本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及純化核酸的結(jié)合液及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

經(jīng)典的分離純化核酸方法是在高濃度離液鹽的作用下將目標(biāo)核酸分子吸附在硅基質(zhì)膜上，而非目標(biāo)核酸、蛋白質(zhì)、鹽類以及有機(jī)物質(zhì)則不吸附，從而達(dá)到分離純化的目的。該方法依據(jù)純化的目的不同可以分為兩類：直接純化法與切膠回收法，其中直接純化法適用于產(chǎn)物為單一dna片段或者溶液中所有dna片段都需要回收的情況；而切膠回收法適用于選擇性回收溶液中dna的情況。從待分離核酸的分子特征方面而言，硅基質(zhì)膜吸附分離又可以分為三類：基于核酸分子的大小、核酸分子的拓?fù)洚悩?gòu)狀態(tài)以及核酸分子中的化學(xué)基團(tuán)分離。此外，還有一種被廣泛應(yīng)用的方法，即聚乙二醇沉淀法，其原理是在聚乙二醇為基礎(chǔ)的緩沖體系作用下，將不同大小的dna片段選擇性沉淀，從而將它們分離開的方法。此方法所使用的聚乙二醇濃度高時不易被漂洗干凈，存在對下游實驗造成抑制的風(fēng)險。

上述方法操作不僅費時費力，還存在對下游實驗造成抑制的風(fēng)險，并且往往不能與高通量的自動化機(jī)器相匹配。目前，伴隨著二代測序技術(shù)的逐步發(fā)展，為了匹配高通量的平行測序數(shù)據(jù)的輸出，構(gòu)建大量的測序文庫是必需的操作環(huán)節(jié)。而文庫構(gòu)建過程中的背景去除又是保證高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)的必要步驟，這些干擾測序讀碼的背景主要包括：單個接頭分子以及接頭自連的分子，這類背景分子比正常的加有接頭的目標(biāo)dna片段小，在測序之前必須被去除掉，否則會嚴(yán)重干擾測序信號。由此可見，簡潔、快速、高效的且可以整合到二代測序文庫構(gòu)建過程中的小片段去除方法是非常必需的。

然而，現(xiàn)有分離純化核酸方法仍有待改進(jìn)。目前，逐漸發(fā)展起來了磁珠吸附法。該方法操作簡單方便，將dna產(chǎn)物在適宜的結(jié)合液作用下與磁珠顆粒結(jié)合，在磁場條件下將磁珠顆粒與溶液分離開來，不同的結(jié)合液作用使得不同的目標(biāo)dna片段與磁珠結(jié)合，而其它非目標(biāo)片段則留在溶液中被棄掉，進(jìn)一步對結(jié)合有目標(biāo)片段dna的磁珠進(jìn)行漂洗，最后洗脫下所需要的dna，最終達(dá)到與非目標(biāo)片段分開的目的。

以往的發(fā)明cn101665785a、cn103820431a、cn101684138a公開的都是采用磁珠從樣本中提取與純化核酸的方法，強(qiáng)調(diào)裂解樣本，并從中獲取核酸。而本發(fā)明不涉及從樣本中提取，而是采用磁珠吸附的原理，將不同大小的dna片段分離開來，后續(xù)用于相應(yīng)的分子生物學(xué)試驗。專利cn104560954a公開了一種基于磁珠法純化非特異性擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)產(chǎn)物的方法，此發(fā)明通過瓊脂糖凝膠電泳首先將目的條帶與非特性擴(kuò)增條帶分離開，然后將目的條帶用小刀切下，再通過磁珠法來純化pcr產(chǎn)物，與傳統(tǒng)方法相比，其優(yōu)點在于實現(xiàn)了自動化，不需要離心，簡單快捷。而本發(fā)明所提出的通過磁珠吸附的原理將大小不同的dna片段分開的方法，不需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，省去電泳與切膠溶膠的時間與步驟，直接將產(chǎn)物通過磁珠法純化回收即可得到目標(biāo)dna。

本發(fā)明所涉及的方法主要特點在于不涉及裂解樣本并從中提取核酸，也不需要瓊脂糖凝膠電泳以及切膠溶膠的過程，可以通過調(diào)整磁珠結(jié)合液的濃度，濃度越高結(jié)合的dna片段大小的范圍越寬，濃度越低則只結(jié)合大片段，小片段則游離在上清中，依據(jù)此原理將不同大小的dna片段分離開來，這一點也是目前檢索專利未曾提到的。另外，值得強(qiáng)調(diào)的一點是本發(fā)明所涉及的方法可以用于微量核酸的純化，主要針對無創(chuàng)產(chǎn)前篩查過程中所提到的微量循環(huán)核酸，在二代測序前需要進(jìn)行一系列的建庫反應(yīng)，每步反應(yīng)后都需要進(jìn)行產(chǎn)物純化去除相應(yīng)的背景信號，才能進(jìn)行下一步實驗。這一點也是以往專利中未提到的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是發(fā)明人基于以下發(fā)現(xiàn)所獲得的：

發(fā)明人基于磁珠吸附的原理，使得目標(biāo)dna產(chǎn)物在適宜條件的結(jié)合液作用下與磁珠顆粒相結(jié)合，而低于目標(biāo)dna的小片段以及其它蛋白質(zhì)、鹽類與有機(jī)物質(zhì)等不被吸附，將分子量低于目標(biāo)dna的小片段以及其他雜質(zhì)分離去除的方法，從而達(dá)到分離純化目標(biāo)核酸的目的。

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的問題之一。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種純化核酸的結(jié)合液，其特征在于，包含：鹽；增溶劑，其中，所述鹽為選自氯化鉀、醋酸鉀、氯化鋰、醋酸鋰、氯化鈉、醋酸鈉中的至少一種，所述增溶劑為非離子型的增溶劑和/或離子型的增溶劑。利用所述純化核酸的結(jié)合液，可以使得磁珠與目標(biāo)核酸相結(jié)合，而其他核酸、蛋白質(zhì)、鹽類以及有機(jī)物不被磁珠吸附，從而到達(dá)分離純化目標(biāo)核酸的目的，并且可以匹配二代測序技術(shù)，有效除去小片段核酸，構(gòu)建大量的測序文庫；進(jìn)一步地，利用所述純化核酸的結(jié)合液進(jìn)行分離純化核酸的方法，操作簡單，無需離心，且純化所得的目標(biāo)核酸純度好，可以直接用于連接、轉(zhuǎn)化、酶切、測序、雜交等分子生物學(xué)實驗。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述鹽的濃度為2-5m。由此，可以進(jìn)一步提高純化核酸的結(jié)合液的純化效率。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述非離子型的增溶劑為醇類和/或親水性的多聚物；任選地，所述醇類為選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和丁醇中的至少一種；任選地，所述親水性的多聚物為選自硫酸葡聚糖、四甘醇、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一種；任選地，所述離子型的增溶劑為亞精胺和/或十六烷基三甲基溴化銨(ctab)。由此，可以進(jìn)一步提高純化核酸的結(jié)合液的純化效率。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述非離子型的增溶劑的濃度為3％-40％；任選地，所述離子型的增溶劑的濃度為10mm至100mm。由此，可以進(jìn)一步提高純化核酸的結(jié)合液的純化效率。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，采用緩沖液調(diào)節(jié)所述純化核酸的結(jié)合液的ph值至7.0-9.0；任選地，所述緩沖液為選自醋酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷(tris)鹽酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸(mops)緩沖液和4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)緩沖液中的至少一種，任選地，所述緩沖液的終濃度為20-200mm。由此，可以進(jìn)一步提高純化核酸的結(jié)合液的純化效率。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，基于1l所述純化核酸的結(jié)合液，所述純化核酸的結(jié)合液包含：2.5mol/l氯化鉀；20v％四甘醇；100mm三羥甲基氨基甲烷；以及余量水，且ph值為7.0-7.5。其中，需要說明的是，可以利用鹽酸調(diào)節(jié)該結(jié)合液的ph值。利用所述純化核酸的結(jié)合液，可以有效除去pcr產(chǎn)物中非特異性擴(kuò)增的小分子核酸以及其他雜質(zhì)，從而獲得純度高的目標(biāo)核酸。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，基于1l所述純化核酸的結(jié)合液，所述純化核酸的結(jié)合液包含：3.5mol/l氯化鈉；30v％聚乙二醇4000；100mm3-嗎啉丙磺酸；以及余量水，且ph值為7.0。其中，需要說明的是，可以利用鹽酸調(diào)節(jié)該結(jié)合液的ph值。利用所述純化核酸的結(jié)合液，可以有效除去pcr產(chǎn)物中非特異性擴(kuò)增的小分子核酸以及其他雜質(zhì)，從而獲得純度高的目標(biāo)核酸。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出一種純化核酸方法，包括：

(1)將待純化核酸樣本中加入前述純化核酸的結(jié)合液和磁珠進(jìn)行混合；

(2)將步驟(1)中獲得的磁珠進(jìn)行漂洗；

(3)將步驟(2)中獲得的磁珠進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，以便獲得純化的核酸，

任選地，在步驟(2)進(jìn)行多次漂洗。所述方法操作簡單，無需離心，且純化所得的目標(biāo)核酸純度好，可以直接用于連接、轉(zhuǎn)化、酶切、測序、雜交等分子生物學(xué)實驗。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出一種純化核酸方法，包括：

(1)將待純化核酸樣本中加入0.4-1倍體積的前述純化核酸的結(jié)合液和5-15ul磁珠后，渦旋混勻0.5-1min，磁力架上靜置30s，轉(zhuǎn)移上清液體，以便獲得第一磁珠；將上清液體中加入0.1-0.3倍體積的前述純化核酸的結(jié)合液和5-15ul磁珠后，渦旋混勻0.5-1min，磁力架上靜置30s，棄掉上清液體，以便獲得第二磁珠；

(2)將300ul漂洗液分別加入第一磁珠與第二磁珠后，渦旋混勻，進(jìn)行漂洗，磁力架上靜置30s，除去液體；

(3)將洗脫液分別加入所述第一磁珠與第二磁珠中，渦旋混勻后，磁力架上靜置30s，收集上清液，以便獲得不同大小的目的核酸。

任選地，在步驟(2)中進(jìn)行多次漂洗。所述方法操作簡單，無需離心，且純化所得的目標(biāo)核酸純度好，可以直接用于連接、轉(zhuǎn)化、酶切、測序、雜交等分子生物學(xué)實驗。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出前述純化核酸的結(jié)合液在制備、純化核酸中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出一種試劑盒，包含前述純化核酸的結(jié)合液，任選地，所述試劑盒進(jìn)一步包含：

磁珠：所述磁珠為平均粒徑不大于1μm的超順磁微球，例如磁珠的平均粒徑可以為200nm、300nm、500nm或1μm。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，該磁珠的平均粒徑為500nm-1μm。由此，磁珠的適用范圍廣泛。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所述磁珠表面修飾有羥基和/或羧基。由此，有利于磁珠吸附核酸。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實施例，所述磁珠表面修飾有羧基。由此，磁珠對小片段核酸的吸附效果更佳。

漂洗液：所述漂洗液70-80％的醇。由此，漂洗去掉殘留的鹽與蛋白的效果好。

洗脫液：所述洗脫液為含有5-10mm的三羥甲基氨基甲烷的鹽酸緩沖液，且所述洗脫液的ph值為7-8，且不含核酸酶。由此，洗脫效果好。

利用所述試劑盒進(jìn)行分離純化核酸的方法，操作簡單，無需離心，且純化所得的目標(biāo)核酸純度好，可以直接用于連接、轉(zhuǎn)化、酶切、測序、雜交等分子生物學(xué)實驗。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例的純化前后pcr產(chǎn)物電泳檢測圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實施例的純化前后pcr產(chǎn)物電泳檢測圖；

圖3是根據(jù)本發(fā)明實施例的回收效率結(jié)果示意圖。

具體實施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的結(jié)果在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

實施例1

從2kb聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)產(chǎn)物中去除200bp非特異擴(kuò)增片段。具體操作步驟如下：

(1)向40μl待回收樣本中加入0.6倍體積的結(jié)合液(結(jié)合液含有2.5mol/l氯化鉀、20v％四甘醇和100mmtris，且ph值為7.5)和5μl平均粒徑為1μm的且表面修飾有羧基官能團(tuán)的磁珠并充分混勻，振蕩5分鐘，以利于磁珠充分與目的片段結(jié)合；

(2)將步驟(1)的離心管放置于磁力架上靜置2分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體；

(3)將步驟(2)的離心管置于磁力架上，加入300μl漂洗液(漂洗液包含75％的乙醇)，不要擾亂磁珠；

(4)將步驟(3)的離心管置于磁力架上，室溫靜置1分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體；

(5)重復(fù)步驟(3)-(4)一次；

(6)將步驟(5)的離心管置于磁力架上，室溫晾干5分鐘；

(7)將步驟(6)的離心管從磁力架上取下，加入40μl洗脫液(洗脫液為含10mm的tris鹽酸緩沖液，且ph8.0)，室溫振蕩5分鐘；

(8)將步驟(7)的離心管放置于磁力架上靜置2分鐘，待磁珠完全吸附時小心將dna溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管，從而獲得純化后的dna溶液，并于適當(dāng)條件保存。

(9)將純化前的pcr產(chǎn)物以及純化后的dna溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1，其中，1：代表去除小片段前，2：代表去除小片段后。由圖1可知，通過上述方法可以有效除去pcr產(chǎn)物中200bp非特異性擴(kuò)增片段。

實施例2

從300bp聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)產(chǎn)物中去除100bp的非特異擴(kuò)增條帶。具體操作步驟如下：

(1)向50μl待回收樣本中加入1倍體積的結(jié)合液(該結(jié)合液含3.5mol/l氯化鈉、30v％聚乙二醇4000和100mm3-mops，ph值為7.0)和5μl平均粒徑為1μm的且表面修飾有羧基官能團(tuán)的磁珠并充分混勻，振蕩5分鐘，以利于磁珠充分與目的片段結(jié)合；

(2)將步驟(1)的離心管放置于磁力架上靜置2分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體；

(3)將步驟(2)的離心管置于磁力架上，加入300μl漂洗液(漂洗液包含70％的乙醇)，不要擾亂磁珠；

(4)將步驟(3)的離心管置于磁力架上室溫靜置1分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體；

(5)重復(fù)步驟(3)-(4)一次；

(6)將步驟(5)的離心管置于磁力架上，室溫晾干5分鐘；

(7)將步驟(6)的離心管從磁力架上取下，加入50μl洗脫液(洗脫液為含10mm的tris鹽酸的緩沖液，且ph8.0)，室溫振蕩5分鐘；

(8)將步驟(7)的離心管放置于磁力架上靜置2分鐘，待磁珠完全吸附時小心將dna溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管，并于適當(dāng)條件保存。

(9)將純化前的pcr產(chǎn)物以及純化后的dna溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2，其中，1：代表去除小片段前，2：代表去除小片段后。由圖2可知，通過上述方法可以有效除去pcr產(chǎn)物中100bp的條帶。

實施例3

純化回收二代測序文庫構(gòu)建過程中加完接頭后的微量循環(huán)核酸。具體操作步驟如下：

(1)向50μl加接頭后的產(chǎn)物中加入50μl的結(jié)合液(結(jié)合液含有3.5m氯化鉀、25質(zhì)量％peg6000和100mmtris，ph值為9)和5μl平均粒徑為1μm的且表面修飾有羧基官能團(tuán)的磁珠，振蕩5分鐘，以利于磁珠充分與目的片段結(jié)合；

(2)將步驟(1)的離心管放置于磁力架上靜置2分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體；

(3)將步驟(2)的離心管置于磁力架上，加入300μl漂洗液(漂洗液包含80％的乙醇)，不要打亂磁珠；

(4)將步驟(3)的離心管放置于磁力架上靜置1分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體；

(5)重復(fù)步驟(3)-(4)一次；

(6)將步驟(5)的離心管置于磁力架上，室溫晾干5分鐘，磁珠不要干裂，否則影響洗脫效率；

(7)將步驟(6)的離心管從磁力架上取下，加入適量洗脫液(洗脫液為含10mmtris鹽酸的緩沖液，且ph8.0)，渦旋混勻5分鐘；

(8)將步驟(7)的離心管放置于磁力架上靜置2分鐘，待磁珠完全吸附時小心將dna溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管，并于適當(dāng)條件保存。采用熒光定量法測定本實施例純化所得dna的回收效率，并重復(fù)測定兩次，結(jié)果如圖3所示，ct值分別為29.1和29.0。同時，采用專利cn104560954a所公開的方法對上述二代測序文庫構(gòu)建過程中加完接頭后的微量循環(huán)核酸進(jìn)行純化，并采用相同的熒光定量法測定純化所得dna的回收效率，結(jié)果如圖3所示，ct值分別為31.1和31.2。ct值表示每個熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管內(nèi)熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，熒光定量的ct值與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，ct值越小，本實施例的純化方法得到的ct值低于專利cn104560954a的純化方法得到的ct值，表明本實施例的純化方法的起始拷貝數(shù)高于專利cn104560954a，也就是說，本實施例的純化方法的回收效率更高。

此外，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括至少一個該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個”的含義是至少兩個，例如兩個，三個等，除非另有明確具體的限定。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。