本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種生物合成的納米尺度吡咯結(jié)構(gòu)紅色素的粒徑調(diào)控方法。
技術(shù)背景
近年來(lái)，隨著環(huán)境問(wèn)題、能源問(wèn)題的出現(xiàn)，以及一部分合成色素對(duì)人體的致癌性和其他毒害作用的日益顯現(xiàn)，人們對(duì)色素的綠色環(huán)保、安全性以及可持續(xù)性的要求越來(lái)越高。天然色素以安全性高，具有良好的環(huán)境相容性、生物降解性和可持續(xù)性而受到廣泛關(guān)注，成為研究熱點(diǎn)。其中微生物色素的生產(chǎn)具有不受季節(jié)、氣候和地域限制，生產(chǎn)周期短，條件易于控制，產(chǎn)量大，種類豐富等優(yōu)點(diǎn)，被開發(fā)利用的潛力巨大，同時(shí)保護(hù)了環(huán)境和生態(tài)平衡，解決了資源短缺的矛盾，具有可持續(xù)開發(fā)利用的優(yōu)勢(shì)。
吡咯結(jié)構(gòu)色素是生物合成色素中的重要種類，是微生物的次生代謝產(chǎn)物，可由細(xì)菌、放線菌和霉菌獲得。其中，具有3吡咯環(huán)的紅色色素研究較多，該色素易溶于甲醇、乙醇、丙酮、dmf、乙酸乙酯、氯仿和苯，幾乎不溶于水。該色素主要分布在細(xì)胞內(nèi)，色素的提取需要進(jìn)行細(xì)胞破碎。由于此色素水溶性很低，色素提取要使用有機(jī)溶劑。
許多種類的微生物色素都有水溶性低的問(wèn)題，而且許多色素都存在于菌體內(nèi)部。如何在不使用有機(jī)溶劑的情況下制備具有良好加工性能的色素分散液，是微生物胞內(nèi)色素在應(yīng)用時(shí)亟待解決的問(wèn)題。同時(shí)，色素分散液的穩(wěn)定性也至關(guān)重要，這決定了其可以存放的時(shí)間和使用期限。而色素顆粒的粒徑大小是決定色素分散液穩(wěn)定性的最主要影響因素。如何實(shí)現(xiàn)對(duì)分散液中色素顆粒大小的調(diào)控，從而增加其分散穩(wěn)定性，同樣值得研究。
本研究通過(guò)對(duì)微生物菌株的改造和培養(yǎng)過(guò)程的改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了生物合成吡咯結(jié)構(gòu)紅色色素的粒徑調(diào)控，獲得了納米粒徑的吡咯結(jié)構(gòu)紅色色素，并實(shí)現(xiàn)了由細(xì)胞分泌進(jìn)入發(fā)酵液中納米色素在發(fā)酵液中的均勻分散，由此獲得由納米色素顆粒形成的穩(wěn)定分散液。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)改變發(fā)酵條件實(shí)現(xiàn)對(duì)納米尺度吡咯結(jié)構(gòu)紅色素的粒徑調(diào)控方法。
本發(fā)明所述的一種生物合成的納米尺度吡咯結(jié)構(gòu)紅色素的粒徑調(diào)控方法，包括：
(1)將粘質(zhì)沙雷氏菌在平板培養(yǎng)基上劃線，選擇顏色最紅的單菌落挑出，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，移取5ml菌液至直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，功率為15w的紫外線燈管距離30cm照射5～20min，避光保存8-24h后，轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后再轉(zhuǎn)接到選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后測(cè)λ＝540nm的吸光度值，然后以10％的接種量轉(zhuǎn)接到新的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后測(cè)λ＝540nm的吸光度值，再轉(zhuǎn)接至新的選擇培養(yǎng)基中，直至吸光度不再增加。分別取菌液0.1ml涂布10個(gè)平板，選擇顏色最紅的單菌落挑出，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入氯化鋰使其濃度為0.1～1.5％，保溫0.5～10min，取菌液5ml轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后再轉(zhuǎn)接到選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后測(cè)λ＝540nm的吸光度值，然后以10％的接種量轉(zhuǎn)接到新的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后測(cè)λ＝540nm的吸光度值，再轉(zhuǎn)接至新的選擇培養(yǎng)基中，直至吸光度不再增加。分別取菌液0.1ml涂布10個(gè)平板，選擇顏色最紅的單菌落挑出，作為改造完成的高產(chǎn)工程菌株。
(2)將高產(chǎn)菌株接入種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速120～200rpm，培養(yǎng)時(shí)間6～24h。
(3)將種子培養(yǎng)液接入含有非離子表面活性劑體系a的改良的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)48～144h后將發(fā)酵液在10000rpm，10℃下離心10min，去除菌體，得納米尺度吡咯結(jié)構(gòu)紅色素懸浮液。
步驟(2)所述的種子培養(yǎng)液中，1l培養(yǎng)基中含有如下成分：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉3g，氯化鉀2g，ph5.0～7.0。
步驟(3)所述的改良的發(fā)酵培養(yǎng)基中，1l培養(yǎng)基中含有如下成分：蛋白胨15g，丙三醇3g，硫酸鎂2g，氯化鈉3g，氯化鉀2g，ph5.0～8.0。
步驟(3)所述的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25～28℃，搖床轉(zhuǎn)速150～250rpm，時(shí)間48～144h，避光培養(yǎng)。
步驟(3)所述的表面活性劑體系a的組成為0～40g/l的吐溫-80，0～40g/l的蔗糖脂肪酸酯和0～40g/l的脂肪醇聚氧乙烯醚。
經(jīng)本發(fā)明制得的納米尺度吡咯結(jié)構(gòu)紅色素懸浮液，具有良好的穩(wěn)定性，經(jīng)高速離心色素不沉降，放置一個(gè)月底部幾乎無(wú)色素沉降。吡咯結(jié)構(gòu)紅色素的平均粒徑可在150～800nm之間進(jìn)行控制。且該發(fā)明可應(yīng)用于其他非水溶性微生物色素，通過(guò)微生物發(fā)酵的方法直接生產(chǎn)納米色素懸浮液。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是：
(1)本發(fā)明的納米尺度吡咯結(jié)構(gòu)紅色素懸浮液的生物制備方法簡(jiǎn)單，直接由微生物發(fā)酵制得，無(wú)需使用有機(jī)溶劑從菌體內(nèi)部提取色素，更不需要一般分散液的復(fù)雜制備過(guò)程，對(duì)設(shè)備的要求低，綠色環(huán)保。
(2)本發(fā)明對(duì)色素粒徑的調(diào)控方法簡(jiǎn)單，只需改變發(fā)酵液成分和發(fā)酵條件即可實(shí)現(xiàn)對(duì)納米色素粒徑的調(diào)控。
具體實(shí)施方式
針對(duì)本發(fā)明一種生物合成的納米尺度吡咯結(jié)構(gòu)紅色素的粒徑調(diào)控方法，采用下列方式具體實(shí)施。但本發(fā)明所述的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1
平均粒徑為253.8nm的吡咯結(jié)構(gòu)紅色素懸浮液的制備。
將高產(chǎn)粘質(zhì)沙雷氏菌菌株接入種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，培養(yǎng)時(shí)間15h。然后將種子液按照2.0％接種至改良的發(fā)酵培養(yǎng)基(蛋白胨15g/l，甘油3g/l，吐溫-8018g/l，硫酸鎂2g/l，氯化鈉3g/l，氯化鉀2g/l)中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)84h，溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。然后將發(fā)酵液在10000rpm，10℃下離心10min，去除菌體，得平均粒徑為253.8nm的納米吡咯結(jié)構(gòu)紅色素懸浮液。
實(shí)施例2
平均粒徑為402.6nm的吡咯結(jié)構(gòu)紅色素懸浮液的制備。
將高產(chǎn)粘質(zhì)沙雷氏菌菌株接入種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，培養(yǎng)時(shí)問(wèn)20h。然后將種子液按照2.0％接種至改良的發(fā)酵培養(yǎng)基(蛋白胨15g/l，甘油3g/l，吐溫-8010g/l，硫酸鎂2g/l，氯化鈉3g/l，氯化鉀2g/l)中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)72h，溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。然后將發(fā)酵液在10000rpm，10℃下離心10min，去除菌體，得平均粒徑為402.6nm的納米吡咯結(jié)構(gòu)紅色素懸浮液。