本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學領(lǐng)域，尤其涉及的是用于brafv600e基因突變的試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
：目前，肺癌己成為全球癌癥死亡的首要原因，全球每年新發(fā)病例150萬，嚴重威脅人類健康。在肺癌患者中，非小細胞肺癌約(nsclc)占80％，且就診時80％己失去手術(shù)或放射治療最佳機會，致使其長期生存率低，療效令人堪憂。iiib/iv期非小細胞肺癌2年生存率僅10％-20％，中位生存時間僅10-12月。因此，人們需要不斷研究新的治療方法以提高肺癌治療的有效率，其中以分子靶向治療為代表的新治療方法，為晚期nsclc的治療帶來了新的希望。甲狀腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。2010年甲狀腺癌的發(fā)病率均居所有女性惡性腫瘤的前十位。隨著人們生活方式、飲食結(jié)構(gòu)的改變，平均壽命的提高，甲狀腺癌的發(fā)病率可能還將進一步上升。在常規(guī)健康體驗中，有很多人會被查出甲狀腺結(jié)節(jié)，“良性還是惡性？”是大家最關(guān)心的問題。目前，b超引導下穿刺涂片檢查是鑒別結(jié)節(jié)良惡性的主要手段。但受多種因素的影響，不少結(jié)節(jié)依靠穿刺涂片檢查仍無法定性。有一種叫做braf的原癌基因，該基因的突變與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，最常見于甲狀腺乳頭狀癌和皮膚黑色素瘤。乳頭狀癌約占所有甲狀腺癌的85％以上。發(fā)現(xiàn)并鑒定braf突變是近年來甲狀腺癌研究領(lǐng)域的重大進展。一般認為，與沒有braf突變的甲狀腺癌相比，檢出braf突變的甲狀腺癌惡性程度更高，轉(zhuǎn)移和復發(fā)的風險也更大。突變擴增阻滯系統(tǒng)(amplificationrefractorymutationsystem，arms)也叫等位基因特異性pcr，該法是在pcr基礎(chǔ)上發(fā)展而成的，是一種直接用于點突變分析的pcr技術(shù)。其依據(jù)的基本原理是taqdna聚合酶缺少3′到5′外切酶活性，因此對于3′末端錯配的引物以低于正常末端配對引物的速度延伸，當錯配堿基的數(shù)目達到一定程度或者條件達到一定的嚴謹程度時，擴增反應終止。braf基因是egfr信號傳導通路重要成員，參與和調(diào)控細胞的增值分化和增長全過程。大部分腫瘤的突變都是體細胞突變，突變細胞往往與野生型細胞混雜在一起。因此所提取的dna常帶有大量野生型dna，所以對體細胞突變檢測需要較高的特異性，而目前廣泛使用的直接測序法檢測能力有限，不能完全滿足臨床需要。特異性探針法如以scorpionsarms為代表的英國dxs和中國廈門adx的brafv600e檢測試劑盒雖然檢測靈敏度高，但其檢測費用較高，不適合國內(nèi)nsclc患者的常規(guī)檢測和篩查，因此，臨床迫切需要開發(fā)一種快速準確、操作簡便、靈敏度高的檢測brafv600e基因突變的試劑盒。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的檢測brafv600e基因突變的試劑盒成本過高的不足，提供了一種用于brafv600e基因突變的試劑盒，本發(fā)明的另一目的在于，提供一種用于brafv600e基因突變的檢測方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：用于brafv600e基因突變的試劑盒，其特征在于：包括brafv600e基因突變檢測的特異引物和探針，其特異引物與探針包括如下序列：優(yōu)選的，所述的探針5’端fam熒光素，3’端標記mgb猝滅熒光素。優(yōu)選的，所述的試劑盒還包括brafv600e突變及braf野生型pcr反應液、酶系1、陽性對照、陰性對照和depc水。優(yōu)選的，還應包括可用于血清游離dna樣本、組織樣本或穿刺樣本的brafv600e基因突變的檢測。作為優(yōu)選，還應包括如下擴增體系：一種brafv600e基因突變的檢測方法，所述的方法包含以下步驟：(1)樣本dna的提取血清游離dna提?。和扑]使用sigma公司的genelutetmplasma/serumcell-freecirculatingdnapurificationmidikit。組織樣本dna提?。和扑]使用qiagene公司的qiaampdnaffpetissuekit(貨號：56404)(2)pcr反應體系的配制在試劑配制室按照試劑盒說明書要求進行配制，pcr反應液16ul，酶系12ul、引物探針混合液2ul，模板dna5ul，陰性對照和質(zhì)控視為樣本，作相同處理。(3)結(jié)果判讀：根據(jù)熒光pcr擴增儀顯示的ct值判斷檢測結(jié)果：利用特異性引物和熒光探針進行pcr檢測，突變和質(zhì)控由fam指示，內(nèi)控由hex信號指示，通過計算δct的大小進行判斷，反應管的δct值＜δctcut-off值時，則樣品為該反應管對應信號突變陽性，反之則為陰性或低于試劑盒的檢測下限。表cutoffδct值檢測靶點cutoffδct值v600e10本發(fā)明提供了用于brafv600e基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括pcr反應緩沖液、引物探針混合液、酶系1、陽性對照、陰性對照和說明書。引物探針混合液包含突變位點基因和內(nèi)控引物探針，質(zhì)控基因和內(nèi)控檢測引物探針，突變和質(zhì)控探針5’端標記fam熒光素，3’端標記mgb熒光素；內(nèi)控5’端標記hex熒光素，3’端標記bhq1熒光素，質(zhì)控及內(nèi)控均作為結(jié)果判讀的一部分。質(zhì)控基因選擇是人類brafv600e基因相對保守的區(qū)段，內(nèi)控選擇的是人β-actin保守基因，雙控體系共同用于監(jiān)控血漿樣本dna質(zhì)量和pcr反應過程。與現(xiàn)有技術(shù)相比：1)高靈敏度：可在100ng野生型人類基因組背景下檢測出1％微量突變模板，減少了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)；2)全封閉反應，避免假陽性結(jié)果的發(fā)生；3)雙控反應體系，質(zhì)控及內(nèi)源對照，有效檢測pcr擴增及核酸提取。附圖說明圖1為v600e靈敏度結(jié)果圖；圖2為臨床陽性樣本用v600e檢測結(jié)果圖；圖3位v600e試劑盒擴增野生型樣本結(jié)果圖。具體實施方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1利用本發(fā)明實時熒光pcr檢測brafv600e7種基因突變的方法包括如下步驟：1、核酸提取以石蠟包埋組織為例，按照推薦的qiaampdnaffpetissuekit說明書進行石蠟包埋組織基因組dna的提取。2、pcr反應體系的配制(25ul)試劑名稱加入量pcr反應液16ul酶系12ul引物探針混合液2ul模板dna5ul所述的模板dna包含樣本dna和陰性、陽性對照dna。3、pcr擴增實時pcr擴增條件為：50℃2min，1個循環(huán)；95℃5min；95℃10s，55℃15s,72℃30s，5個循環(huán)；95℃10s，60℃45s(收集fam和hex熒光信號)，40個循環(huán)。4、結(jié)果判定1)檢測結(jié)果除陰性對照外，突變反應管的內(nèi)控信號hex應有擴增曲線，且ct≤33；若ct＞33，則提示樣本dna模板量偏低或存在pcr抑制劑，需重新提取或者增加pcr模板量再做，但是如果管內(nèi)fam有信號，可能是由于突變的擴增抑制了內(nèi)控序列的擴增，結(jié)果仍然可信。2)質(zhì)控管fam信號ct＜21，提示樣品加入量過高，需減少樣本加入量再實驗；質(zhì)控管fam信號ct＞26或陰性，提示該樣本加入量過低或提取失敗，需要增加樣本量再實驗或重新提取。3)質(zhì)控管fam信號21≤ct≤26a：arms引物管ct＜30，樣本結(jié)果判讀為陽性。b：arms引物管＞陰性臨界值或無擴增曲線，樣本結(jié)果判讀為陰性。c：相應arms引物管30≤ct值＜陰性臨界值(如下表)，且其與質(zhì)控管fam信號的δct≤△ctcut-off值，該樣本結(jié)果判讀為陽性；反之則判讀為陰性。實施例2利用本發(fā)明檢測非小細胞肺癌患者腫瘤組織樣本10例，并與測序結(jié)果進行對照，結(jié)果：檢測出v600e陽性2例，與測序法符合率100％。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12