本發(fā)明涉及一種制備抗氧化肽的方法，尤其是一種優(yōu)化脫脂方式聯(lián)合超聲輔助酶解鴨肝制備抗氧化肽的方法。

背景技術：

我國是農(nóng)業(yè)大國，畜禽產(chǎn)品資源非常豐富，在農(nóng)產(chǎn)品總量中占有相當大的比重。鴨肝為鴨肉加工過程的副產(chǎn)物，其維生素、礦物質含量豐富，尤其是天然優(yōu)質的完全蛋白的良好來源。但大部分鴨肝都以零售的形式銷售到飯店供少部分顧客使用或廢棄，許多活性物質沒有得到充分利用。目前，開發(fā)天然抗氧化保健食品和天然抗氧化劑成為現(xiàn)代生命的科學熱點，評價和篩選具有強抗氧化活性的天然資源已成為食品科學的新趨勢。目前亟需以鴨肝為研究對象，進行鴨肝多肽的制備及抗氧化活性的研究，為開發(fā)天然抗氧化保健食品和食品中添加的天然抗氧化劑提供科學依據(jù)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術中存在的不足，提供一種優(yōu)化脫脂方式聯(lián)合超聲輔助酶解鴨肝制備抗氧化肽的方法，該方法操作簡單，處理時間短、多肽得率高，能耗較低及酶解物具有較好的清除自由基能力等優(yōu)點。

按照本發(fā)明提供的技術方案，所述優(yōu)化脫脂方式聯(lián)合超聲輔助酶解鴨肝制備抗氧化肽的方法，其特征是，包括以下步驟：

(1)將鴨肝切碎后加入鴨肝重量1～3倍的生理鹽水，8000～12000rpm下高速勻漿1～3min，再加入鴨肝重量1～3倍的蒸餾水，升溫至65～75℃，在200～400rmp/min下攪拌處理1～3h，過濾得到脫脂鴨肝蛋白；將脫脂鴨肝蛋白揮發(fā)1～3h，在-40～-50℃下冷凍干燥12～24h，得到凍干粉；

(2)將凍干粉加入凍干粉重量20～30倍的蒸餾水中進行超聲；然后加入占凍干粉重量0.5％～1.5％的胰蛋白酶，在45～55℃水浴鍋中酶解并在200～400rmp/min下攪拌90～150min后，在90～100℃水浴中滅酶10～20min；用鹽酸滴定ph至中性，于8000～12000rmp、4～8℃條件下離心10～20min，過濾取上清液；

(3)將上清液超濾處理，收集超濾液；將超濾液冷凍干燥，得到鴨肝多肽干燥粉末。

在一個具體實施方式中，所述步驟(1)中過濾得到脫脂鴨肝蛋白后，再向鴨肝中加入鴨肝重量1～3倍的蒸餾水，升溫至65～75℃，在200～400rmp/min下攪拌處理1～3h，過濾，將過濾得到脫脂鴨肝蛋白與步驟(1)中的脫脂鴨肝蛋白混合。

在一個具體實施方式中，所述步驟(2)中超聲條件為超聲功率：150～250w，超聲時間：3～5min，工作時間2s，停歇時間3～5s，超聲頻率是20khz。

在一個具體實施方式中，所述上清液中鴨肝多肽濃度在5.3～6.6mg/ml。

在一個具體實施方式中，所述步驟(3)中超濾處理是在過濾精度3kd～5kd的纖維膜中進行。

在一個具體實施方式中，所述步驟(3)中超濾液冷凍干燥是將超濾液在-70～-80℃下預凍6～12h，然后在大氣壓力為10～100pa、溫度為-55～-70℃條件下冷凍干燥24～72h。

本發(fā)明采用常壓蒸煮脫脂能夠很好地脫除鴨肝內(nèi)的脂肪，有利于后續(xù)鴨肝產(chǎn)品的加工，是一種操作方便的鴨肝脫脂方式，且有利于鴨肝蛋白水解，節(jié)約加工成本，減少試劑對環(huán)境的污染；進一步聯(lián)合超聲輔助酶解，操作簡單，處理時間短、多肽得率高，能耗較低及酶解物具有較好的清除自由基能力等優(yōu)點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明酶解時間和鴨肝多肽濃度的關系圖。

圖2為本發(fā)明酶解時間和鴨肝多肽清除abts自由基能力的關系圖。

圖3為本發(fā)明酶解時間和鴨肝蛋白水解度的關系圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

本發(fā)明所采用的測試方法如下所述：

一、水解度的測定：

水解度的測定參考ph-stat法。

式中：dh—水解度，nb—naoh的濃度(mol/l)，b—naoh的體積(ml)，mp—水解蛋白質的質量(g)，htot—底物蛋白中總的肽鍵數(shù)，豬腦蛋白為7.6mmol/g，α—鴨肝蛋白的平均解離度，按公式計算可得(a＝[10(ph-pk)]/[1+10(ph-pk)]

二、多肽濃度的測定

0.5mlfolin-phenol(試劑a)，加入0.5ml的樣品，室溫下反應10min，再加入2mlfolin-phenol(試劑b)，水浴25～30℃加熱5min，冷水浴0～4℃處理10min，于650nm處測定其吸光度，并以去離子水替代樣品溶液做空白對照，根據(jù)標準曲線來計算樣品中多肽的含量(bsa標準曲線線性范圍：0～50μg/ml)。

三、酶解液abts自由基清除率的測定

(1)磷酸鹽鈉緩沖液的配制(0.01mol/l，ph7.4)：準確稱取1.091gna2hpo4，0.36gnah2po4·2h2o和8.78gnacl，用去離子水溶解，并稀釋至1000ml，避光保存，一周內(nèi)使用。

(2)abts自由基溶液的配制：取10mgabts和2.9mgk2s2o8溶于10ml磷酸鈉緩沖液，混合后于25℃避光反應16h備用，實驗時取2ml該反應液，加入18ml磷酸鈉緩沖液，配成abts儲備液，避光保存當日備用。abts儲備液再用磷酸鈉緩沖液稀釋，使其于734nm處測吸光值在0.85左右，即為abts工作液，當日新鮮配制使用。

(3)測定方法：分別取0.1ml樣品液，加入3.9mlabts工作液，混合均勻。混合液于室溫下靜置10分鐘，在波長734nm處測定吸光度(ai)，以蒸餾水代替樣品溶液測定空白吸光度(a0)，以磷酸鈉緩沖液代替abts工作液測得吸光度(aj)，實驗平行做三次。清除率計算公式如下：

清除率(％)＝1-(ai-aj)/a0×100％

實施例1

一種優(yōu)化脫脂方式聯(lián)合超聲輔助酶解鴨肝制備抗氧化肽的方法，包括以下步驟：

(1)將新鮮或冷凍鴨肝去表面和內(nèi)部薄膜，切碎后加入鴨肝重量1倍的生理鹽水，8000rpm下高速勻漿3min，再加入鴨肝重量1倍的蒸餾水，升溫至65℃，在200rmp/min下攪拌處理3h，過濾得到脫脂鴨肝蛋白，再向鴨肝中加入鴨肝重量1倍的蒸餾水，升溫至65℃，在200rmp/min下攪拌處理3h，過濾，將兩次過濾得到脫脂鴨肝蛋白混合；將脫脂鴨肝蛋白置于培養(yǎng)皿中，通風櫥內(nèi)揮發(fā)1h，在-40℃下冷凍干燥24h，得到凍干粉；

(2)將凍干粉加入凍干粉重量20倍的蒸餾水中進行超聲，超聲功率：150w，超聲時間：5min，工作時間2s，停歇時間3s，超聲頻率是20khz；然后加入占凍干粉重量0.5％的胰蛋白酶，在45℃水浴鍋中酶解并在200rmp/min下不斷攪拌90min后在90℃水浴中滅酶20min；用0.2mol/l的鹽酸滴定ph至中性，于8000rmp、4℃條件下離心20min，過濾取上清液；上清液中鴨肝多肽濃度在5.3mg/ml。

(3)將上清液在過濾精度3kd的纖維膜中進行超濾處理，收集超濾液；將超濾液在-70℃下預凍12h，然后在大氣壓力為100pa、溫度為-55℃條件下冷凍干燥72h，得到鴨肝多肽干燥粉末。

實施例2

一種優(yōu)化脫脂方式聯(lián)合超聲輔助酶解鴨肝制備抗氧化肽的方法，包括以下步驟：

(1)將新鮮或冷凍鴨肝去表面和內(nèi)部薄膜，切碎后加入鴨肝重量2倍的生理鹽水，10000rpm下高速勻漿2min，再加入鴨肝重量2倍的蒸餾水，升溫至70℃，在300rmp/min下攪拌處理2h，過濾得到脫脂鴨肝蛋白，再向鴨肝中加入鴨肝重量2倍的蒸餾水，升溫至70℃，在300rmp/min下攪拌處理2h，過濾，將兩次過濾得到脫脂鴨肝蛋白混合；將脫脂鴨肝蛋白置于培養(yǎng)皿中，通風櫥內(nèi)揮發(fā)2h，在-45℃下冷凍干燥18h，得到凍干粉；

(2)將凍干粉加入凍干粉重量25倍的蒸餾水中進行超聲，超聲功率：200w，超聲時間：4min，工作時間2s，停歇時間4s，超聲頻率是20khz；然后加入占凍干粉重量1％的胰蛋白酶，在50℃水浴鍋中酶解并在300rmp/min下不斷攪拌130min后在95℃水浴中滅酶15min；用0.3mol/l的鹽酸滴定ph至中性，于10000rmp、6℃條件下離心15min，過濾取上清液；上清液中鴨肝多肽濃度在6.6mg/ml。

(3)將上清液在過濾精度4kd的纖維膜中進行超濾處理，收集超濾液；將超濾液在-75℃下預凍9h，然后在大氣壓力為50pa、溫度為-60℃條件下冷凍干燥48h，得到鴨肝多肽干燥粉末。

實施例3

一種優(yōu)化脫脂方式聯(lián)合超聲輔助酶解鴨肝制備抗氧化肽的方法，包括以下步驟：

(1)將新鮮或冷凍鴨肝去表面和內(nèi)部薄膜，切碎后加入鴨肝重量3倍的生理鹽水，12000rpm下高速勻漿1min，再加入鴨肝重量3倍的蒸餾水，升溫至75℃，在400rmp/min下攪拌處理1h，過濾得到脫脂鴨肝蛋白，再向鴨肝中加入鴨肝重量3倍的蒸餾水，升溫至75℃，在400rmp/min下攪拌處理1h，過濾，將兩次過濾得到脫脂鴨肝蛋白混合；將脫脂鴨肝蛋白置于培養(yǎng)皿中，通風櫥內(nèi)揮發(fā)3h，在-50℃下冷凍干燥12h，得到凍干粉；

(2)將凍干粉加入凍干粉重量30倍的蒸餾水中進行超聲，超聲功率：250w，超聲時間：3min，工作時間2s，停歇時間5s，超聲頻率是20khz；然后加入占凍干粉重量1.5％的胰蛋白酶，在55℃水浴鍋中酶解并在400rmp/min下不斷攪拌150min后在100℃水浴中滅酶15min；用0.4mol/l的鹽酸滴定ph至中性，于12000rmp、8℃條件下離心10min，過濾取上清液；上清液中鴨肝多肽濃度在6mg/ml。

(3)將上清液在過濾精度5kd的纖維膜中進行超濾處理，收集超濾液；將超濾液在-80℃下預凍6h，然后在大氣壓力為10pa、溫度為-70℃條件下冷凍干燥24h，得到鴨肝多肽干燥粉末。

對比例1

(1)將新鮮或冷凍鴨肝去表面和內(nèi)部薄膜，切碎后加入2倍生理鹽水，10000rpm下高速勻漿2min，加入鴨肝重量2倍的正己烷，回流處理5h，過濾得到脫脂鴨肝蛋白，將脫脂鴨肝蛋白置于培養(yǎng)皿中，通風櫥內(nèi)揮發(fā)2h，再于真空干燥器中抽空至無正己烷氣味，在-45℃下冷凍干燥18h，得到凍干粉；

(2)將凍干粉加入凍干粉重量25倍的蒸餾水中進行超聲，超聲功率：200w，超聲時間：4min，工作時間2s，停歇時間4s，超聲頻率是20khz；然后加入占凍干粉重量1％的胰蛋白酶，在50℃水浴鍋中酶解并在300rmp/min下不斷攪拌130min后在95℃水浴中滅酶15min；用0.3mol/l的鹽酸滴定ph至中性，于10000rmp、6℃條件下離心15min，過濾取上清液；上清液中鴨肝多肽濃度在4.7mg/ml。

(3)將上清液在過濾精度4kd的纖維膜中進行超濾處理，收集超濾液；將超濾液在-75℃下預凍9h，然后在大氣壓力為50pa、溫度為-60℃條件下冷凍干燥48h，得到鴨肝多肽干燥粉末。

對比例2

(1)將新鮮或冷凍鴨肝去表面和內(nèi)部薄膜，切碎后加入2倍生理鹽水，10000rpm下高速勻漿2min，加入鴨肝重量2倍的95％乙醇，回流處理2h，過濾得到脫脂鴨肝蛋白，將脫脂鴨肝蛋白置于培養(yǎng)皿中，通風櫥內(nèi)揮發(fā)2h，再于真空干燥器中抽空至無乙醇氣味，在-45℃下冷凍干燥18h，得到凍干粉；

(2)將凍干粉加入凍干粉重量25倍的蒸餾水中進行超聲，超聲功率：200w，超聲時間：4min，工作時間2s，停歇時間4s，超聲頻率是20khz；然后加入占凍干粉重量1％的胰蛋白酶，在50℃水浴鍋中酶解并在300rmp/min下不斷攪拌130min后在95℃水浴中滅酶15min；用0.3mol/l的鹽酸滴定ph至中性，于10000rmp、6℃條件下離心15min，過濾取上清液；上清液中鴨肝多肽濃度在5.1mg/ml。

(3)將上清液在過濾精度4kd的纖維膜中進行超濾處理，收集超濾液；將超濾液在-75℃下預凍9h，然后在大氣壓力為50pa、溫度為-60℃條件下冷凍干燥48h，得到鴨肝多肽干燥粉末。

由實施例1-3和對比例1-2可知，采用常壓蒸煮脫脂酶解效果最好，得到的鴨肝多肽濃度最高。

如圖1所示，隨著酶解時間的延長，鴨肝多肽濃度增大，在130min時，多肽濃度達到最大，達6.6mg/ml。

如圖2所示，隨著酶解時間的延長，鴨肝多肽濃度增大，鴨肝多肽的abts自由基的清除率也在增加，酶解時間5min時，多肽濃度已達1.3mg/ml，清除abts自由基能力為66％；通過計算可知，鴨肝多肽清除abts自由基的ec50值為0.76mg/ml，表明鴨肝多肽具有較好的抗氧化活性。

如圖3所示，在酶解時間10-30min時，水解度增加較快，而酶解時間在90min后，水解度增加變緩，說明隨著酶解時間的延長，水解度變化緩慢。