道地性的方法。
背景技術(shù)：
：浙貝母為百合科植物浙貝母(fritillariathunbergiimiq.)的干燥鱗莖。貝母類(lèi)藥材首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，清代《本草綱目拾遺》將貝母明確分為川貝和浙貝，《中國(guó)藥典》中收錄有浙貝母、川貝母、湖北貝母、平貝母和伊貝母，臨床用藥使用較多的是浙貝母和川貝母2大類(lèi)群。不同貝母化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用也存在顯著差異。浙貝母以浙江產(chǎn)區(qū)道地貝母為主，包括長(zhǎng)江流域地區(qū)產(chǎn)出的湖北貝母、東陽(yáng)貝母等。浙貝母主要包含浙貝甲素和浙貝乙素2中含量較高的生物堿，具有清熱化痰、止咳、開(kāi)郁散結(jié)的功效。川貝以四川產(chǎn)出的川貝母為主，包括西北和東北產(chǎn)出的伊貝母和平貝母等，均含有同一類(lèi)含量較高的生物堿-西貝素，具有清熱潤(rùn)肺的功效。在實(shí)際應(yīng)用中幾種貝母常易混淆。傳統(tǒng)鑒別中藥材的方法難以精準(zhǔn)區(qū)分貝母與其混偽品。dna條形碼技術(shù)在2003年被首次提出，并且迅速在物種的分類(lèi)與鑒定研究領(lǐng)域中得到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。它是一種新型物種分子鑒定技術(shù)。該技術(shù)可以利用短的、標(biāo)準(zhǔn)的dna序列片段作為物種標(biāo)記，定位親緣關(guān)系，分析分支來(lái)源，為中藥材提供快速、精準(zhǔn)的鑒定。它彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定方法的缺陷，并具有自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便等。由于核基因its2具有很強(qiáng)的物種水平鑒定能力和良好的pcr擴(kuò)增效率，因此適合作為植物dna條形碼的序列。its2區(qū)域可以潛在地用作標(biāo)準(zhǔn)dna條形碼識(shí)別藥用植物及其近緣種，并且可以作為一個(gè)新的通用條碼來(lái)更廣泛地識(shí)別植物類(lèi)群。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速精準(zhǔn)鑒定道地性浙貝母的檢測(cè)方法，本發(fā)明采用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)檢測(cè)its2序列，分析熔解曲線特征及差異能夠有效準(zhǔn)確地鑒定浙江貝母道地性。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種快速精準(zhǔn)鑒定道地性浙貝母的檢測(cè)方法，包括dna提取，還包括以下步驟：一、設(shè)置參數(shù)：1)、pcr擴(kuò)增pcr擴(kuò)增體系為：擴(kuò)增體系中所用的its2的引物序列：引物f(its2-f)：atgcgatacttggtgtgaat；引物r(its3-r)：gacgcttctccagactacaat。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃變性5min；95℃變性15s，tm退火25s，72℃延伸30s；40個(gè)循環(huán)；引物退火溫度為55～59℃(最佳退火溫度為57℃)；green-2-gomastermix，即為green-2-goqpcrmastermix-lowrox(2x)；2)、將擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行hrm(即，上述40個(gè)循環(huán)后進(jìn)入hrm程序)：hrm程序?yàn)椋?5℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃，1min；降溫至25℃；收集65-95℃的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)；二、將浙貝母標(biāo)準(zhǔn)品(浙江道地性貝母)和待測(cè)樣品分別按照步驟一所述參數(shù)進(jìn)行hrm；以浙貝母標(biāo)準(zhǔn)品(浙江道地性貝母)為參照做基線，待測(cè)樣品與基線所產(chǎn)生的相對(duì)熒光值的差值為縱坐標(biāo)生成派生熔解曲線，從而獲得高分辨率熔解曲線差異圖；當(dāng)待測(cè)樣品與基線所產(chǎn)生的相對(duì)熒光值的差值為-5.418～6.582之間，判定是浙貝母；反之，則判定為非浙貝母。作為本發(fā)明的浙江道地性貝母的鑒定方法的改進(jìn)：高分辨率熔解曲線分析，是在rochelightcyclertm480ⅱ熒光定量pcr儀器上進(jìn)行hrm。所采用的軟件為lightcycler480ⅱ分析軟件。當(dāng)熔解曲線聚于基線，與基線差異值在-5.418～6.582之間，判定是浙貝母。其他產(chǎn)地貝母偏離基線正向高于24.582或負(fù)向低于-11.418，并在不同tm值處出現(xiàn)偏離峰。川貝母在tm值89.75℃時(shí)出現(xiàn)正向的偏離峰，湖北貝母在tm值91.5℃時(shí)出現(xiàn)負(fù)向的偏離峰。在本發(fā)明中，所用數(shù)據(jù)分析方法為hrm差異圖分型法，直接對(duì)熔解曲線進(jìn)行比較，通過(guò)軟件歸一化后，以熒光信號(hào)的差值建立標(biāo)準(zhǔn)模型。作為本發(fā)明技術(shù)方案的改進(jìn)：本發(fā)明利用磁珠法深加工產(chǎn)品基因組dna抽提試劑盒提取貝母藥材干粉的dna，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及濃度測(cè)定。所得dna濃度為20.47～77.34ng/μl。在本發(fā)明中，pcr擴(kuò)增時(shí)，貝母包括其近緣種的pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度在400-500bp之間；pcr產(chǎn)物進(jìn)行hrm時(shí)，以tm值為橫坐標(biāo)，以熒光信號(hào)值為縱坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)化的熔解曲線(圖1)；另外，以浙貝母標(biāo)準(zhǔn)品為參照做基線，與其他樣品產(chǎn)生相對(duì)熒光值的差值為縱坐標(biāo)生成派生熔解曲線，將其間差異進(jìn)行放大，便于觀察不同樣品間的差別(圖2)，即，獲得高分辨率熔解曲線差異圖。在本發(fā)明中，還進(jìn)行過(guò)如下的實(shí)驗(yàn)：取擴(kuò)增產(chǎn)物20ul，用4.0％的瓊脂糖凝膠(含有0.5％ug/uleb)電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。浙江道地性貝母與其他產(chǎn)地的貝母均具有約400bp的條帶。本發(fā)明在做高分辨率熔解曲線分析時(shí)發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)貝母在直接獲得的熔解峰圖表現(xiàn)出的形狀和出峰位置的差異不明顯，以浙江貝母標(biāo)準(zhǔn)品為基線派生出的歸一化熔解曲線將差異放到，獲得了不同產(chǎn)地具有明顯差異且同產(chǎn)地相聚類(lèi)的曲線。本發(fā)明以建立its2序列高分辨率熔解曲線模型為基礎(chǔ)進(jìn)行物種鑒定，根據(jù)its2通用引物擴(kuò)增獲得pcr產(chǎn)物的實(shí)時(shí)熔解曲線形狀及tm值差異區(qū)分物種。高分辨率熔解曲線分析：在rochelightcyclertm480ⅱ熒光定量pcr儀器上運(yùn)行。本發(fā)明直接獲得高分辨率熔解曲線分析，從而建立貝母及近緣物種典型歸一化熔解曲線差異圖曲線模型，根據(jù)參照基線及tm值差異所得導(dǎo)圖來(lái)區(qū)分不同產(chǎn)地及不同種藥材。綜上所述，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：以貝母藥材干粉為材料，提取基因組dna，利用its2序列的通用引物進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增，利用高分辨率熔解曲線峰差異鑒定道地性浙江貝母。擴(kuò)增得到pcr產(chǎn)物，通過(guò)飽和染料對(duì)pcr產(chǎn)物的熔解曲線的實(shí)時(shí)變化的監(jiān)測(cè)進(jìn)行hrm測(cè)定，進(jìn)行物種鑒定。本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：1)、靈敏度高，hrm可區(qū)分單堿基突變，能夠高靈敏度地鑒定基因多態(tài)性分型結(jié)果。2)、快速高效，hrm在幾十分鐘內(nèi)即可完成反應(yīng)，能夠快速高效鑒定物種。3)、簡(jiǎn)單直觀，根據(jù)產(chǎn)物不同tm熔解曲線形狀，能夠快速直觀地鑒定物種。本發(fā)明首次建立浙江貝母高分辨率熔解曲線模型，利用高分辨率熔解曲線技術(shù)針對(duì)貝母its2序列獲得不同產(chǎn)區(qū)的曲線形狀，與傳統(tǒng)its2作為dna條碼的測(cè)序分析方法比較，具有快速直觀高效的優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1是標(biāo)準(zhǔn)化的隨溫度變化的高分辨率熔解曲線圖；a：浙江貝母；b：川貝母；c：湖北貝母；圖2為浙江貝母及近緣物種鑒定的高分辨率熔解曲線圖；a：浙江貝母；b：川貝母；c：湖北貝母；圖3為浙江貝母及近緣物種pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖；m：dnaladder；1-5：浙江貝母樣品；6-8：四川貝母樣品；9-10：湖北貝母；圖4為退火溫度50℃時(shí)pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖；m：dnaladder；1-5：浙江貝母樣品；6-8：四川貝母樣品；9-10：湖北貝母；圖5為退火溫度60℃時(shí)pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖；m：dnaladder；1-5：浙江貝母樣品；6-8：四川貝母樣品；9-10：湖北貝母。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。實(shí)施例1、一種浙江道地性貝母的鑒定方法，依次進(jìn)行以下步驟：1)、dna提?。豪么胖榉ㄉ罴庸ぎa(chǎn)品基因組dna抽提試劑盒提取貝母藥材干粉的dna，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及濃度測(cè)定。所得dna濃度為20.47～77.34ng/ul。利用rnasefreeh2o進(jìn)行稀釋?zhuān)瑥亩筪na濃度為10ng/ul。2)、設(shè)置參數(shù)：以浙江貝母及其近緣物種的dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增后進(jìn)入hrm程序：①、pcr擴(kuò)增pcr擴(kuò)增體系為：反應(yīng)成分濃度體積(μl)引物f(μl)10μm0.2引物r(μl)10μm0.2green-2-gomastermix2×5template*(dna)10ng/ul0.5rnasefreeh2otototalvolume10pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃變性5min；95℃變性15s，tm退火25s，72℃延伸30s；40個(gè)循環(huán)；引物退火溫度為57℃；取擴(kuò)增產(chǎn)物20ul，用4.0％的瓊脂糖凝膠(含有0.5％ug/uleb)電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。如圖3所示。在圖3中，浙江道地性貝母與其他產(chǎn)地的貝母(四川貝母、湖北貝母)具有的條帶均具有約400bp的條帶，該條帶的序列如seqidno：3所示。②、循環(huán)結(jié)束后進(jìn)入hrm程序，即，將擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行hrm。hrm程序?yàn)椋?5℃，1min；40℃，1min；65℃，1s；95℃，1min；降溫至25℃。高分辨率熔解曲線分析：在rochelightcyclertm480ⅱ熒光定量pcr儀器上行hrm，收集65～95℃的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)，以tm值為橫坐標(biāo)，以熒光信號(hào)值為縱坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)化的高分辨率熔解曲線(圖1)。選用lightcycler480ⅱ分析軟件，以浙貝母標(biāo)準(zhǔn)品為參照做基線，與其他樣品產(chǎn)生相對(duì)熒光值的差值為縱坐標(biāo)生成派生熔解曲線，將其間差異進(jìn)行放大，從而獲得高分辨率熔解曲線差異圖；當(dāng)待測(cè)樣品與基線所產(chǎn)生的相對(duì)熒光值的差值為-5.418～6.582之間，判定是浙貝母；反之，則判定為非浙貝母。即，所得的熔解曲線在圖2中與所述的基線進(jìn)行比對(duì)，當(dāng)差異值為-5.418～6.582之間時(shí)，判定為浙江貝母；反之，則判定為非浙江貝母。結(jié)果為：當(dāng)樣品為浙江貝母時(shí)，熔解曲線如圖2的a所述。實(shí)驗(yàn)一、將事先已知是浙貝母的20個(gè)批次的待測(cè)品，按照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果均為：其熔解曲線均與基線差異值在-5.418～6.582之間。實(shí)驗(yàn)二、將事先已知是浙江貝母、湖北貝母、四川貝母的3個(gè)產(chǎn)地的待測(cè)品(每類(lèi)待測(cè)品均選用5個(gè)批次)按照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果為：浙江貝母，熔解曲線如圖2的a所述，差異值在-5.418～6.582之間。四川貝母，熔解曲線如圖2的b所述峰形，正向偏離基線高于24.582，tm為89.75℃。湖北貝母，熔解曲線如圖2的c所述峰形，負(fù)向偏離基線低于-11.418，tm為91.5℃。對(duì)比例1-1、將實(shí)施例1中的退火溫度由作為最佳溫度的57℃改成50℃，其余同實(shí)施例1。所得結(jié)果為：pcr擴(kuò)增效率較差，3號(hào)樣品和7號(hào)樣品擴(kuò)增失敗，其余樣品出現(xiàn)不同程度的拖尾現(xiàn)象，目標(biāo)條帶400bp左右，但特異性較差(圖4)，不適于進(jìn)行后續(xù)的hrm程序。對(duì)比例1-2、將實(shí)施例1中的退火溫度由作為最佳溫度的57℃改成60℃，其余同實(shí)施例1。所得結(jié)果為：除2、9、10號(hào)樣品擴(kuò)增出較淡條帶外，其余樣品均擴(kuò)增失敗(圖5)。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。<110>浙江理工大學(xué)<120>浙江道地性貝母的鑒定方法<160>3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>its2-f<400>1atgcgatacttggtgtgaat20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>its3-r<400>2gacgcttctccagactacaat21<210>3<211>444<212>dna<213>浙貝母(fritillariathunbergiimiq.)<400>3gacgcagttgcgcccgaggcctttcggccgagggcacgcctgcctgggcgtcacgccttg60tttcgctccctgcccccgtcccttcggatgcggtcacggatgctgcgattggcccccccc120gcctcgtgtgcggcgggcttaacaacgggctgtcggcctcgggatgggcacgacaagggg180tggacggagcaccatcgggatgttgtggccccctgtccccttaagggggtcaagaaaccc240gaagaagccaagccgtgctccctacgaaaagggagtgccgtctcgaatggggcccccggg300taaggtgaggacacccgtagagtttagacaaataaataaccggaggaaagaaaccttaca360aggattcccctaataacggcgagcaagccgggttcagcccagcttgaaaaccgggggaat420ccggaccaggatctaacgtcaaga444當(dāng)前第1頁(yè)12