本發(fā)明涉及生物免疫檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種試劑盒及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及一種檢測染色體非整倍性的試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在我國，不孕不育患者已超過5000萬。習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。臨床上自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15％～25％，而其中的80％以上為發(fā)生在妊娠12周前的早期流產(chǎn)。引起自然流產(chǎn)的因素包括免疫系統(tǒng)異常、易栓癥、感染、遺傳以及表觀遺傳學(xué)方面的異常和其他原因未明的因素。而在已知的諸多引發(fā)自然流產(chǎn)的因素中，自然流產(chǎn)的胚胎50％～60％為染色體異常,針對孕早期流產(chǎn)的最主要的兩個原因胚胎染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常，準(zhǔn)確找到流產(chǎn)原因并有針對性的進行臨床指導(dǎo)就顯得尤為重要。通過流產(chǎn)組織染色體異常檢測技術(shù)，對流產(chǎn)組織進行染色體分析，即可將導(dǎo)致胚胎異常的原因向前追溯，從而將有助于尋找到流產(chǎn)發(fā)生的根源所在，便可提示醫(yī)生從更科學(xué)的角度合理的指導(dǎo)夫婦再次備孕，對優(yōu)生優(yōu)育具有極其重要的臨床意義。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，流產(chǎn)組織染色體檢測的方法也由傳統(tǒng)的核型分析，發(fā)展到熒光原位雜交技術(shù)(fish)法、微陣列比較基因組雜交技術(shù)(array-cgh)和新一代基因測序(ngs)技術(shù)等。傳統(tǒng)核型分析雖然認(rèn)識染色體疾病診斷得金標(biāo)準(zhǔn)，但操作復(fù)雜，需要對流產(chǎn)組織、羊水細胞、絨毛組織等進行細胞培養(yǎng)，易發(fā)生細胞培養(yǎng)失敗或漏檢、誤診等情況。fish無需細胞培養(yǎng)，快速簡便的優(yōu)點，但僅能針對探針覆蓋特定的染色體進行檢查，并不能全面反映流產(chǎn)組織等的染色體情況。array-cgh雖然具有快速、特異性強、檢測位點多的優(yōu)勢，但價格昂貴，未能廣泛應(yīng)用。然而，ngs技術(shù)的發(fā)展，不僅可以實現(xiàn)對全基因組的快速檢測，且準(zhǔn)確性高，通量大、靈敏度高和成本低的優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于臨床診斷等。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種檢測染色體非整倍性的試劑盒及其制備方法和應(yīng)用，所述試劑盒通過流產(chǎn)組織樣本構(gòu)建dna文庫來檢測染色體異常的情況。為達到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測染色體非整倍性的試劑盒，所述試劑盒包括：試劑i、試劑iii和純化磁珠或試劑ii、試劑iii和純化磁珠；其中，所述試劑i包括打斷修復(fù)緩沖液、打斷修復(fù)酶、datp、dntp、dna聚合酶i和rtaq酶；所述試劑ii為打斷修復(fù)緩沖液、打斷修復(fù)酶、datp、dntp、克列諾酶和rtaq酶；所述試劑iii為t4dna連接酶，pnk緩沖液，接頭。根據(jù)本發(fā)明，所述試劑i和試劑ii中的打斷修復(fù)緩沖液為10×打斷修復(fù)緩沖液。優(yōu)選地，所述試劑i和試劑ii中的打斷修復(fù)酶的活力單位為1-5u。根據(jù)本發(fā)明，所述試劑i中的datp包括10-15mm的datp和1-3mm的dntp。根據(jù)本發(fā)明，所述試劑ii中的datp包括10-15mm的datp和1-3mm的dntp。優(yōu)選地，所述試劑i和試劑ii中的rtaq酶的活力單位為1-10u。根據(jù)本發(fā)明，所述試劑i中的dna聚合酶i的活力單位為1-10u。優(yōu)選地，所述試劑ii中的克列諾酶的活力單位為1-10u。根據(jù)本發(fā)明，所述試劑i的ph為7.6-7.9。優(yōu)選地，所述試劑ii的ph為7.6-7.9。根據(jù)本發(fā)明，所述試劑iii中的t4dna連接酶的活力單位為600u。優(yōu)選地，所述試劑iii中的pnk緩沖液為10×pnk緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，所述試劑iii的ph為7.6-7.9。根據(jù)本發(fā)明，所述磁珠為ampurexp磁珠和/或axygenxp磁珠。第二方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的檢測染色體非整倍性的試劑盒用于檢測流產(chǎn)組織染色體異常的方法，所述方法包括以下步驟：(1)提取樣本dna；(2)將所述樣本dna與所述試劑i或試劑ii混合反應(yīng)；(3)將反應(yīng)后的dna樣本3’端加上接頭“a”；(4)將所述加上接頭“a”的片段與試劑iii反應(yīng)，得到兩端加接頭的dna片段；(5)采用磁珠純化步驟(4)所述兩端加接頭的dna片段；(6)pcr擴增步驟(5)純化后的片段，通過高溫變性得到單鏈結(jié)構(gòu)dna片段，再通過橋式寡核苷酸和t4連接酶將pcr單鏈環(huán)化，得到環(huán)狀文庫，并進行測序。第三方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的檢測染色體非整倍性的試劑盒用于檢測動物、植物或微生物中的任意一種或至少兩種的組合的染色體異常。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的試劑盒通過高效準(zhǔn)確的建庫方法來檢測染色體異常，提高了比對率，減少gc的偏差，降低dup率，同時也能減小測序前10bp波動，不會存在at分離的情況；不僅如此，本發(fā)明可以應(yīng)用在多個場景，包括檢測動物，植物，微生物的染色體異常檢測。附圖說明圖1為本發(fā)明建庫流程示意圖；圖2為本發(fā)明pcr產(chǎn)物片段分布。具體實施方式為更進一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選實施例來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實施例范圍內(nèi)。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1：流產(chǎn)組織樣本進行cnv變異檢測所述建庫流程如圖1所示，包括如下步驟：1.樣品收集及處理：取8個流產(chǎn)組織樣本用qiaampdnabloodminikit(qiagen)提取dna，最后將dna溶于20μlte溶液。2.末端修復(fù)：按下表1配置體系。表1將10μl反應(yīng)液(試劑i或試劑ii)加入均一化至20μl的dna溶液中，混勻，置于37℃孵育15min；65℃孵育15min，以0.1℃/秒的速率降溫至4℃。3.接頭連接：本方案中使用的接頭序列如下(本實施例中的序列從左到右為5’端至3’端，“//”示修飾基團，“phos”示磷酸化，b10示10個堿基的標(biāo)簽序列)。長鏈：/5phos/agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaa(b10)ca(seqidno：1)；短鏈：ttgtcttcctaaggaacgacatggctacgatccgactt(seqidno：2)。接頭混合液(10μm)按以下表3配方配制。表3組分用量長鏈(100μm)40μl短鏈(100μm)40μl氯化鈉(5m)4μl三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(1m，ph7.8)4μl乙二胺四乙酸二鈉(2mm)20μl無酶純水292μl總體積400.0μl將1μl配制好的接頭混合液(10μm)加入上一步驟產(chǎn)物中，充分混勻。按下表4配置體系。表4組分用量試劑iii49μl總體積49μl將連接反應(yīng)體系(試劑iii)與接頭和產(chǎn)物的混合液混勻，置于23℃孵育30min。反應(yīng)完之后，加入20μlte緩沖液，再加入50μlampurexp磁珠(beckman公司)進行純化，42μlte緩沖液溶解回收產(chǎn)物。需要說明：反應(yīng)產(chǎn)物的純化有多種方式，有磁珠法、柱純化法、凝膠回收法等，均可用于替換。4.pcr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))引物序列如下：(本實施例中的序列從左到右為5’端至3’端，“//”示修飾基團，“phos”示磷酸化)。引物1序列：/5phos/gaacgacatggctacga(seqidno：3)；引物2序列：tgtgagccaaggagttg(seqidno：4)。按下表5配制體系。表5將上步驟23μl回收產(chǎn)物，加入到以上體系中，混勻后按下表條件進行反應(yīng)，條件如表6。表6反應(yīng)完成后使用50μlampurexp磁珠進行純化，30μlte緩沖液溶解回收產(chǎn)物。取1μl回收產(chǎn)物，用qubitdsdnahs分析試劑盒(invitrogen公司)定量產(chǎn)物濃度，進行下一步反應(yīng)。pcr產(chǎn)物片段分布2100結(jié)果如圖2所示。5.單鏈環(huán)化：將8個帶有不同標(biāo)簽序列的擴增產(chǎn)物各取20ng進行混合，用te配置成48μl體系，加入5μl20μm介導(dǎo)片段，混勻。將反應(yīng)體系置于95℃孵育3min，立馬置于冰上。其中介導(dǎo)片段具有相應(yīng)互補序列用于連接單鏈兩端，其序列如下：(本實施例中的序列從左到右為5’端至3’端)。gccatgtcgttctgtgagccaagg(seqidno：5)。配制如下表7的反應(yīng)體系：表7組分用量環(huán)化反應(yīng)緩沖液6.6μl環(huán)化酶0.2μl總體積6.8μl將表7反應(yīng)體系加入純化的產(chǎn)物中，混勻，置于37℃孵育30min。6.測序取構(gòu)建的單鏈環(huán)狀dna文庫進行dna納米球制備、bgiseq-500/50上機測序。測序過程嚴(yán)格按照bgiseq-500/50的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行上機操作。7.數(shù)據(jù)分析使用“流產(chǎn)組織非整倍體檢測軟件”進行信息分析。8.信息分析檢測結(jié)果如下表8：表8申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12