本發(fā)明涉及一種用于抗生素生產(chǎn)的工業(yè)菌株及其篩選方法和在發(fā)酵領(lǐng)域中的應(yīng)用，具體涉及一種青霉素高產(chǎn)菌株及其篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
青霉素(penicillin)屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，是一種高效、低毒、臨床應(yīng)用廣泛的重要抗生素；青霉素還可以作為原料，合成一系列的半合成青霉素類(lèi)和半合成頭孢菌素類(lèi)抗生素。青霉素是由產(chǎn)黃青霉菌(penicilliumchrysogenum)在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)次級(jí)代謝而合成的。目前，產(chǎn)黃青霉菌優(yōu)良菌種的選育方法通常采用雜交育種、化學(xué)誘變劑誘變育種、物理誘變劑誘變育種和基因工程育種等，但篩選出來(lái)用于青霉素發(fā)酵的產(chǎn)黃青霉菌菌種，其生產(chǎn)能力較低。王成等公開(kāi)了一種利用高能電子照射青霉素孢子的誘變方法(王成，張軍剪，尹貴超.產(chǎn)黃青霉菌高能電子誘變選育.煤炭與化工2014，37(2)：68-69.)，該方法利用高能電子直接誘變青霉素孢子，由于真菌孢子壁厚，具有照射劑量大，致死率高，突變率低等缺點(diǎn)；利用高濃度苯乙酸平板篩選耐受高濃度苯乙酸的突變株，篩選得到的突變株13-6-55號(hào)發(fā)酵單位比對(duì)照提高3.6％，其提高幅度較低，而且苯乙酸加入量增多。在青霉素發(fā)酵領(lǐng)域，如何提高青霉素菌種的發(fā)酵能力，進(jìn)而提高青霉素產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，一直是本領(lǐng)域生產(chǎn)企業(yè)及科研人員的重點(diǎn)研究課題和努力的方向。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何提供一種青霉素高產(chǎn)突變株幾率高的青霉素及其篩選方法和應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種青霉素高產(chǎn)菌株，該菌株的名稱(chēng)為產(chǎn)黃青霉(penicilliumchrysogenum)b131536，保藏編號(hào)為cgmccno.13576，保藏日期為2017年1月9日，保藏單位為cgmcc-中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
本發(fā)明所提供的b131536菌株其微生物學(xué)特征如下：
單菌落的形態(tài)為：菌落呈白色、圓形、中間凸起、菌落布滿(mǎn)規(guī)則褶皺；孢子呈白色或灰白色，顯微鏡下孢子呈圓形。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
一種青霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法，包括以下步驟：
(a)原生質(zhì)體制備：
a-1)將出發(fā)菌株接種到菌絲培養(yǎng)基搖瓶中培養(yǎng)，得到菌絲培養(yǎng)液；
a-2)將菌絲培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理，棄上清液，向下層沉淀中加入等體積的無(wú)菌水，振蕩后再離心處理；棄上層清液后加入緩沖液，攪拌后離心，棄去上清后在下層沉淀中加入lyzingenzymesl-1412混合酶，水浴中振蕩進(jìn)行酶解，得到酶解液；
a-3)將酶解液過(guò)濾除去殘余未酶解的菌絲，離心收集，得到原生質(zhì)體，用緩沖液洗滌兩次，鏡檢計(jì)數(shù)，原生質(zhì)體懸液濃度達(dá)到107/ml時(shí)，停止酶解，將原生質(zhì)體懸液裝入至兩組無(wú)菌西林瓶中，備用；
(b)高能電子誘變：利用電子直線(xiàn)加速器照射的一組西林瓶中的原生質(zhì)體懸液；
(c)理性化篩選：將照射組的原生質(zhì)體懸液和未經(jīng)照射組的原生質(zhì)體懸液分別稀釋后，涂布在含有等滲分離培養(yǎng)基皿中進(jìn)行培養(yǎng)，并從照射組中挑選目標(biāo)菌落；
(d)搖瓶篩選：
d-1)將目標(biāo)菌落接種到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，斜面上菌種成熟后進(jìn)行搖瓶初篩，將斜面挖塊兒接種到種子培養(yǎng)基搖瓶中培養(yǎng)，菌種成熟后將其接種到30～40ml發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶中培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；
d-2)測(cè)定兩組發(fā)酵液中青霉素的效價(jià)，效價(jià)高于未經(jīng)照射組15％的發(fā)酵液所對(duì)應(yīng)的菌株再次進(jìn)行搖瓶篩選確認(rèn)，搖瓶復(fù)篩與步驟(d-1)相同，搖瓶篩選發(fā)酵液中青霉素效價(jià)最高的發(fā)酵液對(duì)應(yīng)的菌株即為高產(chǎn)的產(chǎn)黃青霉菌。
本發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)在于：步驟a-1)所用的菌絲培養(yǎng)基按質(zhì)量體積比加入，其成分組成為：蔗糖1.5～3.5％，蛋白胨0.5～2.5％，酵母粉1.5～3.0％，硫酸銨0.1～0.5％，磷酸二氫鉀0.1～0.6％，其余為蒸餾水，將菌絲培養(yǎng)基的ph調(diào)節(jié)至6.0±0.2，菌絲培養(yǎng)的溫度為25±0.5℃，相對(duì)濕度為40％～60％，培養(yǎng)2～3天，離心轉(zhuǎn)速為3000～4000rpm，離心時(shí)間為10～15min。
本發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)在于：步驟a-2)的緩沖液為0.7mol/l氯化鉀溶液與0.01mol/l磷酸溶液的混合液，緩沖液的ph為6.5，lyzingenzymesl-1412混合酶的重量百分?jǐn)?shù)為0.4％～0.5％，加入量為30～40ml，步驟a-3)中的溫度為30±0.5℃，水浴振蕩酶解的轉(zhuǎn)速為100～200r/min，時(shí)間為3～5小時(shí)。
本發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)在于：步驟(b)中采用的是bf-5型電子直線(xiàn)加速器，距離為20～30cm，輻射劑量為30～90gy/s，照射時(shí)間為10～90秒。
本發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)在于：步驟(c)中原生質(zhì)體懸液稀釋10-3～10-5倍，篩選的溫度為25±0.5℃，相對(duì)濕度40％～60％條件下避光培養(yǎng)12～15天，挑選的目標(biāo)菌落為誘變后菌落直徑大于未經(jīng)照射組的菌落直徑10％以上的菌落，所用等滲分離培養(yǎng)基按質(zhì)量體積比加入，其成分組成為：紅糖0.5～2.5％，酵母粉0.1～0.6％，甘油0.5～1.5％，氯化鈉0.5～2.0％，硫酸鈣0.01～0.08％，磷酸二氫鉀0.0005～0.002％，硫酸鎂0.0004～0.002％，硫酸銅0.0001～0.001％，硫酸亞鐵0.0001～0.001％，瓊脂1.5～2.0％，用0.7mol/l氯化鉀溶液配制，加入苯乙酸至0.4～0.6mg/ml，將菌絲培養(yǎng)基的ph調(diào)節(jié)至6.8±0.2。
本發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)在于：步驟(d)斜面培養(yǎng)的溫度是25±0.5℃，相對(duì)濕度40％～60％條件下避光培養(yǎng)5～8天，搖瓶中培養(yǎng)的溫度為25±0.5℃，相對(duì)濕度40％～60％，搖瓶培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為220～250rpm，培養(yǎng)時(shí)間為38～170小時(shí)。
一種利用青霉素高產(chǎn)菌株在青霉素發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用，將該高產(chǎn)菌株菌液接種到小米孢子培養(yǎng)基中，小米孢子成熟后接種到種子罐培養(yǎng)基中，菌種成熟后將其接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后制得青霉素發(fā)酵液。
本發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)在于：小米孢子培養(yǎng)的溫度是25±0.5℃，相對(duì)濕度40～60％條件下避光培養(yǎng)6～8天，種子罐培養(yǎng)基在25±0.5℃，120～150rpm，通氣比1:0.8～1:1.2的條件下培養(yǎng)60～70小時(shí)，發(fā)酵罐培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為25±0.5℃，100～130rpm，通氣比1:1～1:1.5，殘?zhí)呛?.01～0.03mg/ml，氨氮含量0.1～0.3mg/ml，苯乙酸含量0.2～0.3mg/ml，ph值6.2～6.6的條件下培養(yǎng)6～8天。
本發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)在于：所用小米孢子培養(yǎng)基，按質(zhì)量體積比計(jì)算，其成分組成為：蔗糖0.2～0.8％，玉米漿1.0～1.5％，氯化鈉0.1～0.3％，硫酸鎂0.0004～0.002％，硫酸亞鐵0.0001～0.001％。
由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明取得的技術(shù)進(jìn)步是：
本發(fā)明采用高能電子照射產(chǎn)黃青霉菌原生質(zhì)體的誘變方法，由于原生質(zhì)體去除了真菌表面較厚的細(xì)胞壁層，對(duì)物理誘變劑更加敏感，具有照射劑量小，致死率低，突變率高等的優(yōu)點(diǎn)。
苯乙酸作為前體對(duì)青霉素合成是必需的，但其對(duì)青霉素菌絲具有毒性，抑制青霉素菌絲的生長(zhǎng)，苯乙酸濃度越高對(duì)青霉素菌絲生長(zhǎng)抑制越強(qiáng)。本發(fā)明利用高能電子主動(dòng)誘變產(chǎn)黃青霉菌，使產(chǎn)黃青霉菌的基因組發(fā)生變化，然后利用含有較高濃度苯乙酸的平皿進(jìn)行初步篩選，該篩選方法更加具有針對(duì)性：挑選的目標(biāo)菌落為，誘變后菌落直徑大于對(duì)照菌落直徑10％以上的菌落，說(shuō)明目標(biāo)菌落對(duì)較高濃度苯乙酸具有耐受力；該篩選方法具有高通量特性：篩選條件簡(jiǎn)單，篩選的菌落數(shù)目多，符合篩選條件的菌落特征明顯。篩選得到的耐受苯乙酸的突變株在正常苯乙酸濃度下菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)會(huì)更好，產(chǎn)抗能力更強(qiáng)，在正常苯乙酸濃度下再利用搖瓶篩選青霉素效價(jià)高的菌株以得到高產(chǎn)菌株。本發(fā)明提供的青霉素高產(chǎn)菌株篩選方法優(yōu)點(diǎn)在于：誘變方法適合，篩選通量大，目的性強(qiáng)，經(jīng)過(guò)平皿和搖瓶雙重篩選。
本發(fā)明所述產(chǎn)黃青霉菌b131536經(jīng)菌株復(fù)試及穩(wěn)定性考察結(jié)果可知，其具有良好的傳代穩(wěn)定性，同時(shí)用于青霉素生產(chǎn)時(shí)，可以有效的提高青霉素的發(fā)酵單位和產(chǎn)量；本發(fā)明所述的誘變和篩選方法高效可靠。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明內(nèi)容做進(jìn)一步說(shuō)明：
一種青霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法，包括以下步驟，
(a)原生質(zhì)體制備：
a-1)將出發(fā)菌株即b1123號(hào)孢子液(華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司自有生產(chǎn)菌株)接種到菌絲培養(yǎng)基搖瓶中培養(yǎng)，得到菌絲培養(yǎng)液，其中菌絲培養(yǎng)基按質(zhì)量體積比加入，其成分組成為：蔗糖1.5～3.5％，蛋白胨0.5～2.5％，1酵母粉1.5～3.0％，硫酸銨0.1～0.5％，磷酸二氫鉀0.1～0.6％，其余為蒸餾水，將菌絲培養(yǎng)基的ph調(diào)節(jié)至6.0±0.2，菌絲培養(yǎng)的溫度為25±0.5℃，相對(duì)濕度為40％～60％，培養(yǎng)2～3天，離心轉(zhuǎn)速為3000～4000rpm，離心時(shí)間為10～15min；
a-2)將菌絲培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理，棄上清液，向下層沉淀中加入等體積的無(wú)菌水，振蕩后再離心處理；棄上層清液后加入緩沖液，攪拌后離心，棄去上清后在下層沉淀中加入lyzingenzymesl-1412混合酶，水浴中振蕩進(jìn)行酶解，得到酶解液，緩沖液為0.7mol/l氯化鉀溶液與0.01mol/l磷酸溶液的混合液，緩沖液的ph為6.5，lyzingenzymesl-1412混合酶的重量百分?jǐn)?shù)為0.4％～0.5％，加入量為30～40ml，步驟a-3)中的溫度為30±0.5℃，水浴振蕩酶解的轉(zhuǎn)速為100～200r/min，時(shí)間為3～5小時(shí)；
a-3)將酶解液過(guò)濾除去殘余未酶解的菌絲，離心收集，得到原生質(zhì)體，用緩沖液洗滌兩次，鏡檢計(jì)數(shù)，原生質(zhì)體懸液濃度達(dá)到107/ml時(shí)，停止酶解，將原生質(zhì)體懸液裝入至兩組無(wú)菌西林瓶中，備用；
(b)高能電子誘變：利用bf-5型電子直線(xiàn)加速器照射其中一組西林瓶中的原生質(zhì)體懸液，照射的距離為20～30cm，輻射劑量為30～90gy/s，照射時(shí)間為10～90秒；
(c)理性化篩選：將照射組的原生質(zhì)體懸液和未經(jīng)照射組的原生質(zhì)體懸液分別稀釋10-3～10-5倍后，篩選的溫度為25±0.5℃，相對(duì)濕度40％～60％條件下避光培養(yǎng)12～15天，涂布在含有等滲分離培養(yǎng)基皿中進(jìn)行培養(yǎng)，并挑選目標(biāo)菌落。；
(d)搖瓶篩選：
d-1)將目標(biāo)菌落接種到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，斜面培養(yǎng)的溫度是25±0.5℃，相對(duì)濕度40％～60％條件下避光培養(yǎng)5～8天，按質(zhì)量體積比計(jì)算，其組成成分為：紅糖0.5～2.5％，酵母粉0.1～0.6％，甘油0.5～1.5％，氯化鈉0.5～2.0％，硫酸鈣0.01～0.08％，磷酸二氫鉀0.0005～0.002％，硫酸鎂0.0004～0.002％，硫酸銅0.0001～0.001％，0硫酸亞鐵.0001～0.001％，瓊脂1.5～2.0％，用蒸餾水配制，將斜面培養(yǎng)基的ph調(diào)節(jié)至6.8±0.2；
斜面上菌種成熟后進(jìn)行搖瓶初篩，種子中培養(yǎng)的溫度為25±0.5℃，相對(duì)濕度40％～60％，搖瓶培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為220～250rpm，培養(yǎng)時(shí)間為38～45小時(shí)。將斜面挖塊兒接種到種子培養(yǎng)基搖瓶中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基按質(zhì)量體積比計(jì)算，其成分為：1.5～3.5％蔗糖，4.0～8.0％玉米漿，0.2～0.6％硫酸銨，0.4～1.0％碳酸鈣，用蒸餾水配制，將種子培養(yǎng)基的ph調(diào)節(jié)至5.8±0.2；
菌種成熟后將其接種到30～40ml發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度為25±0.5℃，相對(duì)濕度40％～60％，搖瓶培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為220～250rpm，培養(yǎng)時(shí)間為150-170小時(shí)，得到發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量體積比計(jì)算，其組成成分為：乳糖13～15％，麩質(zhì)粉0.3～0.6％，玉米漿4.0～8.0％，硫酸銨0.3～0.8％，磷酸二氫鉀0.2～0.7％，硫酸鈉0.1～0.3％，硫酸錳0.001～0.003％，硫酸亞鐵0.01～0.03％，碳酸鈣0.4～1.0％，用蒸餾水配制，將發(fā)酵培養(yǎng)基的ph調(diào)節(jié)至ph5.8±0.2，每天補(bǔ)入10％苯乙酸0.3ml。
d-2)測(cè)定兩組發(fā)酵液中青霉素的效價(jià)，效價(jià)高于未經(jīng)照射組15％的發(fā)酵液所對(duì)應(yīng)的菌株再次進(jìn)行搖瓶篩選確認(rèn)，搖瓶復(fù)篩與步驟(d-1)相同，搖瓶篩選發(fā)酵液中青霉素效價(jià)最高的發(fā)酵液對(duì)應(yīng)的菌株即為青霉菌高產(chǎn)菌株。
一種青霉素高產(chǎn)菌株在青霉素發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用，將該高產(chǎn)菌株菌液接種到小米孢子培養(yǎng)基中，小米孢子培養(yǎng)的溫度是25±0.5℃，相對(duì)濕度40～60％條件下避光培養(yǎng)6～8天，按質(zhì)量體積比計(jì)算小米孢子培養(yǎng)基，其成分組成為：蔗糖0.2～0.8％，玉米漿1.0～1.5％，氯化鈉0.1～0.3％，硫酸鎂0.0004～0.002％，硫酸亞鐵0.0001～0.001％；其制備方法為：將小米孢子培養(yǎng)基的ph調(diào)節(jié)至6.8±0.2，每100ml小米孢子培養(yǎng)基加入230～260克干燥的小米，攪勻后在消毒柜中100±2℃蒸20分鐘，將蒸好的米放在風(fēng)扇口吹涼、搓散，將小米分裝入茄子瓶中(20g/瓶)，將茄子瓶放入消毒柜121℃，30min即可。
小米孢子成熟后接種到種子罐培養(yǎng)基中，種子罐培養(yǎng)基在25±0.5℃，120～150rpm，通氣比1:0.8～1:1.2的條件下培養(yǎng)60～70小時(shí)，菌種成熟后將其接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為25±0.5℃，100～130rpm，通氣比1:1～1:1.5，殘?zhí)呛?.01～0.03mg/ml，氨氮含量0.1～0.3mg/ml，苯乙酸含量0.2～0.3mg/ml，ph值6.2～6.6的條件下培養(yǎng)6～8天培養(yǎng)后制得青霉素發(fā)酵液；按質(zhì)量體積比計(jì)算種子罐培養(yǎng)基，其組成成分為：蔗糖1.5～3.5％，玉米漿4.0～8.0％，硫酸銨0.2～0.6％，碳酸鈣0.1～0.6％，種子罐培養(yǎng)基用深井水配制，將種子培養(yǎng)基的ph調(diào)節(jié)至6.0±0.2；所用發(fā)酵罐培養(yǎng)基，按質(zhì)量體積比計(jì)算，其組成成分為：麩質(zhì)粉0.3～0.6％，玉米漿4.0～8.0％，硫酸銨0.3～0.8％，磷酸二氫鉀0.2～0.7％，硫酸鈉0.1～0.3％，0硫酸錳.001～0.003％，硫酸亞鐵0.01～0.03％，碳酸鈣0.1～0.6％；在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)入無(wú)菌的含量為90～95％葡萄糖，無(wú)菌的含量為28～30％硫酸銨，無(wú)菌的含量為18～20％氨水和無(wú)菌的含量為28～30％苯乙酸。
下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容做進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)施例1、(青霉素高產(chǎn)菌株的篩選)
菌絲培養(yǎng)基制備：稱(chēng)取2.5g蔗糖，1.5g蛋白胨，2.0g酵母粉，0.3g硫酸銨，0.4g磷酸二氫鉀，加蒸餾水定容至100ml，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至6.0±0.2，每個(gè)250ml三角瓶分裝30ml菌絲培養(yǎng)基，8層紗布封口，121℃下滅菌20min，冷卻后得菌絲培養(yǎng)基；
(a)原生質(zhì)體制備：
a-1)將出發(fā)菌株b1123號(hào)孢子液(華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司自有生產(chǎn)菌株)接種到30ml菌絲培養(yǎng)基搖瓶中，在25±0.5℃、相對(duì)濕度40％～60％條件下培養(yǎng)2天，獲得菌絲培養(yǎng)液；
a-2)取10ml培養(yǎng)液于無(wú)菌離心管中3000rpm離心10min，棄上清后加入10ml無(wú)菌水，轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠和10ml水的三角瓶中，220rpm振蕩20min，振蕩后取10ml移入無(wú)菌離心管3000rpm離心10min，棄上清后加入10mlpb等滲緩沖液(0.7mol/l氯化鉀溶液，0.01mol/l磷酸緩沖液，ph6.5)，用玻璃棒攪拌均勻后3000rpm離心10min，棄去上清后在沉淀中加入30ml0.4％濃度的lyzingenzymesl-1412混合酶(pb等滲緩沖液溶解)，30±0.5℃水浴100r/min振蕩酶解5小時(shí)，得到酶解液；
a-3)酶解液鏡檢有大量原生質(zhì)體釋放后，用2層紗布過(guò)濾除去大部分殘余未酶解的菌絲，加脫脂棉的無(wú)菌針管過(guò)濾幾次，至鏡檢無(wú)菌絲殘留，1500rpm離心收集原生質(zhì)體，用pb等滲緩沖液洗滌兩次，鏡檢計(jì)數(shù)，原生質(zhì)體懸液濃度約為107/ml，將原生質(zhì)體懸液裝入至兩組無(wú)菌西林瓶中，備用；
(b)高能電子誘變：利用bf-5型電子直線(xiàn)加速器照射裝入西林瓶中的原生質(zhì)體懸液，距離20cm、輻射劑量50gy/s、照射時(shí)間30秒；
(c)理性化篩選：
等滲分離培養(yǎng)基制備：稱(chēng)取150g紅糖，30g酵母粉，75g甘油，100g氯化鈉，4g硫酸鈣，0.08g磷酸二氫鉀，0.06g硫酸鎂，0.01g硫酸銅，0.02g硫酸亞鐵，180g瓊脂，加入苯乙酸至0.5mg/ml，用0.7mol/l氯化鉀溶液定容至10000ml，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至6.8±0.2，121℃下滅菌20min，滅菌完成后倒入無(wú)菌平皿中，自然冷卻凝固后得等滲分離培養(yǎng)基；
理性化篩選：將照射后的原生質(zhì)體懸液稀釋10-3倍，將對(duì)照原生質(zhì)體懸液稀釋10-5倍，稀釋后分別涂布在含有0.5mg/ml苯乙酸的等滲分離培養(yǎng)基平皿上，在25±0.5℃、相對(duì)濕度40％～60％條件下避光培養(yǎng)14天，挑選的目標(biāo)菌落為，誘變后菌落直徑大于對(duì)照菌落直徑10％以上的菌落；
(d)搖瓶篩選：
d-1)斜面培養(yǎng)基制備：稱(chēng)取稱(chēng)取30g紅糖，6g酵母粉，15g甘油，20g氯化鈉，0.8g硫酸鈣，0.016g磷酸二氫鉀，0.012g硫酸鎂，0.002g硫酸銅，0.004g硫酸亞鐵，36g瓊脂，蒸餾水定容至2000ml，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至6.8±0.2，121℃下滅菌20min，滅菌完成后分裝置若干試管中，鋪成斜面，凝固后得到斜面培養(yǎng)基；
種子培養(yǎng)基制備：稱(chēng)取25g蔗糖，60g玉米漿，3g硫酸銨，5g碳酸鈣，蒸餾水定容至1000ml，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至5.8±0.2，每個(gè)250ml三角瓶分裝30ml種子培養(yǎng)基，8層紗布封口，121℃下滅菌30min，冷卻后得種子培養(yǎng)基；
發(fā)酵培養(yǎng)基制備：稱(chēng)取390g乳糖，12g麩質(zhì)粉，180g玉米漿，12g硫酸銨，15g磷酸二氫鉀，6g硫酸鈉，0.006g硫酸錳，0.3g硫酸亞鐵，15g碳酸鈣，蒸餾水定容至3000ml，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至5.8±0.2，每個(gè)250ml三角瓶分裝30ml發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布封口，121℃下滅菌30min，冷卻后得發(fā)酵培養(yǎng)基；
d-2)測(cè)定兩組發(fā)酵液中青霉素的效價(jià)：挑取符合標(biāo)準(zhǔn)的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，在25±0.5℃、相對(duì)濕度40％～60％條件下避光培養(yǎng)7天，斜面菌種成熟后進(jìn)行搖瓶初篩，將斜面挖塊兒接種到30ml種子培養(yǎng)基搖瓶中，在25±0.5℃、相對(duì)濕度40％～60％、220rpm的條件下培養(yǎng)40小時(shí)，菌種成熟后將其接種到30ml發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶中，在25±0.5℃、相對(duì)濕度40％～60％、220rpm的條件下培養(yǎng)168小時(shí)，得到發(fā)酵液，hplc測(cè)定各發(fā)酵液中青霉素的效價(jià)，效價(jià)高于對(duì)照15％的發(fā)酵液所對(duì)應(yīng)的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，復(fù)篩過(guò)程同初篩，復(fù)篩和初篩發(fā)酵液中最高青霉素效價(jià)為28325μ/ml和28920μ/ml，將其對(duì)應(yīng)的菌株命名為高產(chǎn)黃青霉菌b131536；
將b131536菌株進(jìn)行超低溫冷凍保藏：向保存有b131536菌株的斜面中加入8ml含有20％甘油的無(wú)菌水溶液，用接種環(huán)將孢子刮下，混勻后用吸管分裝至冷凍管中(0.5ml/支)，注明菌株名稱(chēng)，制備時(shí)間和有效期，冷凍至超低溫冰箱中，其保藏單位是cgmcc-中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為cgmccno.13576，保藏日期為2017年1月9日。
實(shí)施例2、(青霉素高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性考察)
取實(shí)施例1中保藏的高產(chǎn)黃青霉菌b131536接種于實(shí)施例1制備的斜面培養(yǎng)基，在25±0.5℃、相對(duì)濕度40％～60％條件下避光培養(yǎng)7天，斜面菌種成熟后將其再次接種于斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，重復(fù)四次；將這五次培養(yǎng)出的菌株分別各自轉(zhuǎn)接至實(shí)施例1制備的種子培養(yǎng)基中，在25±0.5℃、相對(duì)濕度40％～60％、220rpm的條件下培養(yǎng)40小時(shí)，菌種成熟后各自轉(zhuǎn)至接實(shí)施例1制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25±0.5℃、相對(duì)濕度40％～60％、220rpm的條件下培養(yǎng)7天，制得五組含有青霉素的發(fā)酵液，hplc測(cè)定發(fā)酵液中青霉素的效價(jià)，按照傳代培養(yǎng)順序依次為：28423μ/ml、28122μ/ml、28905μ/ml、28268μ/ml、28750μ/ml；從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，高產(chǎn)黃青霉菌b131536具有較好的傳代穩(wěn)定性。
實(shí)施例3、(青霉素高產(chǎn)菌株的生產(chǎn)應(yīng)用)
小米孢子培養(yǎng)基制備：稱(chēng)取6g蔗糖，10g玉米漿，2g氯化鈉，0.008g硫酸鎂，0.005g硫酸亞鐵，用蒸餾水定容至1000ml，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至6.8±0.2，倒入裝有2400克干燥小米的鍋中，攪勻后在消毒柜中100±2℃蒸20分鐘，將蒸好的小米放在風(fēng)扇口吹涼、搓散，將小米分裝入茄子瓶中(20g/瓶)，將茄子瓶放入消毒柜中，121℃下滅菌30min，冷卻后得小米孢子培養(yǎng)基；
種子罐培養(yǎng)基制備：稱(chēng)取375kg蔗糖，900kg玉米漿，300kg硫酸銨，200kg碳酸鈣，用深井水定容至13m3，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至6.0±0.2，對(duì)種子罐進(jìn)行實(shí)消，121℃下滅菌30min，利用循環(huán)水冷卻，冷卻后得15m3種子培養(yǎng)基；
發(fā)酵罐培養(yǎng)基制備：稱(chēng)取180kg麩質(zhì)粉，2500kg玉米漿，135kg硫酸銨，160kg磷酸二氫鉀，120kg硫酸鈉，1kg硫酸錳，1kg硫酸亞鐵，400kg碳酸鈣，用深井水定容至40m3，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至6.0±0.2，對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行實(shí)消，121℃下滅菌30min，利用循環(huán)水冷卻，冷卻后得45m3發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)入無(wú)菌的含量為95％葡萄糖、無(wú)菌的含量為30％硫酸銨、無(wú)菌的含量為20％氨水和無(wú)菌的含量為30％苯乙酸；
高產(chǎn)菌株生產(chǎn)應(yīng)用：將高產(chǎn)菌株b131536菌液接種到小米孢子培養(yǎng)基中，在25±0.5℃、相對(duì)濕度40％～60％條件下避光培養(yǎng)7天，米孢子成熟后接種到15m3種子罐培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±0.5℃，轉(zhuǎn)速130rpm，通氣比1:1的條件下培養(yǎng)65小時(shí)，菌種成熟后將其接種到45m3發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，在25±0.5℃，110rpm，通氣比1:1.2殘?zhí)呛?.01mg/ml，氨氮含量0.2mg/ml，苯乙酸含量0.25mg/ml，ph值6.4的條件下培養(yǎng)7天，制得青霉素發(fā)酵液。將該生產(chǎn)過(guò)程重復(fù)三次，hplc測(cè)定發(fā)酵液中青霉素的效價(jià)，分別為126350μ/ml、128250μ/ml、127050μ/ml，平均值為127217μ/ml。
實(shí)施例4、(出發(fā)菌株對(duì)比實(shí)驗(yàn))
以高產(chǎn)黃青霉菌b131536的出發(fā)菌株b1123號(hào)孢子液(華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司自有生產(chǎn)菌株)為發(fā)酵菌株，采用實(shí)施例3的生產(chǎn)條件進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)發(fā)酵液中青霉素的效價(jià)，分別為112580μ/ml、113572μ/ml、110982μ/ml，平均值為112378μ/ml。比較出發(fā)菌株發(fā)酵液的平均效價(jià)與實(shí)施例3的發(fā)酵液效價(jià)可知，與出發(fā)株相比本發(fā)明所述的高產(chǎn)黃青霉菌b131536的青霉素發(fā)酵單位提高了13.2％。同樣發(fā)酵條件下，該菌株有效的提高了青霉素的產(chǎn)量，節(jié)約了生產(chǎn)成本。