本發(fā)明涉及一種中短鏈?；o酶a合成酶的應(yīng)用，特別涉及一種中短鏈?；o酶a合成酶在制備2-庚烯酰輔酶a、環(huán)己甲酰輔酶a中的應(yīng)用，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

輔酶a(coenzymea，coa)是酶促反應(yīng)期間有助于酰基活化和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵輔因子，在脂肪酸、大環(huán)內(nèi)酯(macrolides)、芳香族化合物的生物合成，分解代謝或氧化過程，糖類的修飾，以及酶調(diào)控等廣泛的生物學(xué)途徑中發(fā)揮重要作用。據(jù)估計，已知的酶當(dāng)中有4％使用coa作為輔因子。

酰基coa(acyl-coa)是coa的巰基(-sh)共價連接至游離羧酸的羧基(-cooh)形成的臨時化合物，作為?；w在初級和次級代謝中是必不可少的。大環(huán)內(nèi)酯、聚醚(polyethers)、多烯(polyenes)、黃酮類(flavonoids)、芪類(stilbenes)等化合物是發(fā)掘具有藥用價值的天然產(chǎn)物的重要來源，而上述聚酮類次級代謝物的生物合成均涉及各類中、短鏈?；鵦oa(medium,short-chainacyl-coa)作為結(jié)構(gòu)單元。多樣的?；鵦oa作為起始或延伸單元在聚酮合酶(pks)的催化下整合入聚酮分子的骨架。

到目前為止，研究人員仍不得不依賴各種?；o酶a、¹³c-標(biāo)記的?；鵦oa、放射性標(biāo)記的¹⁴c-酰基coa進行聚酮類天然藥物生物合成的研究實驗。當(dāng)前，僅有sigma-aldrich等極少數(shù)國外公司可以提供商品化的?；鵦oa試劑，但品種十分有限且價格極其昂貴，每克的價格高達12.2–53.6萬元，如表1(sigma-aldrich公司的商品化?；鵦oa試劑信息)所示：

表1

正是由于現(xiàn)有的商品化的?；鵦oa衍生物的品種相當(dāng)有限，而且一些種類在經(jīng)濟上令人望而卻步或商業(yè)上無法獲得，使用化學(xué)方法亦難以合成，國內(nèi)對于能夠自主合成各種形式的新的酰基coa衍生物的需求十分迫切。

目前，已有報道的底物廣譜性最寬、合成?；鵦oa種類最豐富的酰基coa合成酶的產(chǎn)物僅限于丙二酰coa(malonyl-coa)、甲基丙二酰coa(methylmalonyl-coa)、乙基丙二酰coa(ethylmalonyl-coa)、甲氧基丙二酰coa(methoxymalonyl-coa)、羥基丙二酰coa(hydroxymalonyl-coa)，而對于能夠合成更多其他的?；鵦oa的酶未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種中短鏈?；o酶a合成酶的應(yīng)用。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種中短鏈?；o酶a合成酶在制備2-庚烯酰輔酶a、環(huán)己甲酰輔酶a中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用，步驟如下：

(1)制備氨基酸序列如seqidno.2所示的中短鏈?；o酶a合成酶；

(2)利用步驟(1)制得的中短鏈?；o酶a合成酶配制如下反應(yīng)體系：

100mm4-羥乙基哌嗪乙磺酸；質(zhì)量體積百分比10％甘油，單位g/ml；100mm氯化鎂；15～50mm2-庚烯酸、2-庚烯酸的鈉鹽、環(huán)己烷甲酸或環(huán)己烷甲酸的鈉鹽；20mm三磷酸腺苷；5mm輔酶a；10μm純化的丙二酰輔酶a合成酶；ph7.5；

(3)上述反應(yīng)體系在20～24℃條件下反應(yīng)7.5～10h，終止反應(yīng)，去除酶蛋白，經(jīng)純化，干燥，即得。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，制備氨基酸序列如seqidno.2所示的中短鏈?；o酶a合成酶采用如下方法：

使用引物matbf和matbr經(jīng)pcr反應(yīng)擴增天藍色鏈霉菌的丙二酰輔酶a合成酶基因matb，然后通過構(gòu)建表達載體和工程菌，誘導(dǎo)表達，然后經(jīng)ni-nta鎳柱純化丙二酰輔酶a合成酶，即得；

所述引物matbf和matbr的核苷酸序列如下：

matbf:5’-tcgattgcacatatgtcctctctcttcccggccctct-3’

matbr:5’-atcggatagctcgagtcagtcacggttcagcgcccgctt-3’。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，去除酶蛋白為采用超濾離心過濾去除。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，所述的純化為采用hplc色譜進行純化。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，所述干燥為采用真空冷凍干燥方法進行。

上述中短鏈?；o酶a合成酶(丙二酰輔酶a合成酶)的編碼基因來源于天藍色鏈霉菌zm12(購自中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點實驗室)的matb基因，全長1458bp(堿基對)，如seqidno.1所示，其氨基酸序列全長485個殘基，如seqidno.2所示，分子量50.6kda。該酶具有較大的n-末端體(殘基1–387)和較小的c-末端蓋(殘基388–485)。該酶以羧酸或其鹽、atp、coa為底物，催化多種酰基coa的生物合成。

上述丙二酰輔酶a合成酶的兩步反應(yīng)機理如圖1所示：

在腺苷酸形成反應(yīng)中，atp的α-磷酸受到羧酸衍生物的羧基攻擊形成酰基-腺苷酸中間體和焦磷酸(ppi)；在硫酯形成反應(yīng)中，coa置換單磷酸腺苷(amp)以產(chǎn)生酰基coa和amp。

發(fā)明人通過深入研究本發(fā)明所述的丙二酰輔酶a合成酶發(fā)現(xiàn)，該酶具有非常廣泛的羧酸底物耐受性，這顛覆了原有對該類丙二酰輔酶a合成酶的認知，該酶不僅能以1,3-二羧酸及其c-2取代衍生物為底物，還能以直鏈和具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單羧酸為底物，如利用2-庚烯酸(2-heptenate)、環(huán)己烷甲酸(cyclohexanecarboxylicacid)生成2-庚烯酰-coa和環(huán)己甲酰-coa。因此，本發(fā)明所述的丙二酰輔酶a合成酶能廣泛地適應(yīng)短鏈或中鏈、二羧酸或單羧酸底物，并催化其形成相應(yīng)的?；o酶a產(chǎn)物。

有益效果

本發(fā)明首次公開了通過中短鏈?；o酶a合成酶制備2-庚烯酰輔酶a和環(huán)己甲酰輔酶a的技術(shù)方案，克服了現(xiàn)有技術(shù)中僅能認為丙二酰輔酶a合成酶只能以1,3-二羧酸或其鹽作為底物，催化它們形成相應(yīng)的?；o酶a產(chǎn)物，如丙二酰coa、甲基丙二酰coa、乙基丙二酰coa、甲氧基丙二酰coa、羥基丙二酰coa，而不可能催化以單羧酸為底物的反應(yīng)的技術(shù)偏見，拓寬了該酶的應(yīng)用范圍。

附圖說明

圖1為丙二酰輔酶a合成酶的兩步反應(yīng)機理；

圖2為n-末端his6-標(biāo)簽融合的丙二酰輔酶a合成酶的sds-page檢測圖；

圖中：t、s分別是lb培養(yǎng)基、15℃、0.5mmiptg誘導(dǎo)條件下的表達宿主菌的總蛋白和上清液(對照)；

ft為flow-through流出液；

15為15mm咪唑濃度下的洗脫液；

150為150mm咪唑濃度下的洗脫液；

500為500mm咪唑濃度下的洗脫液；

m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(pagerulerbroadrangeunstainedproteinladeder)；

圖3為試驗組與對照組的hplc-ms檢測結(jié)果；

圖中：1)對照組，2)試驗組。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。

生物樣品來源

天藍色鏈霉菌zm12為現(xiàn)有已知菌株，購自中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點實驗室；

輔酶a購自西格瑪奧德里奇(中國)公司。

設(shè)備來源

實施例中的超濾采用ultra-0.5超濾離心過濾裝置；

檢測使用hplc耦聯(lián)ms(esimassspectrometry，電噴霧電離質(zhì)譜)，通過分析超濾除蛋白后的少量樣品，確定并核對?；鵦oa產(chǎn)物的保留時間(retentiontime)、紫外吸收峰形(uvabsorptionpeakshape)和分子量(molecularweight)；

純化采用制備型hplc色譜柱；

干燥采用maxidrylyo真空濃縮/凍干系統(tǒng)(heto-holten，丹麥)。

實施例1

1.表達載體和工程菌的構(gòu)建

使用引物matbf和matbr，以天藍色鏈霉菌基因組dna為模板，pcr擴增目的基因matb。經(jīng)純化后的pcr產(chǎn)物使用ndei和xhoi雙酶切后再次純化，連接至經(jīng)過相同酶切處理并且去磷酸化的含有n-末端his6-標(biāo)簽的表達載體pet-28a(+)。形成的質(zhì)粒pet-28a(+)-matb經(jīng)dna測序驗證后轉(zhuǎn)化入宿主菌e.colibl21(de3)用于蛋白表達。

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2.丙二酰輔酶a合成酶的表達和純化

起始培養(yǎng)物生長過夜后用于接種添加50mg/l卡那霉素的37℃預(yù)溫的lb培養(yǎng)基。當(dāng)od600＝0.4時，15℃冷卻培養(yǎng)基，用0.5mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)蛋白表達。16h后，通過離心收獲細胞，重懸于裂解緩沖液(質(zhì)量體積百分比為10％的甘油，g/ml，0.5mnacl，100mmhepesph7.5)中，超聲處理，并16,000g離心45min以除去細胞碎片。無細胞裂解液通過用裂解緩沖液平衡的鎳-nta柱。用含有15mm咪唑的裂解緩沖液洗滌該柱，并用含有150mm咪唑的裂解緩沖液洗脫蛋白。

聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)檢測，結(jié)果如圖2所示，目的蛋白即為n-末端his6-標(biāo)簽融合的丙二酰輔酶a合成酶，分子量52.8kda。使用thermoscientificnanodrop1000測定最終蛋白濃度為62.7μm。

實施例22-庚烯酰輔酶a生物合成的體外試驗

丙二酰輔酶a合成酶的反應(yīng)體系如表2所示，按順序依次添加各組分，在22℃反應(yīng)條件下恒溫靜置過夜。

表2

對照組的反應(yīng)體系如試驗組，不同之處在于，丙二酰輔酶a合成酶預(yù)先經(jīng)過96℃熱失活處理10min。反應(yīng)樣品經(jīng)過ultra-0.5centrifugalfilterdevices超濾除蛋白后用于hplc-ms(high-resolutionpositive-esimassspectrometry，高分辨率正電噴霧電離質(zhì)譜)分析，hplc方法見表3。

表3用于質(zhì)譜檢測的hplc方法[溶劑a：10mm醋酸銨(nh4oac)水溶液，溶劑b：乙腈(ch3cn)，流速＝1ml/min，在260nm檢測反應(yīng)產(chǎn)物(腺嘌呤、coa基團)]

表3

使用prominencemodularhplc(日本島津公司)和dikma反相色譜柱(agilent1200，zorbaxeclipsexdb-c18，250×4.6mm，5μm)，耦聯(lián)ltq-obitrapvelospro質(zhì)譜儀(thermoscientific公司)，通過hplc-hr-esims分析樣品，在正離子模式下質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍110-1200，檢測結(jié)果如圖3所示；

結(jié)果顯示，試驗組2)在保留時間16.75min出現(xiàn)新增的產(chǎn)物峰a(2-庚烯酰輔酶a)，其m/z的觀測值為878.1981(理論值為878.19565，誤差僅有2.8ppm)。同時，試驗組2)和對照組1)均觀測到底物峰b(coa，m/z觀測值766.4，理論值766.1)。

放大制備2-庚烯酰輔酶a的反應(yīng)體系如前所述，不同之處在于：反應(yīng)后的體系經(jīng)過酶失活，超濾除蛋白，再用制備型hplc分離2-庚烯酰輔酶a產(chǎn)物，使用maxidrylyo真空濃縮/凍干系統(tǒng)(heto-holten，丹麥)冷凍真空干燥，所得色譜純2-庚烯酰輔酶a凍干粉末封裝于安瓿瓶置-80℃保存。

實施例3環(huán)己甲酰輔酶a生物合成的體外試驗

反應(yīng)體系除底物需替換為終濃度16mm環(huán)己烷甲酸(naoh調(diào)ph至7.2)外，其余組分和反應(yīng)條件與表3相同。后續(xù)制備步驟參照實施例2，分離得到10mg環(huán)己甲酰輔酶a純品。檢測結(jié)果如下：

¹h-nmr(核磁共振)數(shù)據(jù)(300mhz，d2o)：δ:0.56(s,h-10'),0.69(s,h-11'),1.55(m,h-5),2.26(t,j＝6.9hz,h-4'),2.40(t,j＝6.9,h-6),2.55(t,j＝8.1hz,h-4),2.75(t,j＝6.0hz,h-1'),3.11(t,j＝6.0,h-3andh-7),3.27(m,h-2'andh-5'),3.35(m,h-5”),3.64(m,h-5”),3.82(s,h-7'),4.04(brs,ch2-9'),4.39(brs,h-4”),5.98(d,j＝7.5hz,h-1”),8.08(s,adenine-ch),8.35(s,adenine-ch)。esi-ms質(zhì)譜數(shù)據(jù)[負離子模式(negativeionmode)，m/z]：876.0[m-h]^-，437.5[m-2h]^2-。

對比例

按照2012年美國crosby等人公開的來自沼澤紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustriscga009)的丙二酰輔酶a合成酶的制備方法制備丙二酰輔酶a合成酶，采用實施例2和實施例3中的方法制備2-庚烯酰輔酶a和環(huán)己甲酰輔酶a。

經(jīng)檢測，反應(yīng)體系中未發(fā)現(xiàn)2-庚烯酰輔酶a和環(huán)己甲酰輔酶a的生成。沼澤紅假單胞菌的丙二酰輔酶a合成酶不能催化2-庚烯酸、環(huán)己烷甲酸這樣中短不飽和直鏈或具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單羧酸轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的?；o酶a的反應(yīng)。

以上所述僅是本發(fā)明的一個實施例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

sequencelisting

<110>劉,超

<120>一種中短鏈酰基輔酶a合成酶的應(yīng)用

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1458

<212>dna

<213>streptomycescoelicolor

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aagtccggcgacaaggaactcgcgcacatcctctccgacagcgcgccctcgctcgtcctg300

gcgcccccggacgcggaactcccgcccgccctcggggccctggagcgcgtcgacgtcgac360

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gtctacacctcgggcaccacgggaccgccgaagggcgccgtcatcccccggcgggcgctc480

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atcgagaacgccctgctcgaacacccggaggtccgggaggccgccgtcaccggcgaaccc1260

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cccgccctcggcacgctggccgaccacgtcgccgcccggctcgccccgcacaagcggccg1380

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<212>prt

<213>streptomycescoelicolor

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485

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<212>dna

<213>人工合成

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<212>dna

<213>人工合成

<400>4

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