本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種甲基營養(yǎng)菌發(fā)酵液中吡咯喹啉醌的分離純化方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

吡咯喹啉醌(pqq)屬于芳香三環(huán)鄰位醌，作為核黃素和吡啶核苷酸之后發(fā)現(xiàn)的第三種氧化還原酶輔因子。pqq參與脫氫酶的氧化還原過程，協(xié)同coq完成呼吸鏈的電子傳遞，廣泛存在于生物體內(nèi)，具有促進(jìn)神經(jīng)生長因子合成與修復(fù)、防止神經(jīng)細(xì)胞纖維化、清除自由基以及維護(hù)線粒體能量代謝功能等生理功能，在醫(yī)藥、食品和化妝品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。化學(xué)合成法由于異構(gòu)體和副產(chǎn)物多、產(chǎn)率低、合成步驟繁瑣且需使用多種有毒試劑等問題逐漸被微生物發(fā)酵法所替代。

甲基營養(yǎng)菌的pqq合成量高，生絲微菌hyphomicrobiumsp.tk0441的產(chǎn)量為1g/l(appliedandenvironmentalmicrobiology，1992；58(12)：3970-3976)；甲基營養(yǎng)菌methylovorussp.mp688的產(chǎn)量高達(dá)2g/l(cn103224965)，并且培養(yǎng)基組分只需含有甲醇和無機(jī)鹽，成本低廉、下游純化工藝較為簡單是微生物發(fā)酵法合成pqq產(chǎn)業(yè)化的主要生產(chǎn)菌株。因此，開發(fā)分離步驟少、銜接度好且回收率高的分離純化工藝從甲基營養(yǎng)菌發(fā)酵液中提取pqq是產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵步驟。目前，關(guān)于發(fā)酵液中pqq的提取方法有絡(luò)合萃取分離純化法(cn104892597)、離子對雙水相萃取分離結(jié)合陰離子交換樹脂吸附純化法(cn105294687)、deae-葡聚糖凝膠吸附分離結(jié)合c18固相萃取純化法(cn1138776和us4994382)以及hp-20大孔樹脂吸附分離結(jié)合聚酰胺柱純化法(cn104328155)。上述方法需要使用大量的正己烷、甲醇或乙醇等有機(jī)溶劑，工業(yè)化應(yīng)用成本高且污染環(huán)境。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種從發(fā)酵液中分離純化吡咯喹啉醌的方法。

本發(fā)明提供的從發(fā)酵液中分離純化吡咯喹啉醌的方法包括如下步驟：

(1)將發(fā)酵液先經(jīng)大孔樹脂富集，再依次經(jīng)過緩沖液和水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；

(2)將所述富含吡咯喹啉醌的富集液經(jīng)親水性硅膠填料純化，得到吡咯喹啉醌母液；

(3)使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌結(jié)晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶體；

(4)采用堿溶酸沉法將所述吡咯喹啉醌粗晶體進(jìn)行重結(jié)晶，得到吡咯喹啉醌。

上述方法中，所述大孔樹脂為非極性大孔樹脂。所述非極性大孔樹脂的比表面積為800-1000m²/g，平均孔徑為15-20nm，優(yōu)選為美國羅門哈斯公司生產(chǎn)的xad18、xad1600n和xad16n大孔吸附樹脂。

上述方法中，所述親水性硅膠填料為親水性c18硅膠填料，優(yōu)選為華譜新創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)的c18hc填料。

上述方法中，所述步驟(1)前還包括如下步驟：將發(fā)酵液離心(10000×g離心5min)，收集上清液；將所述上清液過濾(1kda的中空纖維膜)，收集濾液。

上述方法中，所述步驟(1)，所述洗脫的具體步驟如下：先用緩沖液(ph6.5的0.1m磷酸鹽緩沖液)以2bv/h的流速洗脫1bv，再用純水以2bv/h的流速繼續(xù)洗脫，洗脫液顏色先由無色變?yōu)榧t色至暗紅色，最后變?yōu)辄S色，收集紅色至暗紅色的洗脫液，即為富含吡咯喹啉醌的富集液(pqq富集液)。

上述方法中，所述步驟(3)的方法為用水將所述吡咯喹啉醌母液稀釋至濃度為4-5g/l，用濃鹽酸或者濃磷酸調(diào)節(jié)ph至3.0-3.5，析出紅褐色固體，靜置，離心，收集沉淀即得到吡咯喹啉醌粗晶體。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，用濃磷酸調(diào)節(jié)ph至3.5。

上述方法中，所述步驟(4)的方法為用水溶解所述吡咯喹啉醌粗晶體，得到濃度為10-15g/l的粗晶體溶液；用氫氧化鈉水溶液(1m)調(diào)節(jié)所述粗晶體溶液的ph至10.0-10.5，再用硫酸溶液(0.25m)調(diào)節(jié)ph至2.0-3.5，靜置，離心，收集沉淀即得到吡咯喹啉醌。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，用氫氧化鈉水溶液(1m)調(diào)節(jié)所述粗晶體溶液的ph至10.0或10.3或10.5，然后再根據(jù)實(shí)際需求，在10℃條件下用硫酸溶液(0.25m)調(diào)節(jié)ph至2.0-3.5：若用硫酸溶液調(diào)節(jié)ph至2.0時(shí)，可得到吡咯喹啉醌晶體；若用硫酸溶液調(diào)節(jié)ph至3.5時(shí)，可得到吡咯喹啉醌二鈉鹽晶體。

上述方法中，所述發(fā)酵液為以甲醇為唯一碳源的甲基營養(yǎng)菌發(fā)酵液。所述發(fā)酵液的具體制備方法如下：在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)甲基營養(yǎng)菌，得到所述發(fā)酵液。

上述方法中，所述甲基營養(yǎng)菌可為脫氮生絲微菌hyphomicrobiumdenitrificans或扭托甲基桿菌methylobacteriumextorquens。

所述脫氮生絲微菌hyphomicrobiumdenitrificans具體可為脫氮生絲微菌hyphomicrobiumdenitrificanscgmcc10620或脫氮生絲微菌hyphomicrobiumdenitrificansdsm1869；所述扭托甲基桿菌methylobacteriumextorquens具體可為扭托甲基桿菌methylobacteriumextorquenscgmcc1.6987。

上述方法中，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度具體為0.1m，ph具體為6.5。

上述方法中，所述靜置的條件為(4-10)℃靜置12h，所述靜置的條件具體為4℃靜置12h。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述方法的新用途。

本發(fā)明提供了上述方法在制備吡咯喹啉醌中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述方法在提高吡咯喹啉醌晶體純度中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)制備吡咯喹啉醌的方法。通過實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明的方法具有工藝操作簡單、銜接度高、產(chǎn)品回收率的特點(diǎn)，且制備得到的吡咯喹啉醌晶體的純度高于99.5％，晶型單一。

附圖說明

圖1為脫氮生絲微菌fjnu-r8發(fā)酵液制備的pqqna2晶體的性質(zhì)表征。a：hplc分析晶體純度；b：hplc-ms分析晶體吸收光譜及分子量；c：x-射線衍射分析晶型；d：差示掃描量熱法及熱重法分析晶體熔點(diǎn)和含水量。

圖2為脫氮生絲微菌dsm1869發(fā)酵液制備的pqqna2晶體的性質(zhì)表征。a：hplc分析晶體純度；b：hplc-ms分析晶體吸收光譜及分子量；c：x-射線衍射分析晶型；d：差示掃描量熱法及熱重法分析晶體熔點(diǎn)和含水量。

圖3為扭托甲基桿菌1.6987發(fā)酵液制備的pqqna2晶體的性質(zhì)表征。a：hplc分析晶體純度；b：hplc-ms分析晶體吸收光譜及分子量；c：x-射線衍射分析晶型；d：差示掃描量熱法及熱重法分析晶體熔點(diǎn)和含水量。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下面實(shí)施例中所使用的菌株如下：

脫氮生絲微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)fjnu-r8為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱cgmcc)的菌種，已于2015年3月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.10620。

脫氮生絲微菌(hyphomicrobiumdenitrificans)dsm1869為德國菌種保藏中心(簡稱dsmz)的菌種，dsmz編號為1869，在文獻(xiàn)“吡咯喹啉醌產(chǎn)生菌的篩選及其培養(yǎng)基優(yōu)化”中公開過，公眾可從申請人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

扭托甲基桿菌(methylobacteriumextorquens)為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱cgmcc)的菌種，cgmcc編號為1.6987。

下面實(shí)施例中所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：甲醇10g/l、無機(jī)氮源3g/l、磷酸二氫鉀2g/l、磷酸氫二鈉4g/l、硫酸鎂1g/l，微量元素液2ml/l，初始ph為6.8-7.0。上述無機(jī)氮源為硫酸銨或氯化銨。上述微量元素液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，其余溶質(zhì)及濃度如下：硫酸亞鐵80g/l、硫酸鋅22.5g/l、硫酸錳40g/l、硫酸銅5g/l、氯化鈉15g/l、鉬酸鈉0.3g/l、氯化鉀0.3g/l、氯化鈷0.03g/l、硼酸3g/l、氯化鈣300g/l。

下面實(shí)施例中所使用的大孔樹脂為非極性大孔樹脂，是美國羅門哈斯公司生產(chǎn)的xad18、xad1600n和xad16n大孔吸附樹脂。比表面積為800-1000m²/g，平均孔徑為15-23nm。

下面實(shí)施例中所使用的親水性c18硅膠填料，是華譜新創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)的c18hc填料。

下面實(shí)施例中所使用的磷酸鹽緩沖液為ph6.5的0.1m磷酸鹽緩沖液，是將68.5ml0.1mnah2po4水溶液和31.5ml0.1mna2hpo4水溶液混勻得到的。

實(shí)施例1、脫氮生絲微菌fjnu-r8生產(chǎn)吡咯喹啉醌

1、脫氮生絲微菌fjnu-r8的發(fā)酵培養(yǎng)及上清液的制備

(1)挑取fjnu-r8單菌落至裝有培養(yǎng)基的三角瓶中，在32℃，220rpm條件下培養(yǎng)24-36小時(shí)(od650在2.5-3.0之間，以種子培養(yǎng)基調(diào)零)，得到種子液。

將種子液按10％(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃發(fā)酵培養(yǎng)5-6天，得到發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)條件：裝液量(發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵罐的體積比)為70％，發(fā)酵過程中通過流加甲醇和氨水，使發(fā)酵液中甲醇濃度控制在1-2g/l，ph控制在6.8-7.0；攪拌關(guān)聯(lián)溶氧，溶氧量(do)控制在20-30％。

(2)將步驟(1)獲得的發(fā)酵液在10℃條件下10000×g離心5min，收集上清液；

(3)將步驟(2)獲得的上清液經(jīng)1kda的中空纖維膜過濾，收集濾液。

2、pqq的富集

將步驟1獲得的濾液的ph調(diào)節(jié)至3.0，以4bv/h的流速上大孔樹脂柱5bv，用磷酸鹽緩沖液(ph6.5的0.1m磷酸鹽緩沖液)以2bv/h的流速洗脫1bv，再用純水以2bv/h的流速繼續(xù)洗脫，洗脫液顏色先由無色變?yōu)榧t色至暗紅色，最后變?yōu)辄S色，收集紅色至暗紅色洗脫液，即為pqq富集液。

3、pqq的純化

將pqq富集液的ph調(diào)節(jié)至2.5，上裝有親水性c18硅膠填料的色譜柱，用磷酸鹽緩沖液洗脫，并用紫外檢測器檢測洗脫液330nm波長的紫外吸收值的變化情況，至紫外吸收值突然增大時(shí)(出現(xiàn)峰值)，收集pqq母液。

4、結(jié)晶

pqq母液用純水稀釋至4-5g/l，用濃磷酸(國藥集團(tuán))調(diào)節(jié)ph至3.5，有紅褐色固體析出，4℃下靜置12h，6000×g離心5min，棄上清，收集沉淀即得到pqq粗晶體。

5、重結(jié)晶

(1)用純水溶解pqq粗晶體至濃度為10-15g/l，用1m氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)ph至10.5，在10℃條件下用0.25m硫酸溶液緩慢調(diào)節(jié)ph至3.5，4℃下靜置12h，6000×g離心5min，收集沉淀，獲得純度高于99.5％、晶型單一的pqqna2晶體(pqq二鈉鹽晶體)。

(2)用純水溶解pqq粗晶體至濃度為10-15g/l，用1m氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)ph至10.5，在10℃條件下用0.25m硫酸溶液緩慢調(diào)節(jié)ph至2，4℃下靜置12h，6000×g離心5min，收集沉淀，獲得純度高于99.5％、晶型單一的pqq晶體。

6、晶體分析

(1)純度分析

采用高效液相色譜法，使用美國thermofisher液相色譜儀(u3000系統(tǒng)配有dad-3000檢測器)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行純度分析。高效液相色譜分析的條件如下：色譜柱：thermohypersilgoldc18(4.6×250mm，5μm)；流速：1ml/min；進(jìn)樣量：10μl；紫外檢測波長：249nm；流動(dòng)相a：h2o+0.1％tfa，b：乙腈；梯度洗脫：0-20min，5％乙腈-50％乙腈；20-30min，50％乙腈-100％乙腈。

結(jié)果如1-a所示。結(jié)果表明所獲得的紅色結(jié)晶物(pqqna2晶體)純度達(dá)到99.91％。

(2)質(zhì)譜鑒定

采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，使用美國thermofisher液質(zhì)聯(lián)用儀(u3000系統(tǒng)配有dad-3000檢測器和lcfleet質(zhì)譜儀)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。lcfleet質(zhì)譜儀設(shè)置條件如下：電離源：電噴霧電離源(esi)；檢測方式：正離子檢測；掃描范圍：100-1000da；噴霧電壓：4.0kv；離子傳輸管溫度：350℃；離子傳輸管電壓：10v；套管透鏡電壓：75v。

結(jié)果如1-b所示。結(jié)果表明所獲得的紅色結(jié)晶物(pqqna2晶體)的確為pqq二鈉鹽晶體。

(3)晶型檢測

采用x射線衍射法，使用日本ricohx-射線衍射儀(rigakud/max-2500)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行晶型檢測。x-射線衍射條件如下：x射線：cukα靶；管電壓：40kv；管電流：100ma；發(fā)射狹縫：1°；防散射狹縫：1°；接受狹縫：0.3mm；掃描速度：20°/min；采樣密度：0.02。

結(jié)果如1-c所示。結(jié)果表明所獲得的pqqna2晶體的晶型單一。

(4)含水量及熔點(diǎn)分析

采用熱重分析法和差示掃描量熱法，使用美國ta熱重分析儀(tgaq500)和差示掃描量熱儀(dscq2000)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行含水量和熔點(diǎn)分析。分析條件如下：升溫范圍：25-350℃；氮?dú)饬髁浚?0ml/min；升溫速率：10℃/min。

結(jié)果如1-d所示。結(jié)果表明所獲得的pqqna2晶體的熔點(diǎn)為122.39℃，含水量為13.05％。

實(shí)施例2、脫氮生絲微菌dsm1869生產(chǎn)吡咯喹啉醌

1、脫氮生絲微菌dsm1869的發(fā)酵培養(yǎng)及上清液的制備

(1)挑取dsm1869單菌落至裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在32℃，220rpm條件下培養(yǎng)24-36小時(shí)(od650在2.5-3.0之間，以種子培養(yǎng)基調(diào)零)，得到種子液。

將種子液按10％(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃發(fā)酵培養(yǎng)7-8天，得到發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)條件：裝液量為70％，發(fā)酵過程中通過流加甲醇和氨水，使發(fā)酵液中甲醇濃度控制在1-2g/l，ph控制在6.8-7.0；攪拌關(guān)聯(lián)溶氧，溶氧量(do)控制在20-30％。

(2)將步驟(1)獲得的發(fā)酵液在10℃條件下10000×g離心5min，收集上清液；

(3)將步驟(2)獲得的上清液經(jīng)1kda的中空纖維膜過濾，收集濾液。

2、pqq的富集

將步驟1獲得的濾液的ph調(diào)節(jié)至3.0，以4bv/h的流速上大孔樹脂柱15bv，用磷酸鹽緩沖液以2bv/h的流速洗脫1bv，再用純水以2bv/h的流速繼續(xù)洗脫，洗脫液顏色先由無色變?yōu)榧t色至暗紅色，最后變?yōu)辄S色，收集紅色至暗紅色洗脫液，即為pqq富集液。

3、pqq的純化

pqq富集液的ph調(diào)節(jié)至2.5，上裝有親水性c18硅膠填料的色譜柱，用磷酸鹽緩沖液洗脫，并用紫外檢測器檢測洗脫液330nm波長的紫外吸收值的變化情況，至紫外吸收值突然增大時(shí)(出現(xiàn)峰值)，收集pqq母液。

4、結(jié)晶

pqq母液用純水稀釋至4-5g/l，用濃磷酸調(diào)節(jié)ph至3.5，有紅褐色固體析出，4℃下靜置12h，6000×g離心5min，棄上清，收集沉淀即得到pqq粗晶體。

5、重結(jié)晶

(1)用純水溶解pqq粗晶體至濃度為10-15g/l，用1m氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)ph至10.0，在10℃條件下用0.25m硫酸緩慢調(diào)節(jié)ph至3.5，4℃下靜置12h，6000×g離心5min，收集沉淀，獲得純度高于99.5％、晶型單一的pqqna2晶體(pqq二鈉鹽晶體)。

(2)用純水溶解pqq粗晶體至濃度為10-15g/l，用1m氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)ph至10.5，在10℃條件下用0.25m硫酸溶液緩慢調(diào)節(jié)ph至2，4℃下靜置12h，6000×g離心5min，收集沉淀，獲得純度高于99.5％、晶型單一的pqq晶體。

6、晶體分析

(1)純度分析

采用高效液相色譜法，使用美國thermofisher液相色譜儀(u3000系統(tǒng)配有dad-3000檢測器)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行純度分析。高效液相色譜分析的條件如下：色譜柱：thermohypersilgoldc18(4.6×250mm，5μm)；流速：1ml/min；進(jìn)樣量：10μl；紫外檢測波長：249nm；流動(dòng)相a：h2o+0.1％tfa，b：乙腈；梯度洗脫：0-20min，5％乙腈-50％乙腈；20-30min，50％乙腈-100％乙腈。

結(jié)果如2-a所示。結(jié)果表明獲得的紅色結(jié)晶物(pqqna2晶體)純度達(dá)到99.88％。

(2)質(zhì)譜鑒定

采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，使用美國thermofisher液質(zhì)聯(lián)用儀(u3000系統(tǒng)配有dad-3000檢測器和lcfleet質(zhì)譜儀)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。lcfleet質(zhì)譜儀設(shè)置條件如下：電離源：電噴霧電離源(esi)；檢測方式：正離子檢測；掃描范圍：100-1000da；噴霧電壓：4.0kv；離子傳輸管溫度：350℃；離子傳輸管電壓：10v；套管透鏡電壓：75v。

結(jié)果如2-b所示。結(jié)果表明所獲得的紅色結(jié)晶物(pqqna2晶體)的確為pqq二鈉鹽晶體。

(3)晶型檢測

采用x射線衍射法，使用日本ricohx-射線衍射儀(rigakud/max-2500)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行晶型檢測。x-射線衍射條件如下：x射線：cukα靶；管電壓：40kv；管電流：100ma；發(fā)射狹縫：1°；防散射狹縫：1°；接受狹縫：0.3mm；掃描速度：20°/min；采樣密度：0.02。

結(jié)果如2-c所示。結(jié)果表明所獲得的pqqna2晶體的晶型單一。

(4)含水量及熔點(diǎn)分析

采用熱重分析法和差示掃描量熱法，使用美國ta熱重分析儀(tgaq500)和差示掃描量熱儀(dscq2000)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行含水量分析。分析條件如下：升溫范圍：60-400℃；氮?dú)饬髁浚?00ml/min；升溫速率：10℃/min。

結(jié)果如2-d所示。結(jié)果表明所獲得的pqqna2晶體的熔點(diǎn)為122.70℃，含水量為12.52％。

實(shí)施例3、扭托甲基桿菌cgmcc1.6987生產(chǎn)吡咯喹啉醌

1、扭托甲基桿菌cgmcc1.6987的發(fā)酵培養(yǎng)及上清液的制備

(1)挑取cgmcc1.6987單菌落至裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，在32℃，220rpm條件下培養(yǎng)24-36小時(shí)(od650在2.5-3.0之間，以種子培養(yǎng)基調(diào)零)，得到種子液。

將種子液按10％(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃發(fā)酵培養(yǎng)4-5天，得到發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)條件：裝液量為70％，發(fā)酵過程中通過流加甲醇和氨水，使發(fā)酵液中甲醇濃度控制在1-2g/l，ph控制在6.8-7.0；攪拌關(guān)聯(lián)溶氧，溶氧量(do)控制在20-30％。

(2)將步驟(1)獲得的發(fā)酵液在10℃條件下10000×g離心5min，收集上清液；

(3)將步驟(2)獲得的上清液經(jīng)1kda的中空纖維膜過濾，收集濾液。

2、pqq的富集

將步驟1獲得的濾液的ph調(diào)節(jié)至3.0，以4bv/h的流速上大孔樹脂柱25bv，用磷酸鹽緩沖液以2bv/h的流速洗脫1bv，再用純水以2bv/h的流速繼續(xù)洗脫，洗脫液顏色先由無色變?yōu)榧t色至暗紅色，最后變?yōu)辄S色，收集紅色至暗紅色洗脫液，即為pqq富集液。

3、pqq的純化

pqq富集液的ph調(diào)節(jié)至2.5，上裝有親水性c18硅膠填料的色譜柱，用磷酸鹽緩沖液洗脫，并用紫外檢測器檢測洗脫液330nm波長的紫外吸收值的變化情況，至紫外吸收值突然增大時(shí)(出現(xiàn)峰值)，收集pqq母液。

4、結(jié)晶

pqq母液用純水稀釋至4-5g/l，用濃磷酸調(diào)節(jié)ph至3.5，有紅褐色固體析出，4℃下靜置12h，6000×g離心5min，棄上清，收集沉淀即得到pqq粗晶體。

5、重結(jié)晶

(1)用純水溶解pqq粗晶體至濃度為10-15g/l，用1m氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)ph至10.3，在10℃條件下用0.25m硫酸緩慢調(diào)節(jié)ph至3.5，4℃下靜置12h，6000×g離心5min，收集沉淀，獲得純度高于99.5％、晶型單一的pqqna2晶體(pqq二鈉鹽晶體)。

(2)用純水溶解pqq粗晶體至濃度為10-15g/l，用1m氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)ph至10.5，在10℃條件下用0.25m硫酸溶液緩慢調(diào)節(jié)ph至2，4℃下靜置12h，6000×g離心5min，收集沉淀，獲得純度高于99.5％、晶型單一的pqq晶體。

6、晶體分析

(1)純度分析

采用高效液相色譜法，使用美國thermofisher液相色譜儀(u3000系統(tǒng)配有dad-3000檢測器)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行純度分析。高效液相色譜分析的條件如下：色譜柱：thermohypersilgoldc18(4.6×250mm，5μm)；流速：1ml/min；進(jìn)樣量：10μl；紫外檢測波長：249nm；流動(dòng)相a：h2o+0.1％tfa，b：乙腈；梯度洗脫：0-20min，5％乙腈-50％乙腈；20-30min，50％乙腈-100％乙腈。

結(jié)果如3-a所示。結(jié)果表明獲得的紅色結(jié)晶物(pqqna2晶體)純度達(dá)到99.83％。

(2)質(zhì)譜鑒定

采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，使用美國thermofisher液質(zhì)聯(lián)用儀(u3000系統(tǒng)配有dad-3000檢測器和lcfleet質(zhì)譜儀)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。lcfleet質(zhì)譜儀設(shè)置條件如下：電離源：電噴霧電離源(esi)；檢測方式：正離子檢測；掃描范圍：100-1000da；噴霧電壓：4.0kv；離子傳輸管溫度：350℃；離子傳輸管電壓：10v；套管透鏡電壓：75v。

結(jié)果如3-b所示。結(jié)果表明所獲得的紅色結(jié)晶物(pqqna2晶體)的確為吡咯喹啉醌晶體。

(3)晶型檢測

采用x射線衍射法，使用日本ricohx-射線衍射儀(rigakud/max-2500)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行晶型檢測。x射線衍射的條件如下：x射線：cukα靶；管電壓：40kv；管電流：100ma；發(fā)射狹縫：1°；防散射狹縫：1°；接受狹縫：0.3mm；掃描速度：20°/min；采樣密度：0.02。

結(jié)果如3-c所示。結(jié)果表明所獲得的pqqna2晶體的晶型單一。

(4)含水量及熔點(diǎn)分析

采用熱重分析法和差示掃描量熱法，使用美國ta熱重分析儀(tgaq500)和差示掃描量熱儀(dscq2000)對獲得的pqqna2晶體進(jìn)行含水量分析。分析條件如下：升溫范圍：60-400℃；氮?dú)饬髁浚?00ml/min；升溫速率：10℃/min。

結(jié)果如3-d所示。結(jié)果表明所獲得的pqqna2晶體的熔點(diǎn)為122.74℃，含水量為13.42％。