本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種甘藍(lán)型油菜與擬南芥中nac87轉(zhuǎn)錄因子基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葉片衰老代表了葉片發(fā)育的后期階段，關(guān)系到養(yǎng)分的轉(zhuǎn)移與再利用，用于保障生殖生長(zhǎng)的順利進(jìn)行，而且衰老有助于植物適應(yīng)多變的環(huán)境條件。因此，研究調(diào)控葉片衰老的基因并用于改良作物的抗逆、抗病性、提高作物的產(chǎn)量與品質(zhì)，意義非常重大。

國(guó)內(nèi)外的多個(gè)報(bào)道表明，延緩植物的衰老是一個(gè)有效地提高植物抗旱性進(jìn)而提高產(chǎn)量的方法。擬南芥是重要的模式植物，同屬十字花科的甘藍(lán)型油菜則是我國(guó)重要的油料作物，兩者的基因的相似性較高，平均達(dá)80％以上，因此可以相互借鑒、相互促進(jìn)。環(huán)境脅迫包括干旱以及冷害等嚴(yán)重影響菜籽的產(chǎn)量與品質(zhì)。利用分子生物學(xué)與遺傳學(xué)方法，挖掘油菜中調(diào)控抗逆的基因并闡明它們?cè)谠鰪?qiáng)油菜抗逆性上的應(yīng)用，通過分子輔助的育種技術(shù)培育高產(chǎn)、抗逆的油菜新品種，是一條行之有效的途徑。

在葉片衰老的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著核心調(diào)控作用。目前，已鑒定、發(fā)現(xiàn)了擬南芥中一些能顯著促進(jìn)或延緩葉片衰老的轉(zhuǎn)錄因子，比如wrky53、wrky75、nap(anac029)、ataf1(anac002)、jub1(anac042)、ore1(anac092)等。研究表明，這些基因在植物中的表達(dá)水平不僅決定葉片衰老的速度，而且也調(diào)控對(duì)于干旱、鹽害等的耐受性，說明具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但是，油菜中有哪些基因調(diào)控葉片衰老，至今未見任何報(bào)道。

nac(nam，ataf,cuc)轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中特有的，構(gòu)成較大的基因家族，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、激素應(yīng)答以及提高植物對(duì)干旱、鹽害、冷害等逆境的耐受中發(fā)揮著重要作用。但是，有關(guān)油菜中調(diào)控葉片衰老與抗逆的nac基因的鑒定與研究，鮮見報(bào)道。而且，即使在模式植物擬南芥中，由于nac基因眾多，僅有少數(shù)被研究過，還有很多nac基因的功能尚待解析。

nac轉(zhuǎn)錄因子基因是植物特有的基因家族，廣泛存在于陸生植物中。最早被發(fā)現(xiàn)參與矮牽牛與水稻的胚胎發(fā)育、器官建成以及花發(fā)育。nac轉(zhuǎn)錄因子的一般特點(diǎn)是在氨基端有一個(gè)高度保守的約含160個(gè)氨基酸殘基的能結(jié)合下游靶基因的啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件(nacrecognitionsequence,nacrs)的nac結(jié)構(gòu)域，羧基端有一個(gè)高度可變的調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的區(qū)域。擬南芥與水稻基因組中分別有117、151個(gè)nac基因，劃分為8個(gè)亞類，其中僅有部分nac的功能被研究報(bào)道過。該基因家族成員功能多樣，有研究表明其功能主要與植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)控以及植物對(duì)干旱、高鹽、低溫等非生物和病原菌侵染等生物脅迫的抗逆反應(yīng)相關(guān)。例如，擬南芥的nap(anac029)調(diào)控依賴脫落酸(aba)的葉片與果實(shí)的衰老,并且jub1(anac042)、ore1(anac092)、ors1(anac059)、anac016以及anac019/055/072也被發(fā)現(xiàn)調(diào)控葉片衰老；而且ore1、anac016與anac019/055/072調(diào)控的葉片衰老與葉綠素的降解有關(guān)。此外，擬南芥anac016還被發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控areb1/abf2轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)而影響植物的抗旱性，再一次暗示葉片的衰老進(jìn)程與抗旱等性能緊密相關(guān)。但是，油菜以及擬南芥中有無其他的nac轉(zhuǎn)錄因子基因調(diào)控葉片衰老以及抗逆等，并不清楚，尚待進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種甘藍(lán)型油菜與擬南芥中nac87轉(zhuǎn)錄因子基因及其應(yīng)用。發(fā)明人在前期開展有關(guān)甘藍(lán)型油菜中nac轉(zhuǎn)錄因子基因家族的研究的基礎(chǔ)上，首先根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)序列標(biāo)簽(est)信息，設(shè)計(jì)基因特異性引物，從油菜cdna中克隆獲得nac87轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)cdna，并且在油菜以及煙草中進(jìn)行功能驗(yàn)證。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)擬南芥的同源基因anac087也具有類似地誘導(dǎo)活性氧積累與葉片衰老的功能。

其具體技術(shù)方案為：

一種甘藍(lán)型油菜與擬南芥中nac87轉(zhuǎn)錄因子基因，油菜nac87轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸如seqidno:1所示，氨基酸如seqidno:2所示，擬南芥nac87轉(zhuǎn)錄因子基因的核苷酸如seqidno:3所示，氨基酸如seqidno:4所示。

本發(fā)明所述甘藍(lán)型油菜與擬南芥中nac87轉(zhuǎn)錄因子基因在調(diào)控葉片衰老以及抗逆過程中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，利用本發(fā)明所述的nac87基因促進(jìn)葉片衰老的方法，是將nac87構(gòu)建到過表達(dá)載體pyjha,然后導(dǎo)入宿主植物的細(xì)胞、組織或植株個(gè)體，得到衰老速度加快的植株。利用本發(fā)明所述的nac87基因延緩葉片衰老的方法，是通過生物技術(shù)手段將nac87基因敲除或沉默，得到衰老速度延遲的植株。

進(jìn)一步，所述宿主植物為擬南芥和油菜。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)油菜與擬南芥的nac87同源基因均能正調(diào)控葉片衰老，并且與活性氧的累積相關(guān)，在調(diào)控作物的抗逆以及抗病方面也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1是油菜與擬南芥中nac87基因的rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)，其中，m，1kbdna分子量標(biāo)準(zhǔn)(fermentas)；1,油菜nac87基因的擴(kuò)增；2，擬南芥nac87基因的擴(kuò)增。

圖2是油菜nac87在葉片發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)含量的實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr分析，數(shù)值來自三個(gè)生物學(xué)重復(fù)±標(biāo)準(zhǔn)方差；

圖3是擬南芥中anac087基因的t-dna插入突變體的pcr鑒定，m，1kbdna分子量標(biāo)準(zhǔn)(fermentas)。wt表示野生型col-0；1-13代表13個(gè)獨(dú)立的株系。a是lp+rp引物組合的pcr擴(kuò)增的電泳檢測(cè)圖；b是gabi8409+rp引物組合的pcr擴(kuò)增的電泳檢測(cè)圖。

圖4是擬南芥nac87基因的突變體與過表達(dá)株系的表型分析，其中圖4a為野生型col-0，圖4b為anac087突變體，圖4c為anac087的過表達(dá)株系；

圖5是nac87的表達(dá)誘導(dǎo)活性氧(ros)的累積與葉片提前衰老，其中圖5a通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射，瞬時(shí)表達(dá)bnanac87及gus對(duì)照基因，分別是2、3、4天時(shí)觀察表型并進(jìn)行dab染色。左側(cè)為葉片正面，中間為背面，右側(cè)為dab染色后的背面拍照，圖5b是bnanac87及gus表達(dá)材料的相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定分析，圖5c是bnanac87及gus表達(dá)材料的雙氧水含量的測(cè)定分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)是三個(gè)獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值±s.e，不同字母代表顯著性差異(anova分析)；

圖6是nac87的表達(dá)誘導(dǎo)葉片衰老的生理生化指標(biāo)的測(cè)定分析，其中圖6a是bnanac87及gus表達(dá)材料的葉綠素含量的測(cè)定分析，圖6b是bnanac87及gus表達(dá)材料的花青素含量的測(cè)定分析，圖6c是bnanac87及gus表達(dá)材料的丙二醛含量的測(cè)定分析，相關(guān)數(shù)據(jù)是三個(gè)獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)的平均值±s.e，不同的字母表示顯著性差異(anova分析)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。

本發(fā)明提供了一種甘藍(lán)型油菜與擬南芥中nac87轉(zhuǎn)錄因子基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。

本發(fā)明涉及的甘藍(lán)型油菜與擬南芥的基因，名稱分別為bnanac87與anac087，其基因座位號(hào)分別是bnac02g07990d、at5g18270，編碼的蛋白分別含有337、335個(gè)氨基酸殘基。

含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因植株也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的保護(hù)范圍還包括基因nac87在調(diào)控葉片衰老以及抗逆中的應(yīng)用，該植物為擬南芥和油菜。

利用該nac87基因促進(jìn)葉片衰老的方法，是將nac87構(gòu)建到過雙元表達(dá)載體pyjha,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，導(dǎo)入宿主植物的細(xì)胞、組織或植株個(gè)體，得到衰老速度加快的植株。利用本發(fā)明所述的nac87基因延緩葉片衰老的方法，是通過生物技術(shù)手段(比如rna干涉、t-dna插入突變或crispr-cas9基因組編輯)將nac87基因敲除或沉默，得到衰老速度延遲的植株。

以上所說的植物宿主為擬南芥和油菜。

實(shí)施例i油菜nac87基因cdna序列的克隆與序列測(cè)定

根據(jù)ncbiest數(shù)據(jù)庫(kù)以及tair公用數(shù)據(jù)庫(kù)的序列信息，分別設(shè)計(jì)基因特異性的兩對(duì)引物，分別以甘藍(lán)型油菜與擬南芥col-0生態(tài)型的cdna為模板擴(kuò)增基因的編碼區(qū)，引物序列為(下劃線表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))：

bnanac87-f:5'-ttaggtcatgatcgcggttgttgttgttgaaga-3'

bnanac87-r:5'-cgcgtcgacgtagtcccataagatccctcttaag-3'

anac087-f：5'-ggactagtgcggttgtggttgaagaa-3'，

anac087-r:5’-cgcgtcgacgaagtcccacaagtcccccct-3’。

采用plantrnakit(omegabio-tek)提取油菜與擬南芥col-0幼苗的總rna，經(jīng)過nanodrop1000定量與電泳檢測(cè)后，各取2.5μg總rna，采用revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(fermentas)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按說明書進(jìn)行。

2.pcr反應(yīng)體系(50μl)

5xprimestarbuffer10μl

cdna模板：1μl

dntps(10mmeach)1μl

primerf(20μμ)1μl

primerr(20μμ)1μl

primestardnapolymerase(takara)0.5μl

ddh2o加至終體積50μl

3.pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃變性30sec，50℃復(fù)性30sec，72℃延伸1min，循環(huán)35次；72℃延伸10min。

4.1％瓊脂糖凝膠電泳

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)在1kb處有一條目的條帶如附圖1所示。

5.擴(kuò)增片段的回收、酶切以及與pjet1.2載體的鏈接

對(duì)擴(kuò)增條帶采用omegabio-tek公司的瓊脂糖膠回收試劑盒，步驟按說明書進(jìn)行。

對(duì)回收片段，通過平末端克隆的方法，克隆入pjet1.2載體(fermentas)，按照clonejetpcrcloningkit(fermentas)的說明書進(jìn)行。

本實(shí)驗(yàn)所用的pjet1.2載體的多克隆位點(diǎn)的上游有t7啟動(dòng)子、下游有pjet1.2-r引物結(jié)合的序列，所以可以用這兩個(gè)引物序列對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙向測(cè)序。結(jié)果表明，我們獲得了甘藍(lán)型油菜與擬南芥的nac87基因的cdna序列。

nac87轉(zhuǎn)錄因子基因在發(fā)育過程中的表達(dá)分析

i.材料處理

甘藍(lán)型油菜種子經(jīng)過次氯酸鈉消毒處理后，播種在1/2xms培養(yǎng)基上，于4℃層積處理兩天后，置于萌發(fā)7天，然后移栽到泥炭土基質(zhì)，放于溫室正常生長(zhǎng)，三周時(shí)取幼嫩葉片、4周時(shí)取成熟的葉片、5周時(shí)取早期衰老的葉片、6周時(shí)取晚期衰老的葉片，分別用液氮速凍后存于-80℃冰箱。

2.trizol(sangon)法提取油菜葉片的總rna，按照說明書進(jìn)行。

用nanodrop1000檢測(cè)rna的濃度與純度，根據(jù)1od＝40ug/ml計(jì)算濃度。根據(jù)在230nm、260nm和280nm處的吸光值，檢測(cè)rna的純度，純r(jià)na的od260/od280應(yīng)為1.9左右，od260/od230應(yīng)大于2。

采用revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(fermentas)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按說明書進(jìn)行。

以10倍稀釋的cdna為模板，進(jìn)行定量pcr反應(yīng)，采用sybrpremixextaqtm‖(perfectrealtime,takara)試劑盒，在cfx96(bio-rad)儀器上進(jìn)行。引物如下：

qpcr體系

2xsybrgreenimix5μl

primerqf(20μμ)0.2μl

primerqr(20μμ)0.2μl

ddh2o2.6μl

cdna模板2μl

totalvolume10μl

pcr程序

95℃2min；94℃30s；60℃1min；35cycles。

根據(jù)內(nèi)參基因bnaup1與bnaubc9，計(jì)算目的基因在各個(gè)組織材料中的表達(dá)倍數(shù)。結(jié)果表明油菜的nac87基因傾向于在正在衰老的葉片內(nèi)表達(dá)(圖2)。

植物過表達(dá)載體的構(gòu)建

植物表達(dá)載體pyjha是含有camv35s啟動(dòng)子和hptii(潮霉素)植物選擇標(biāo)記基因的雙元載體，在其多克隆位點(diǎn)上含有限制性內(nèi)切酶ncoi、spei和sali等位點(diǎn)。用限制性內(nèi)切酶ncoi或spei和sali雙酶切載體pyjha；同時(shí)，用bsphi和sali雙酶切目的基因片斷。完全酶切的載體在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離后，經(jīng)膠回收，然后與雙酶切的目的基因片段連結(jié)，構(gòu)建獲得植物表達(dá)載體pyjha-bnanac87與pyjha-anac087。

(i)質(zhì)粒pyjha空載體和目的基因片斷雙酶切體系如下：

ncoi(或者spei)0.5μl

sali0.5μl

雙酶切過的pyjha載體或目的基因片段3μl

10xbuffer1.5μl

ddh2oto15μl

于37℃恒溫水浴鍋酶切4小時(shí)；

酶切產(chǎn)物的電泳與回收:雙酶切完成后，以1xtae為電泳緩沖液，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下用潔凈刀片切下pyjha中載體的11kb大片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(omegabio-tek)回收目的條帶；目的基因片段用pcr產(chǎn)物純化試劑盒(omegabio-tek)回收。

連接：經(jīng)酶切的pyjha載體片段和目的基因片段以摩爾比1:3的比例進(jìn)行16℃連接2小時(shí)；

采用常規(guī)的cacl2介導(dǎo)的熱激法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞之后，通過菌落pcr篩選陽(yáng)性克隆，

本實(shí)驗(yàn)所用的pyjha載體，根據(jù)genbank中登陸過的pcsgfpbt載體改造而來，在基因的編碼區(qū)的末尾增加了2xha親和標(biāo)簽序列，設(shè)計(jì)了上下游測(cè)序引物，所以可以用這兩個(gè)引物對(duì)插入片段進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定；

pcr程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，50℃復(fù)性1min，72℃延伸lmin，循環(huán)35次；72℃延伸5min；

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖電泳檢測(cè)，然后挑取兩個(gè)陽(yáng)性克隆搖菌，用質(zhì)粒小量提取試劑盒(omegabio-tek)提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒送至生物公司采用abi3730儀器雙向測(cè)序。

農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化

采用cacl2法制備根癌農(nóng)桿菌gv3101的感受態(tài)細(xì)胞，采用凍融法將上述pyjha-nac87重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌細(xì)胞。涂于含34μg/ml利福平、25μg/ml慶大霉素、50μg/ml卡那霉素的yeb培養(yǎng)基平板上，28℃倒置暗培養(yǎng)2天。

菌落pcr鑒定驗(yàn)證重組質(zhì)粒確已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

菌體pcr所用引物以及擴(kuò)增條件等同上述。

轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證一擬南芥轉(zhuǎn)化、篩選及表型分析

擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

首先小量培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌，然后轉(zhuǎn)入大量(330ml)培養(yǎng)，直至od600達(dá)到1.2。離心收集菌體，等量重懸于含有5％蔗糖、1/2xms以及0.03％silwetl-77的溶液中，將約5周的處于盛花前期的野生型擬南芥col-0倒扣并使所有花序浸入懸浮菌液中，輕輕攪動(dòng)蘸花30sec，取出花盆側(cè)放于托盤中，蓋蓋，將托盤置暗處放置14h,然后取出營(yíng)養(yǎng)缽并直立放置,恢復(fù)光照,繼續(xù)培養(yǎng)植株至成熟并收獲種子。

陽(yáng)性植株的篩選：t1代種子用次氯酸鈉溶液(包括0.03％tween-20)消毒后，點(diǎn)播在1/2xms選擇培養(yǎng)板(含有30mg/l潮霉素)上，于4℃下層積2天，移入培養(yǎng)室中培養(yǎng)，7天后挑選潮霉素抗性植株(長(zhǎng)出真葉1～2對(duì)，根伸長(zhǎng)至培養(yǎng)基中)并移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中，培養(yǎng)直至種子成熟，采用同樣的方法篩選t2代種子得到t3代植株，并在t2代植物中挑選抗性比為3:1的單插入獨(dú)立株系，并獲得純合t3代株系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測(cè)和表型鑒定；

轉(zhuǎn)基因擬南芥的rt-pcr鑒定與高表達(dá)株系的篩選

采用plantrnakit(omegabio-tek)提取t2代植物與野生型col-0葉片的總rna，經(jīng)過nanodrop1000定量后，各取2.5μg總rna，采用revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(fermentas)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按說明書進(jìn)行。

定量rt-pcr篩選高表達(dá)株系

以10倍稀釋的cdna為模板，進(jìn)行定量pcr反應(yīng)，采用sybrpremixextaqtm‖(perfectrealtime,takara)試劑盒，在cfx96(bio-rad)儀器上進(jìn)行。引物如下

atubq10-qf：5’-gttccaatctatgagggatacacgc-3’

atubq10-qr:5’-agaagttcgacttgtcattagaaagaaa-3’

anac087-qf:5’-ttggttctgcttcgggctctacg-3’

anac087-qr：5'-ccattcccatcatccccatttctt-3'

qpcr體系

2xsybrgreenimix5μl

primerqf(20μμ)0.2μl

primerqr(20μμ)0.2μl

ddh2o2.6μl

cdna模板2μl

totalvolume10μl

pcr程序

95℃2min；94℃30s；60℃1min；35cycles。

根據(jù)內(nèi)參基因atubq10的擴(kuò)增情況，與野生型比較，計(jì)算目的基因在各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)倍數(shù)。

突變體的鑒定

從英國(guó)nasc購(gòu)得擬南芥anac087基因的t-dna插入突變體gabi_622h06種子，播種在營(yíng)養(yǎng)土表面，4℃層積處理兩天后放置于溫室萌發(fā)，對(duì)四周齡的幼苗，取一片真葉，用常規(guī)的2％ctab法提取基因組dna，溶解于20ul1xte緩沖液中。利用taq聚合酶、兩對(duì)引物(gabi-8409+rp、lp+rp)，以野生型col-0與突變體的基因組dna作為模板，進(jìn)行常規(guī)pcr擴(kuò)增，然后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)帶型篩選出純合的突變體株系(圖3)。

所用引物序列如下：

lp：5’-tcgttgggatgaagaaaacac-3’

rp:5’-tcccaaattatcacaatcctttc-3’

gabi-8409：5’-atattgaccatcatactcattgc-3’

轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定

將t3代純合的擬南芥株系的種子與野生型col-0種子，分別用次氯酸鈉溶液消毒2分鐘，然后用無菌水漂洗4次，點(diǎn)播于1/2xms(含有1％蔗糖)培養(yǎng)基平板上，于4℃層積處理2天，然后放在溫室中豎直生長(zhǎng)7天，22℃培養(yǎng)，14h/10h光周期,光強(qiáng)100μmol·m^-2·s^-1。然后，將萌發(fā)7天的擬南芥幼苗(對(duì)照及轉(zhuǎn)基因株系)用滅菌過的鑷子小心移至盆缽(里面有營(yíng)養(yǎng)土)，繼續(xù)在同一溫室生長(zhǎng)并觀察表型，結(jié)果表明轉(zhuǎn)anac087基因的擬南芥植株的葉片衰老進(jìn)程明顯快于野生型對(duì)照植株，而功能喪失的突變體則表現(xiàn)出一定程度的延緩衰老的表型(圖4)。說明本發(fā)明涉及的擬南芥anac087基因的的確能調(diào)控植物葉片衰老的進(jìn)程。

煙草葉片的瞬時(shí)表達(dá)

轉(zhuǎn)化有pyjha-nac87重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，在yeb液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)過夜，同樣的方法培養(yǎng)抑制基因沉默的p19菌株，次日分別離心收集菌體，將得到的菌體分別用新鮮配制的as溶液(10mmmes-koh，10mmmgcl2，0.15mm乙酰丁香酮)重懸，使其od600達(dá)到0.5后，按照1：1(v/v)等體積混勻，對(duì)照為轉(zhuǎn)化有pyjha-gus的農(nóng)桿菌，黑暗靜置2-3h后共注射30d的本氏煙草葉片的下表皮。繼續(xù)在溫室中生長(zhǎng)，光周期為14小時(shí)光照、10小時(shí)黑暗，光強(qiáng)為120μmolm^-2sec^-1，濕度為60-70％。觀察、記錄表型并取樣檢測(cè)以下生理指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)油菜nac87的瞬時(shí)表達(dá)能顯著增加活性氧的累積與加快葉片的衰老(圖5)。

二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidine，dab)染色

將葉片剪下，放入12cm培養(yǎng)皿，加入50mldab染色液，確保葉片完全浸入到染色液中，用鋁箔紙蓋住培養(yǎng)皿，80-100rpm振蕩4-5小時(shí)。移去dab，加入70ml脫色液(乙醇:乙酸:甘油3:1:1),放于沸水浴中脫色15min。移去脫色液，換上新的脫色液，保持30min即可，拍照記錄結(jié)果。

電導(dǎo)率測(cè)定

用1cm直徑的打孔器取直徑為1cm的葉圓片，轉(zhuǎn)入含5mlddh2o的離心管中，抽真空處理10min，在25℃搖床中150rpm培育30min，利用電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率并記錄數(shù)據(jù)，記錄為c1。將上述樣品煮沸5min，冷卻至室溫后，再次測(cè)定樣品電導(dǎo)率(c2)。同時(shí)檢測(cè)ddh2o的電導(dǎo)率作為c0，計(jì)算相對(duì)導(dǎo)電率(c1-c0)/(c2-c0)*100％。

葉綠素含量測(cè)定

稱取約100mg的葉圓片，置于盛有5ml無水乙醇的指形管中，室溫黑暗旋轉(zhuǎn)振蕩過夜，次日利用分光光度計(jì)測(cè)定649及665nm波長(zhǎng)處吸光值，計(jì)算葉綠素含量。葉綠素(μg/gfw)＝(6.1*od665+20.04*od649)/樣品鮮重(gfw)。

花青素含量的測(cè)定：取約100mg的葉圓片，記錄鮮重，用液氮充分研磨，用甲醇(含1％hcl)4℃黑暗旋轉(zhuǎn)混合過夜，次日檢測(cè)530nm及657nm波長(zhǎng)下的吸光值，計(jì)算花青素的含量?；ㄇ嗨?mgfw＝(od530-od657)*1000/樣品鮮重(mgfw)。

丙二醛含量的測(cè)定

取新鮮葉圓片，稱重記錄后用液氮充分研磨，加1ml10％的三氯乙酸(tca)重懸混勻，65℃水浴15min，轉(zhuǎn)速10000g離心10min后吸取700μl上清，加入等量0.6％的硫代巴比妥酸(tba)混勻，90℃水浴15min后，冷卻至室溫，取上清檢測(cè)在532nm和600nm波長(zhǎng)處的吸光值并計(jì)算其含量。計(jì)算公式：mda(μmol/gfw)＝[6.45*(od532-od600)-0.56*od450]*提取液總體積(ml)*10^-3/樣品鮮重(gfw)。

h2o2含量的測(cè)定

取新鮮的葉圓片，稱重并記錄后用液氮充分研磨，加入5％tca充分混勻，65℃水浴15min，冷卻至室溫后，加200μl氯仿：異戊醇(24：1，v/v)充分混勻，轉(zhuǎn)速12000g離心10min。轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，用1m氨水調(diào)ph至7.5。設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，其中對(duì)照組加過氧化氫酶(cat,sigma)處理。取100μl樣品至新的離心管，后各管加400μltris-hcl(ph8.5)。反應(yīng)30min后，加入500μlpar溶液[30mmpotassiumtitaniumoxalate：30mm4-pyridylazoresorcinol＝1：1(v/v)]，室溫穩(wěn)定15min后，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)508nm處的吸光值，計(jì)算得到葉片中h2o2的含量。首先計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝4913.5*od508-873.77，h2o2(總量)＝(y實(shí)驗(yàn)組-y對(duì)照組)*(800+330)/100，h2o2(μm/mgfw)＝h2o2(總量)/樣品鮮重(mgfw)。

上述多個(gè)生理與生化指標(biāo)的定量分析表明，油菜nac87基因的表達(dá)能引起葉片組織的壞死導(dǎo)致的電導(dǎo)率上升、過氧化氫含量的上升、葉綠素含量的降低、花青素含量的升高以及丙二醛含量的上升(圖5與圖6)。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到技術(shù)方案的簡(jiǎn)單變化或等效替換均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120>一種甘藍(lán)型油菜與擬南芥中nac87轉(zhuǎn)錄因子基因及其應(yīng)用

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<213>人工序列

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