本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的制備方法及通過(guò)該方法獲得的病毒樣顆粒，屬于生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)亞單位疫苗制備過(guò)程中，由pcv2-orf2基因編碼的cap蛋白具有折疊為pcv2病毒樣顆粒(vlp)的潛力而被作為pcv2亞單位疫苗抗原。在利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行pcv2cap蛋白重組表達(dá)過(guò)程中，工業(yè)化條件下過(guò)表達(dá)的pcv2cap重組蛋白(rpcv2cap)未與促溶蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，常常在細(xì)胞中堆積，形成不溶的形式的顆粒包涵體(inclusionbody，ib)；由ib形態(tài)的rpcv2cap復(fù)性至蛋白天然構(gòu)象或vlp具有較高的難度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的制備方法，蛋白復(fù)性效率高，以切向流超濾的方式，可將包涵體持續(xù)、大量地制備得到病毒樣顆粒，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過(guò)采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的制備方法，包括，

豬圓環(huán)病毒2型cap重組蛋白包涵體的制備步驟：

將編碼cap蛋白的pcv2-orf2基因全長(zhǎng)dna(序列如seqidno.1所示)或已去掉編碼cap蛋白n’端信號(hào)肽(41個(gè)氨基酸殘基)堿基序列的pcv2-orf2dna片段(序列如seqidno.2所示)插入原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌，誘導(dǎo)表達(dá)cap重組蛋白；cap重組蛋白以包涵體形式存在細(xì)胞質(zhì)中，破碎細(xì)胞取沉淀，然后對(duì)沉淀中的包涵體進(jìn)行純化；

cap重組蛋白包涵體變性步驟：

在4℃的條件下，將包涵體溶解于buffer-s0中，4℃離心，取第一上清液；在0-4℃的條件下，將第一上清液加至buffer-s1中，充分混合后有蛋白析出，4℃離心取蛋白沉淀；將蛋白沉淀溶解于buffer-s2中，4℃條件下震蕩至少8h，然后離心取第二上清液；測(cè)定第二上清液中總蛋白濃度，添加buffer-s2將第二上清液稀釋至蛋白的濃度為20-400μg/ml，得到變性蛋白溶液；

溶液置換及蛋白復(fù)性步驟：

在切向流超濾系統(tǒng)中，采用恒體積透析法對(duì)變性蛋白溶液進(jìn)行溶液置換及蛋白復(fù)性；以buffer-rf作為置換液，超濾過(guò)程中，中空纖維膜或膜包的孔徑為5-8kd；超濾參數(shù)為：跨膜壓tmp＝4.0-7.0psi，膜通量1.572±0.756lmh，剪切力shear＝3727-3773s^-1，收集含復(fù)性蛋白的一次超濾溶液；

病毒樣顆粒組裝和回收步驟：

在2-8℃條件下，將一次超濾溶液加至buffer-as中，然后在2-8℃條件下靜置6-18h，得到回收溶液；切向流超濾系統(tǒng)中，使用孔徑為50kd的中空纖維膜或膜包，以pbs作為置換液對(duì)回收溶液進(jìn)行超濾，濃縮；超濾參數(shù)為：跨膜壓tmp＝8-13psi，膜通量21.631±4.366lmh，剪切力shear＝3019-3098s^-1，收集二次超濾溶液，離心取沉淀，得到豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒。

進(jìn)一步地，豬圓環(huán)病毒2型cap重組蛋白包涵體的制備步驟中，對(duì)包涵體進(jìn)行純化為使用含有2mol/l尿素的緩沖液對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％的tritonx-100溶液去除包涵體中的膜碎片和膜蛋白。

進(jìn)一步地，cap重組蛋白包涵體變性步驟中，buffer-s0包括20-100mmtris-cl，30-100mmnacl，50-150mm2-me，5-7m鹽酸胍，ph為11.5-12.5。

進(jìn)一步地，cap重組蛋白包涵體變性步驟中，buffer-s1包括20-100mmtris-cl，30-100mmnacl，50-150mm2-me，ph為8-9。

進(jìn)一步地，cap重組蛋白包涵體變性步驟中，第一上清液與buffer-s1的體積比為1:5-20。

進(jìn)一步地，cap重組蛋白包涵體變性步驟中，buffer-s2包括20-100mmtris-cl，30-100mmnacl，50-150mm2-me，6-8m尿素，ph為11.5-12.5。

進(jìn)一步地，溶液置換及蛋白復(fù)性步驟中，buffer-rf包括20-80mmtris-cl，80-200mmnacl，0.5-2mmedta，1-10mm2-me，5-10％甘油，3-8％peg4000，100-300mml-精氨酸，0.1-0.5％triton-x100，ph為5.5-6.5。

進(jìn)一步地，病毒樣顆粒組裝和回收步驟中，利用蠕動(dòng)泵，泵速20～50ml/min條件下將一次超濾溶液加至buffer-as中，一次超濾溶液和buffer-as的體積比為1:15-25。

進(jìn)一步地，病毒樣顆粒組裝和回收步驟中，buffer-as包括100-300mm檸檬酸銨，2-3％異丙醇，4-8％peg4000，ph5-6。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過(guò)采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒，通過(guò)上述的方法制備得到。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明的制備方法中，通過(guò)針對(duì)性地設(shè)計(jì)試劑，并配合制備步驟，在溶液置換及蛋白復(fù)性步驟中以中空纖維膜或膜包除去小分子量雜蛋白，病毒樣顆粒組裝和回收步驟中利用中空纖維膜或膜包除去未折疊為病毒樣顆粒的雜蛋白，使得pcv2cap重組蛋白原材料無(wú)需與親和層析去除標(biāo)簽蛋白或促溶融合蛋白融合表達(dá)；

2、本發(fā)明的制備方法中，蛋白復(fù)性效率高，并能穩(wěn)定折疊形成pcv2vlp；

3、本發(fā)明的制備方法中，利用切向流超濾的方式對(duì)pcv2vlp進(jìn)行收集，回收率較高；

4、本發(fā)明的制備方法中，將中空纖維膜或膜包串聯(lián)，通過(guò)本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)將包涵體大量、連續(xù)地制備病毒樣顆粒，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1電泳圖；

圖2為實(shí)施例1透射電鏡圖；

圖3為實(shí)施例2電泳圖；

圖4為實(shí)施例2透射電鏡圖。

具體實(shí)施方式

下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：

1、準(zhǔn)備材料：

配制溶液：

buffer-s0：20-100mmtris-cl，30-100mmnacl，50-150mm2-me，5-7m鹽酸胍，ph為11.5-12.5。

buffer-s1：20-100mmtris-cl，30-100mmnacl，50-150mm2-me，ph為8-9。

buffer-s2：20-100mmtris-cl，30-100mmnacl，50-150mm2-me，6-8m尿素，ph為11.5-12.5。

buffer-rf：20-80mmtris-cl，80-200mmnacl，0.5-2mmedta，1-10mm2-me，5-10％甘油，3-8％peg4000，100-300mml-精氨酸，0.1-0.5％triton-x100，ph為5.5-6.5。

buffer-as：100-300mm檸檬酸銨，2-3％異丙醇，4-8％peg4000，ph5-6。

對(duì)中空纖維膜或膜包進(jìn)行預(yù)清洗和膜潤(rùn)濕、標(biāo)準(zhǔn)水透過(guò)率(nwp)測(cè)定、完整性測(cè)試。

2、一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的制備方法，包括，

豬圓環(huán)病毒2型cap重組蛋白包涵體的制備步驟：

將編碼cap蛋白的pcv2-orf2基因全長(zhǎng)dna或已去掉編碼cap蛋白n’端信號(hào)肽堿基序列的pcv2-orf2dna片段插入原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌，誘導(dǎo)表達(dá)cap重組蛋白；cap重組蛋白以包涵體形式存在細(xì)胞質(zhì)中，破碎細(xì)胞取沉淀，然后使用含有2mol/l尿素的緩沖液對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％的tritonx-100溶液去除包涵體中的膜碎片和膜蛋白，得到包涵體，包涵體的純度為84.5％。

cap重組蛋白包涵體變性步驟：

在4℃的條件下，將包涵體溶解于10倍體積(m/v)的buffer-s0中，4℃離心，取第一上清液；在0-4℃的條件下，將第一上清液加至5-20倍體積(m/v)的buffer-s1中，充分混合后有蛋白析出，4℃離心取蛋白沉淀；將蛋白沉淀溶解于100倍體積的buffer-s2中，4℃條件下震蕩至少8h，然后離心取第二上清液；測(cè)定第二上清液中總蛋白濃度，添加buffer-s2將第二上清液稀釋至蛋白的濃度為20-400μg/ml，得到變性蛋白溶液；

溶液置換及蛋白復(fù)性步驟：

在切向流超濾系統(tǒng)中，采用恒體積透析法對(duì)變性蛋白溶液進(jìn)行溶液置換及蛋白復(fù)性；以buffer-rf作為置換液，超濾過(guò)程中，聚醚砜中空纖維膜或膜包的孔徑為5-8kd(蛋白分子量的1/5-1/3大小)；超濾參數(shù)為：跨膜壓tmp＝4.0-7.0psi，膜通量1.572±0.756lmh，剪切力shear＝3727-3773s^-1，收集含復(fù)性蛋白的一次超濾溶液；

病毒樣顆粒組裝和回收步驟：

在2-8℃條件下，利用蠕動(dòng)泵，泵速20～50ml/min條件下將一次超濾溶液加至15-25倍體積的buffer-as中，然后在2-8℃條件下靜置6-18h，得到回收溶液；切向流超濾系統(tǒng)中，孔徑為50kd的聚醚砜中空纖維膜或膜包，以pbs作為置換液對(duì)回收溶液進(jìn)行超濾，濃縮；超濾參數(shù)為：跨膜壓tmp＝8-13psi，膜通量21.631±4.366lmh，剪切力shear＝3019-3098s^-1，收集二次超濾溶液，對(duì)二次超濾溶液進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，取沉淀，得到經(jīng)純化的豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒，進(jìn)行電鏡分析。

實(shí)施例1

配制溶液：

buffer-s0：60mmtris-cl，100mmnacl，150mm2-me，7m鹽酸胍，ph為12.4。

buffer-s1：50mmtris-cl，50mmnacl，100mm2-me，ph為9.3。

buffer-s2：60mmtris-cl，100mmnacl，150mm2-me，8m尿素，ph為12.1。

buffer-rf：60mmtris-cl，150mmnacl，0.5mmedta，2mm2-me，5％甘油，6％peg4000，100mml-精氨酸，0.1％triton-x100，ph為5.9。

buffer-as：200mm檸檬酸銨，2％異丙醇，7％peg4000，ph5.5。

pbs：8gnacl，0.2gkcl，3.63gna2hpo4·12h2o,0.24gkh2po4，溶于900ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)ph值至6.5，加水定容至1l。

本實(shí)施例使用的設(shè)備如下：

設(shè)備：spectrumkmpi切向流過(guò)濾系統(tǒng)(sym3-u20-a)

膜組件：spectrummicrokros中空纖維過(guò)濾柱：5kda、50kda，改性聚醚砜(mpes)，235cm²。

詳細(xì)步驟如下：

cap重組蛋白包涵體變性步驟：

按具體實(shí)施方式中豬圓環(huán)病毒2型cap重組蛋白包涵體的制備步驟，制備cap重組蛋白包涵體；

取1g重組蛋白包涵體，在4℃的條件下，將包涵體溶解于10mlbuffer-s0中，處理1h后，4℃12000rpm離心15min，取第一上清液；在0-4℃的條件下，將10ml第一上清液快速滴加至100ml的buffer-s1中，攪拌靜置30min，有蛋白析出，4℃8000rpm離心15min取蛋白沉淀；將蛋白沉淀溶解于150mlbuffer-s2中，4℃條件下震蕩至少8h，然后4℃12000rpm離心15min取第二上清液；bca蛋白定量試劑盒測(cè)定第二上清液中總蛋白濃度，添加buffer-s2將第二上清液稀釋至蛋白的濃度為80μg/ml，得到變性蛋白溶液；

溶液置換及蛋白復(fù)性步驟：

spectrumkmpi切向流過(guò)濾系統(tǒng)中，采用恒體積透析法對(duì)變性蛋白溶液進(jìn)行溶液置換及蛋白復(fù)性，buffer-rf作為置換液，使用孔徑5kd的聚醚砜中空纖維膜進(jìn)行超濾，超濾參數(shù)為：泵速100ml/min，平均shear＝3745±15s^-1，跨膜壓tmp＝4.5psi，膜通量1.632lmh，剪切力shear＝3727-3773s^-1，收集含復(fù)性蛋白的一次超濾溶液；；一次超濾溶液被濃縮至170ml，用30ml緩沖液沖洗管道，最終收集一次超濾溶液共200ml；

病毒樣顆粒組裝和回收步驟：

在2-8℃條件下，利用蠕動(dòng)泵，泵速25ml/min條件下將一次超濾溶液緩慢滴加至20倍體積的buffer-as中，然后在4℃條件下靜置6h，得到回收溶液；使用孔徑為50kd的聚醚砜中空纖維膜，用1000mlpbs作為置換液對(duì)200ml回收溶液進(jìn)行超濾，超濾參數(shù)為：泵速200ml/min，跨膜壓tmp＝10psi，膜通量22.431±3.756lmh，剪切力shear＝3047s^-1，得到二次超濾溶液25ml，用15ml緩沖液沖洗管道殘留，最終收集40ml二次超濾溶液，對(duì)二次超濾溶液進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，取沉淀，得到豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒。

檢測(cè)與評(píng)價(jià)：

1、sds-page電泳和pcv2vlp透射電鏡檢測(cè)：

電泳圖如圖1所示，可看出約25kda的條帶，應(yīng)用透射電鏡觀察濃縮、純化的濾液，電鏡下，可見(jiàn)大量球狀、直徑在15-20nm的病毒粒子，如圖2所示，粒子大小與pcv2病毒粒徑(17nm)一致。

2、參數(shù)分析：

按制備方法中的試劑倍量增加100倍，體積20l，8倍超濾，平均過(guò)濾速度1.632lmh，工藝時(shí)間按10.5h計(jì)算：所需中空纖維膜面積：20×8÷1.632÷10.5＝9.3㎡。即，在優(yōu)化參數(shù)條件下，選擇9.3㎡中空纖維柱，在相同時(shí)間內(nèi)可完成20l蛋白液復(fù)性工藝；

病毒樣顆粒回收：同樣，按制備方法中的增加100倍，體積20l，5倍超濾，平均過(guò)濾速度22.431lmh，工藝時(shí)間按1.4h計(jì)算：所需中空纖維膜面積：20×5÷22.431÷1.4＝3.2㎡。即，在優(yōu)化參數(shù)條件下，選擇3.2㎡中空纖維柱，在相同時(shí)間內(nèi)可完成20l復(fù)性蛋白中病毒樣顆?；厥?；

利用蛋白定量試劑盒分析，蛋白回收率為47.9％。

實(shí)施例2

配制溶液：

buffer-s0：80mmtris-cl，50mmnacl，150mm2-me，6m鹽酸胍，ph為11.8。

buffer-s1：80mmtris-cl，100mmnacl，50mm2-me，ph為9.0。

buffer-s2：80mmtris-cl，50mmnacl，150mm2-me，6m尿素，ph為12.5。

buffer-rf：80mmtris-cl，200mmnacl，1mmedta，10mm2-me，10％甘油，3％peg4000，200mml-精氨酸，0.4％triton-x100，ph為6.1。

buffer-as：250mm檸檬酸銨，2.8％異丙醇，6％peg4000，ph5.8。

pbs：8gnacl，0.2gkcl，3.63gna2hpo4·12h2o,0.24gkh2po4，溶于900ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)ph值至6.5，加水定容至1l。

本實(shí)施例使用的設(shè)備如下：

設(shè)備：sartoconslice200切向流超濾儀

膜組件：超濾膜包、材質(zhì)hydrosart，孔徑5kda、50kda、面積200cm²。

詳細(xì)步驟如下：

cap蛋白包涵體變性步驟：

按具體實(shí)施方式中豬圓環(huán)病毒2型cap重組蛋白包涵體的制備步驟，制備cap重組蛋白包涵體；

取1g重組蛋白包涵體，在4℃的條件下，將包涵體溶解于10mlbuffer-s0中，處理1.2h后，4℃12000rpm離心15min，取第一上清液；在0-4℃的條件下，將10ml第一上清液快速滴加至100ml的buffer-s1中，攪拌靜置30min，有蛋白析出，4℃8000rpm離心15min取蛋白沉淀；將蛋白沉淀溶解于50mlbuffer-s2中，4℃條件下震蕩至少8h，然后4℃12000rpm離心15min取第二上清液；bca蛋白定量試劑盒測(cè)定第二上清液中總蛋白濃度，添加buffer-s2將第二上清液稀釋至蛋白的濃度為370μg/ml，得到變性蛋白溶液；

溶液置換及蛋白復(fù)性步驟：

sartoconslice200切向流超濾儀中，采用恒體積透析法對(duì)變性蛋白溶液進(jìn)行溶液置換及蛋白復(fù)性，buffer-rf作為置換液，使用孔徑5kd的hydrosart膜包進(jìn)行超濾，超濾參數(shù)為：泵速100ml/min，跨膜壓tmp＝4.5psi，膜通量1.489lmh，剪切力shear＝3727-3773s^-1，收集含復(fù)性蛋白的一次超濾溶液；一次超濾溶液被濃縮至170ml，用30ml緩沖液沖洗管道，最終收集一次超濾溶液共200ml；

病毒樣顆粒組裝和回收步驟：

在2-8℃條件下，利用蠕動(dòng)泵，泵速25ml/min條件下將一次超濾溶液緩慢滴加至25倍體積的buffer-as中，然后在4℃條件下靜置6h，得到回收溶液；使用孔徑為50kd的hydrosart膜包，用1000mlpbs作為置換液對(duì)200ml回收溶液進(jìn)行超濾，超濾參數(shù)為：泵速200ml/min，跨膜壓tmp＝12psi，膜通量20.154±5.312lmh，剪切力shear＝3047s^-1，得到二次超濾溶液25ml，用15ml緩沖液沖洗管道殘留，最終收集40ml二次超濾溶液，對(duì)二次超濾溶液進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，取沉淀，得到豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒。

檢測(cè)與評(píng)價(jià)：

1、sds-page電泳和pcv2vlp透射電鏡檢測(cè)：

電泳圖如圖3所示，可看出約25kda的條帶，應(yīng)用透射電鏡觀察濃縮、純化的濾液，電鏡下，可見(jiàn)大量球狀、直徑在15-20nm的病毒粒子，如圖4所示，粒子大小與pcv2病毒粒徑(17nm)一致。

2、參數(shù)分析：

按制備方法中的試劑倍量增加100倍，體積20l，8倍超濾，平均過(guò)濾速度1.489lmh，工藝時(shí)間按11.8h計(jì)算：所需中空纖維膜面積：20×8÷1.489÷11.8＝9.1㎡。即，在優(yōu)化參數(shù)條件下，選擇9.1㎡左右超濾膜包，在相同時(shí)間內(nèi)可完成20l蛋白液復(fù)性工藝；

病毒樣顆粒回收：同樣，按制備方法中的增加100倍，體積20l，5倍超濾，平均過(guò)濾速度20.154lmh，工藝時(shí)間按1.7h計(jì)算：所需中空纖維膜面積：0×5÷20.154÷1.7＝2.92㎡。即，在優(yōu)化參數(shù)條件下，選擇2.92㎡中空纖維柱，在相同時(shí)間內(nèi)可完成20l復(fù)性蛋白中病毒樣顆粒回收；

利用蛋白定量試劑盒分析，蛋白回收率為42.6％。

對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司

<120>一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的制備方法及通過(guò)該方法獲得的病毒樣顆粒

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