本發(fā)明涉及一種中藥領(lǐng)域的方法，具體涉及一種提高金銀花中木犀草苷產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
：金銀花是常用的傳統(tǒng)中藥，金銀花中的化學(xué)成分類型多種多樣，主要包括黃酮類、有機(jī)酸類、環(huán)烯醚萜苷類、皂苷類、揮發(fā)油等化學(xué)成分，主要功能性成分是以綠原酸為代表的有機(jī)酸類和以木犀草苷為代表的黃銅類物質(zhì)。木犀草苷是體現(xiàn)金銀花藥理活性的主要化學(xué)成分之一，具有與很強(qiáng)的抗菌、抗病毒和抗癌等多種藥理作用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和日用品工業(yè)中。但是木犀草苷在金銀花中的含量很低，不同產(chǎn)地來(lái)源、品種在0.023％-0.193％范圍內(nèi)。因此，提高金銀花提取物中木犀草苷的獲得率具有巨大的應(yīng)用前景和潛在的經(jīng)濟(jì)效益。曲霉屬真菌是發(fā)酵工業(yè)和食品加工業(yè)的重要菌種，廣泛應(yīng)用于釀造和中藥發(fā)酵。研究表明，曲霉分泌的酶系強(qiáng)大，代謝產(chǎn)物豐富，其中黑曲霉、土曲霉、紅曲霉能有效轉(zhuǎn)化中藥材有效活性成分，獲得新的性味和功效。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中從金銀花中只能提取得到少量的木犀草苷，本發(fā)明提供了一種黑曲霉發(fā)酵金銀花來(lái)提高金銀花中木犀草苷含量的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案：一種黑曲霉發(fā)酵金銀花提高木犀草苷產(chǎn)量的方法，其特征在于：包括以下步驟：a)分離純化黑曲霉；b)制備黑曲霉孢子懸浮液待用；c)粉碎金銀花：用粉碎機(jī)將金銀花粉碎；d)制備發(fā)酵基質(zhì)：將一定質(zhì)量比的粉碎后的金銀花、大米和水裝于密閉容器中，浸泡一定時(shí)間后再進(jìn)行滅菌得到金銀花固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)；e)接種并發(fā)酵：取適量黑曲霉孢子懸浮液接種于金銀花固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中，在一定的溫度下發(fā)酵，發(fā)酵一定天數(shù)后得到發(fā)酵物，即可將發(fā)酵物用于提取木犀草苷。原理：分離純化出黑曲霉，接種于發(fā)酵基質(zhì)中并且在一定的條件下進(jìn)行發(fā)酵，將發(fā)酵后的金銀花進(jìn)行化學(xué)成分分析，并且將其與沒(méi)有發(fā)酵的金銀花的化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比，最后發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的金銀花中的木犀草苷含量顯著提高，綠原酸的含量明顯降低。這是因?yàn)榘l(fā)酵金銀花過(guò)程中，這種黑曲霉產(chǎn)生復(fù)雜多樣的胞外酶類，對(duì)金銀花化學(xué)成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化與修飾，改變了金銀花中木犀草苷與綠原酸的含量。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明采用從土壤中分離的一株黑曲霉發(fā)酵金銀花，發(fā)酵后的金銀花能夠直接作為原料應(yīng)用于木犀草苷的提取，如下表(發(fā)酵前與發(fā)酵后的含量測(cè)定結(jié)果表)所示，能夠在短時(shí)間內(nèi)顯著增加金銀花中木犀草苷的產(chǎn)量；并且本發(fā)明技術(shù)操作簡(jiǎn)單，發(fā)酵周期短，成本低廉，無(wú)污染，總的來(lái)看，其應(yīng)用前景廣闊。成分發(fā)酵前(mg/g)發(fā)酵后(mg/g)變化(mg/g)木犀草苷3.718.47+4.76具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種黑曲霉發(fā)酵金銀花提高木犀草苷產(chǎn)量的方法，包括以下步驟：a)從冬蟲(chóng)夏草周圍土壤中分離純化黑曲霉，形態(tài)與分子鑒定，25℃恒溫培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)成黑褐色時(shí)，這個(gè)時(shí)候的菌落處于旺盛期，挑取菌絲進(jìn)行平板劃線，最后得到純化的黑曲霉；b)將純化后的黑曲霉放入裝有無(wú)菌水的離心管中，搖床震蕩，制得4×106個(gè)/ml的孢子懸浮液待用；c)然后將金銀花放入高速粉碎機(jī)中粉碎；d)將粉碎的金銀花20g，大米5g，水25ml都置于300ml三角瓶中，浸泡30min后，然后再進(jìn)行滅菌，制得金銀花固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)；e)在固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中加入黑曲霉孢子懸浮液(質(zhì)量為發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量的8％)，溫度控制在25℃，發(fā)酵15天,這時(shí)菌絲布滿整個(gè)金銀花基質(zhì)，菌絲繁茂，得到金銀花的發(fā)酵產(chǎn)物，備用。對(duì)比實(shí)施例1包括以下步驟：a)將20g金銀花放入高速粉碎機(jī)中粉碎；b)將粉碎的金銀花20g，大米5g，水25ml都置于300ml三角瓶中，浸泡30min后，然后再進(jìn)行滅菌，制得金銀花固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)；c)將金銀花固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)放入室溫25℃的環(huán)境中，放置15天。效果實(shí)驗(yàn)例最后將實(shí)施例1中所得金銀花的發(fā)酵產(chǎn)物與對(duì)比實(shí)施例1中的沒(méi)有經(jīng)過(guò)發(fā)酵的金銀花通過(guò)醇提法提取活性成分，并測(cè)定提取物中的木犀草苷的含量，其過(guò)程為：將發(fā)酵產(chǎn)物/直接粉碎物放置于烘箱中干燥，干燥溫度為35℃，時(shí)間為5h；用高速粉碎機(jī)對(duì)干燥后的發(fā)酵產(chǎn)物/直接粉碎物進(jìn)行粉碎，粉碎后過(guò)60目篩子；稱取篩子篩下的發(fā)酵產(chǎn)物/直接粉碎物20g，加入200ml95％乙醇，浸泡過(guò)夜，再用超聲波處理器超聲提取三次，每次30min，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液(40℃)，旋干后稱重，再用甲醇定容，使得最后得到金銀花提取液濃度為20mg/ml。采用高效液相色譜法測(cè)定金銀花提取液中木犀草苷的含量，具體的實(shí)驗(yàn)操作方法如下：agilent1100高效液相色譜儀，四級(jí)桿泵，手動(dòng)進(jìn)樣器以及二極管陣列檢測(cè)器。色譜條件為ageladurashellc18色譜柱(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相乙腈-水-0.4％磷酸溶液；梯度洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng):0-20min為210nm，10-30min為350nm；柱溫30℃；流速：1ml/min，進(jìn)樣量10μl，結(jié)果如下表所示，明顯看出發(fā)酵后的金銀花中木犀草苷的含量明顯提高。成分沒(méi)有經(jīng)過(guò)發(fā)酵(mg/g)發(fā)酵產(chǎn)物(mg/g)變化(mg/g)木犀草苷3.718.47+4.76實(shí)施例2一種黑曲霉發(fā)酵金銀花提高木犀草苷產(chǎn)量的方法，包括以下步驟：a)從冬蟲(chóng)夏草周圍土壤中分離純化黑曲霉，形態(tài)與分子鑒定，26℃恒溫培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)成黑褐色時(shí)，這個(gè)時(shí)候的菌落處于旺盛期，挑取菌絲進(jìn)行平板劃線，最后得到純化的黑曲霉；b)將純化后的黑曲霉裝入裝有無(wú)菌水的離心管中，搖床震蕩，制得3×107個(gè)/ml的孢子懸浮液待用；c)然后將金銀花放入高速粉碎機(jī)中粉碎；d)將粉碎的金銀花28g，大米7g，水35ml都置于300ml三角瓶中，浸泡40min后，然后再進(jìn)行滅菌，制得金銀花固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)；e)在固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中加入黑曲霉孢子懸浮液(質(zhì)量為發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量的8％)，溫度控制在26℃，發(fā)酵20天,這時(shí)菌絲布滿整個(gè)金銀花基質(zhì)，菌絲生長(zhǎng)茂盛，得到金銀花的發(fā)酵產(chǎn)物，備用。對(duì)比實(shí)施例2包括以下步驟：a)將28g金銀花放入高速粉碎機(jī)中粉碎；b)將粉碎的金銀花28g，大米7g，水35ml都置于300ml三角瓶中，浸泡40min后，然后再進(jìn)行滅菌，制得金銀花固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)；c)將金銀花固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)放入室溫26℃的環(huán)境中，放置20天。效果實(shí)驗(yàn)例最后將實(shí)施例2中所得金銀花的發(fā)酵產(chǎn)物與對(duì)比實(shí)施例2中的沒(méi)有經(jīng)過(guò)發(fā)酵的金銀花通過(guò)醇提法提取化學(xué)成分，并測(cè)定提取物中的木犀草苷的含量，其過(guò)程為：將發(fā)酵產(chǎn)物/直接粉碎物放置于烘箱中干燥，干燥溫度為35℃，時(shí)間為5h；用高速粉碎機(jī)對(duì)干燥后的金銀花進(jìn)行粉碎，粉碎后過(guò)60目篩子，留取篩子篩下的金銀花；稱取篩子篩下的金銀花20g，加入200ml95％乙醇，浸泡過(guò)夜，再用超聲波處理器超聲提取三次，每次30min，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液(40℃)，旋干后稱重，再用甲醇定容，使得最后得到金銀花提取液濃度為20mg/ml。采用高效液相色譜法測(cè)定金銀花提取液中木犀草苷的含量，具體的實(shí)驗(yàn)操作方法如下：agilent1100高效液相色譜儀，四級(jí)桿泵，手動(dòng)進(jìn)樣器以及二極管陣列檢測(cè)器。色譜條件為ageladurashellc18色譜柱(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相乙腈-水-0.4％磷酸溶液；梯度洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng):0-20min為210nm，10-30min為350nm；柱溫30℃；流速：1ml/min，進(jìn)樣量10μl。結(jié)果如下表所示，明顯看出發(fā)酵后的金銀花中木犀草苷的含量明顯提高。成分沒(méi)有經(jīng)過(guò)發(fā)酵(mg/g)發(fā)酵產(chǎn)物(mg/g)變化(mg/g)木犀草苷3.7110.21+6.5實(shí)施例3一種黑曲霉發(fā)酵金銀花提高木犀草苷產(chǎn)量的方法，包括以下步驟：a)從冬蟲(chóng)夏草周圍土壤中分離純化黑曲霉，形態(tài)與分子鑒定，28℃恒溫培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)成金黃色時(shí)，這個(gè)時(shí)候的菌落處于旺盛期，挑取菌絲進(jìn)行平板劃線，最后得到純化的黑曲霉；b)將純化后的黑曲霉放入裝有無(wú)菌水的容器中，搖床震蕩，制得4×106個(gè)/ml的孢子懸浮液待用；c)將金銀花放入高速粉碎機(jī)中粉碎；d)將粉碎的金銀花16g，大米4g，水20ml都置于300ml三角瓶中，浸泡20min后，然后再進(jìn)行滅菌，制得金銀花固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)；e)在固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中加入黑曲霉孢子懸浮液(質(zhì)量為發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量的8％)，溫度控制在28℃，發(fā)酵10天,這時(shí)菌絲布滿整個(gè)金銀花基質(zhì)，且菌絲色澤金黃，得到金銀花的發(fā)酵產(chǎn)物，備用。對(duì)比實(shí)施例3包括以下步驟：a)將16g金銀花放入高速粉碎機(jī)中粉碎；b)將粉碎的金銀花16g，大米4g，水20ml都置于300ml三角瓶中，浸泡20min后，然后再進(jìn)行滅菌，制得金銀花固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)；c)將金銀花固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)放入室溫28℃的環(huán)境中，放置10天。效果實(shí)驗(yàn)例.最后將實(shí)施例3中的發(fā)酵后的金銀花與對(duì)比實(shí)施例3中的沒(méi)有經(jīng)過(guò)發(fā)酵的金銀花通過(guò)醇提法進(jìn)行提取活性成分，并測(cè)定提取物中的木犀草苷的含量，其過(guò)程為：將發(fā)酵產(chǎn)物/直接粉碎物放置于烘箱中干燥，干燥溫度為35℃，時(shí)間為5h；用高速粉碎機(jī)對(duì)干燥后的金銀花進(jìn)行粉碎，粉碎后過(guò)60目篩子，留取篩子篩下的金銀花；稱取篩子篩下的金銀花20g，加入200ml95％乙醇，浸泡過(guò)夜，再用超聲波處理器超聲提取三次，每次30min，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液(40℃)，旋干后稱重，再用甲醇定容，使得最后得到金銀花提取液濃度為20mg/ml。采用高效液相色譜法測(cè)定金銀花提取液中木犀草苷的含量，具體的實(shí)驗(yàn)操作方法如下：agilent1100高效液相色譜儀，四級(jí)桿泵，手動(dòng)進(jìn)樣器以及二極管陣列檢測(cè)器。色譜條件為ageladurashellc18色譜柱(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相乙腈-水-0.4％磷酸溶液；梯度洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng):0-20min為210nm，10-30min為350nm；柱溫30℃；流速：1ml/min，進(jìn)樣量10μl，結(jié)果如下表所示，明顯看出發(fā)酵后的金銀花中木犀草苷的含量明顯提高。成分沒(méi)有經(jīng)過(guò)發(fā)酵(mg/g)發(fā)酵產(chǎn)物(mg/g)變化(mg/g)木犀草苷3.718.21+4.5當(dāng)前第1頁(yè)12