本發(fā)明主要屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種膀胱癌篩選檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：膀胱癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中最常見的惡性腫瘤。在我國，膀胱癌的發(fā)病率為6.61/10萬，在泌尿系統(tǒng)腫瘤中排第一位。膀胱癌發(fā)生的危險因素主要包括吸煙、芳香胺類致癌物、砒霜、膀胱的慢性感染、電離輻射和非那西汀類藥物的濫用。根據(jù)病理特征，膀胱癌在臨床上分為淺表型(70％)和浸潤型(30％)兩大類。預(yù)后較差和極易復(fù)發(fā)是膀胱癌的最大特點，有效的治療很大程度上依賴于對膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療。目前，膀胱癌診斷主要依賴于膀胱鏡檢查和尿細胞學(xué)檢查。前者為診斷膀胱癌的金標準，價格比較昂貴，并為侵入性的檢查，對于需要長期隨訪的患者是一種較大的負擔(dān)，且患者依從性差，不宜作為常規(guī)檢查；后者雖然特異度高且無創(chuàng)，但對低度表淺性的腫瘤敏感性低，容易產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。因此，尋找敏感度及特異度高的膀胱癌腫瘤標志物作為膀胱癌的早期診斷、監(jiān)測以及預(yù)后評估受到越來越多的關(guān)注。相對傳統(tǒng)檢查手段和影像學(xué)檢查技術(shù)，腫瘤標志物最大的優(yōu)點在于簡單快捷，免除患者額外檢查的痛苦。通過簡單的采血或尿液收集即可獲取標本進行檢測，操作方便，且可應(yīng)用于伴有重大臟器功能障礙無法行內(nèi)鏡檢查或植入心臟起搏器不能接受強輻射影像學(xué)檢查的患者。靶向診斷技術(shù)的優(yōu)勢在于發(fā)現(xiàn)早期形態(tài)學(xué)變化不明顯的腫瘤細胞和組織，可應(yīng)用于膀胱癌篩查或預(yù)后監(jiān)測，并在一定程度上可以起到輔助對膀胱癌進行分級、分期的工作。目前臨床上正在使用的膀胱癌相關(guān)的腫瘤標志物包括核基質(zhì)蛋白22(nmp22)和膀胱腫瘤相關(guān)抗原(bta)等，但尚無單一標志物可診斷膀胱癌，且不能替代膀胱鏡檢查。nmp22是一種細胞核內(nèi)有絲分裂蛋白，其在細胞凋亡后被釋放出來，以可溶性復(fù)合物或片段的形式存在于人的尿液中，其在膀胱癌患者尿液中濃度升高了25倍左右，可采用酶聯(lián)免疫吸附試驗可以檢測其濃度，是nmp22作為臨床診斷膀胱移行細胞癌的依據(jù)。有學(xué)者對1331例臨床患者的尿液標本的nmp22進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其較傳統(tǒng)尿細胞學(xué)篩查具有更高的膀胱癌檢出率。用于診斷時，nmp22對膀胱癌的敏感度遠高于尿脫落細胞學(xué)(56％vs.16％)，但nmp-22的特異度不及尿脫落細胞學(xué)(86％vs.99％)；用于復(fù)發(fā)監(jiān)測時，nmp22對膀胱癌的敏感度和特異度分別為50％和87％。美國fda已批準將nmp22應(yīng)用于臨床膀胱癌的檢測。但nmp22在其他泌尿系疾病，諸如血尿、膿尿、尿路結(jié)石和膀胱炎患者尿液中也有升高，會影響到其檢測膀胱癌的特異性。bta又稱人補體因子h相關(guān)蛋白質(zhì)，是在膀胱腫瘤生長過程中所釋放的一種由16～165kd特異性多肽組成的高分子復(fù)合物，其結(jié)構(gòu)與人補體因子h類似，可通過干擾補體途徑使得膀胱腫瘤細胞逃逸宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，獲得選擇性生長優(yōu)勢。尿液bta水平升高對膀胱癌有一定的早期診斷價值，miyake等收集了126例(64例膀胱癌組、62例對照組)血尿患者的尿液標本，利用bta檢測試劑盒(bta和)對尿液標本中的bta水平進行了檢測，結(jié)果顯示，膀胱癌組陽性率為72％，但對照組亦有47％的患者為陽性結(jié)果，bta對膀胱癌的敏感性和特異性分別為72％和53％，由此認為bta檢測有助于膀胱癌的早期診斷，但其易受血尿影響而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此，亟需開發(fā)和鑒定高特異性和高靈敏性的標志物用于膀胱癌的診斷。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種膀胱癌篩選檢測試劑盒，所述試劑盒能夠檢測膀胱癌相關(guān)基因的cdna的寡核苷酸，kmt1a作為膀胱癌的一個新的標志物，可用于膀胱癌的輔助診斷。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：結(jié)合膀胱癌相關(guān)基因的核酸的檢測試劑在制備膀胱癌診斷試劑中的用途，所述膀胱癌相關(guān)基因為kmt1a基因。進一步地，所述檢測試劑是用于檢測膀胱癌相關(guān)基因的cdna的寡核苷酸。一種膀胱癌篩選檢測試劑盒，所述試劑盒用于檢測膀胱癌相關(guān)基因的cdna的寡核苷酸；所述試劑盒包括特異性引物對，所述特異性引物對包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如seqidno.1所示，所述下游引物序列如seqidno.2所示。進一步地，所述試劑盒還包括標準dna模板和pcr反應(yīng)液，所述標準dna模板為kmt1a基因的cdna模板。進一步地，所述試劑盒為熒光定量pcr檢測試劑盒，所述試劑盒還包括熒光染料。進一步地，所述pcr反應(yīng)液為熒光定量pcr反應(yīng)液，所述熒光定量pcr反應(yīng)液包括dntp、mg2+、taq酶及緩沖液。進一步地，所述taq酶為熱啟動酶。進一步地，所述熒光染料為sybrgreenii。本發(fā)明的有益技術(shù)效果：kmt1a作為膀胱癌的一個新的標志物，可用于膀胱癌的輔助診斷。基于kmt1a的免疫組織化學(xué)或熒光定量pcr的靶向診斷技術(shù)最大的優(yōu)點在于發(fā)現(xiàn)早期形態(tài)學(xué)變化不明顯的腫瘤細胞和組織，操作方便可應(yīng)用于早期篩查和診斷。此外，kmt1a也可以用于膀胱癌患者術(shù)后預(yù)后的監(jiān)測。kmt1a表達量的升高，提示患者的預(yù)后會變差。附圖說明圖1為利用熒光定量pcr的方法，在10對膀胱癌和癌旁組織中檢測kmt1a基因表達量的結(jié)果示意圖；圖2a為利用免疫組化的方法對膀胱癌患和癌旁組織中檢測kmt1a蛋白表達量的結(jié)果示意圖；圖2b是對kmt1a蛋白染色進行的計算和統(tǒng)計分析結(jié)果；圖3為通過tcga數(shù)據(jù)分析kmt1a基因在膀胱癌和正常膀胱組織中的表達量；圖4a利用gse13507表達譜芯片數(shù)據(jù)，分析膀胱癌患和癌旁組織中kmt1a基因的表達量信息；圖4b利用gse37815表達譜芯片數(shù)據(jù)，分析膀胱癌患和癌旁組織中kmt1a基因的表達量信息；圖5a利用gse13507數(shù)據(jù)，根據(jù)kmt1a基因的表達量對膀胱癌患者的總體平均生存時間的分析結(jié)果；圖5b利用gse32894數(shù)據(jù)，根據(jù)kmt1a基因的表達量對膀胱癌患者的總體平均生存時間的分析結(jié)果；圖6為利用本發(fā)明的膀胱癌檢測試劑盒，在100對膀胱癌和癌旁組織中檢測kmt1a基因的表達量的結(jié)果示意圖。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細描述。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。相反，本發(fā)明涵蓋任何由權(quán)利要求定義的在本發(fā)明的精髓和范圍上做的替代、修改、等效方法以及方案。進一步，為了使公眾對本發(fā)明有更好的了解，在下文對本發(fā)明的細節(jié)描述中，詳盡描述了一些特定的細節(jié)部分。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說沒有這些細節(jié)部分的描述也可以完全理解本發(fā)明。實施例1一種膀胱癌篩選檢測試劑盒，所述試劑盒用于檢測膀胱癌相關(guān)基因的cdna的寡核苷酸，所述膀胱癌相關(guān)基因為kmt1a基因；所述試劑盒包括特異性引物對，所述特異性引物對包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如seqidno.1所示，所述下游引物序列如seqidno.2所示；其中所述為kmt1a蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示。所述試劑盒還包括標準dna模板和pcr反應(yīng)液。所述試劑盒為熒光定量pcr檢測試劑盒，所述試劑盒還包括熒光染料。所述pcr反應(yīng)液為熒光定量pcr反應(yīng)液，所述熒光定量pcr反應(yīng)液包括dntp、mg2+、taq酶及pcr緩沖液。所述taq酶為熱啟動酶。所述熒光染料為sybrgreenii。人膀胱癌和癌旁組織中kmt1a的定量pcr分析一、樣本收集：組織樣本來自于10對膀胱癌患者的住院病例手術(shù)切除樣本，每對包含膀胱癌組織和配對的癌旁組織。所有標本取下后分為兩份，一份放入液氮罐中，隨后放入-80冰箱中保存。另一份放入多聚甲醛固定后石蠟包埋及染色。所有膀胱癌組織及癌旁組織經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科病理檢查確認。所有標本的使用符合昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會的倫理要求。二、rna提?。喊凑仗旄呐囵B(yǎng)細胞/細菌總rna提取試劑盒(dp430)中的步驟提取總rna：①勻漿：每10-20mg組織加300μl裂解液rl(使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇)，用研磨杵將組織徹底研磨(如組織較難徹底研磨，可選用電動或玻璃勻漿器)；隨后向勻漿液中加入590μlrnase-freeddh2o和10μlproteinasek，混勻后56℃處理10-20min。12，000rpm(～13，400×g)離心2-5min，取上清進行以下操作。②緩慢加入0.5倍上清體積無水乙醇，混勻(此時可能會出現(xiàn)沉淀)，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱cr3中(吸附柱放在收集管中)，12，000rpm(～13，400×g)離心30-60sec，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。③向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12，000rpm(～13，400×g)離心30-60sec，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。④dnasei工作液的配制：取10μldnasei儲存液放入新的rnase-free離心管中，加入70μlrdd溶液，輕柔混勻。⑤向吸附柱cr3中央加入80μl的dnasei工作液，室溫放置15min。⑥向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12，000rpm(～13，400×g)離心30-60sec，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。⑦向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(使用前請先檢查是否已加入乙醇)，室溫靜置2min，12，000rpm(～13，400×g)離心30-60sec，棄廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。重復(fù)一次。⑧12，000rpm(～13，400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱cr3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。⑨將吸附柱cr3轉(zhuǎn)入一個新的rnase-free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30-100μlrnase-freeddh2o，室溫放置2min，12，000rpm(～13，400×g)離心2min，得到rna溶液。利用nanodrop2000測定濃度。三、反轉(zhuǎn)錄合成cdna模板：取上述10對膀胱癌組織癌旁組織的總rna，采用北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司starscriptiione-steprt-pcr試劑盒(a215-01)對提取的總rna反轉(zhuǎn)錄合成cdna。第一步打開rna二級結(jié)構(gòu)，反應(yīng)體系及條件如下：試劑用量oligodt1μlrna1-2μgdepc水補齊至20μl將上述組分混合后70℃反應(yīng)5min，然后冰浴10min。第二步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系及條件如下：將上述組分混合均勻后42℃孵育1h，然后70℃滅活10min，即得到cdna。四、熒光定量pcr檢測kmt1a表達量：應(yīng)用實施例1所述試劑盒進行定量pcr檢測kmt1a表達量，以反轉(zhuǎn)錄的cdna為模板進行熒光定量pcr擴增，kmt1a的檢測引物如下：kmt1a-f：5’-atgccgcctactatggcaac-3’kmt1a-r：5’-aaagttggagtccatgcggg-3’熒光定量pcr體系：試劑用量2×pcr反應(yīng)液10μl引物各1μldna模板1μlrnasefreeddh2o補齊至20μl其中，所述標準dna模板為擴增獲得的kmt1a基因的cdna模板。熒光定量pcr條件如下：pcr條件如下：因此，利用熒光定量pcr的方法，在10對膀胱癌和癌旁組織檢測kmt1a基因的表達量，結(jié)果如圖1所示，kmt1a基因在膀胱癌中顯著高表達，結(jié)果表明kmt1a在膀胱癌中的表達量顯著高于癌旁組織，..p<0.05。人膀胱癌和癌旁組織中kmt1a蛋白的免疫組織化學(xué)(ihc)分析。①將石蠟包埋的組織切成2μm的系列切片，在二甲苯中去除石蠟(3×5min)并通過一系列梯度乙醇再水化，然后用去離子水和pbs進行兩個沖洗步驟(1×2min)。②使玻片在含3％h2o2的pbs中溫育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，pbs溶液洗3次×2min。③然后切片放入0.01m檸檬酸鈉緩沖溶液(ph6.0)后，在97℃-100℃進行10min，pbs溶液洗3次×2min。④室溫下用含1％馬血清pbs阻斷免疫球蛋白的非特異性結(jié)合30min。用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入1:500稀釋的kmt1a抗體，放入濕盒中4℃孵育過夜。⑤次日pbs溶液洗3次×2min，用濾紙將組織周圍的水吸去，加入1:1000稀釋的小鼠二抗后，室溫1h，用pbs洗3次×2min。然后使用二氨基聯(lián)苯胺色原溶液顯色液顯色(dab)。顯微鏡下觀察染色情況，染色10min后終止反應(yīng)，pbs洗3次×2min。⑥蘇木素染液，5～10min，pbs洗3次×2min；用稀鹽酸乙醇分色5～10s，立即用pbs洗3次×2min；用淡氨水使片子返藍，5～10min，pbs洗3次×2min；通過一系列梯度乙醇脫水，二甲苯透明(2×3min)；中性樹膠封片；顯微鏡下觀察。將膀胱癌和癌旁組織切片進行比較。如圖2a代表性地顯示了來自10例膀胱癌患者和癌旁組織的切片的結(jié)果。kmt1a特異性染色在膀胱癌組織細胞，而在癌旁組織中則沒有染色。圖2b是對kmt1a蛋白的染色進行了計算和統(tǒng)計分析，kmt1a的染色得分計算方法是染色強度(無＝1，弱＝2，中＝3，強＝4)和染色細胞比例的乘積(0％–100％)。結(jié)果表明kmt1a蛋白在膀胱癌中顯著高表達。因而，kmt1a在膀胱癌中的特異性表達由ihc分析明確地證實。圖2.kmt1a蛋白在膀胱癌中顯著高表達。通過免疫組化分析，kmt1a在原代膀胱癌細胞中的表達量顯著高于癌旁組織，n＝10。kmt1a的染色得分計算方法是染色強度(無＝1，弱＝2，中＝3，強＝4)和染色細胞比例的乘積(0％–100％)。比例尺＝50m，***p<0.001。tcga數(shù)據(jù)庫中分析人膀胱癌和癌旁組織中kmt1a的表達量。在tcga數(shù)據(jù)中分析kmt1a基因在膀胱癌中的表達量，如圖3所示，通過分析tcga數(shù)據(jù)庫，相比于正常膀胱組織，kmt1a基因在膀胱癌中顯著高表達，*p<0.05。ncbi數(shù)據(jù)庫中分析人膀胱癌和癌旁組織中kmt1a的表達量。在ncbi搜索原代膀胱癌組織的表達譜芯片結(jié)果，搜索到芯片數(shù)據(jù)gse13507和gse37815兩個數(shù)據(jù)庫中含有膀胱癌組織和癌旁組織的kmt1a表達量信息。如圖4所示，通過分析gse13507和gse37815表達譜芯片數(shù)據(jù)，相比于正常膀胱組織，kmt1a基因在膀胱癌中顯著高表達。膀胱癌患者預(yù)后分析在ncbi搜索原代膀胱癌組織的表達譜芯片結(jié)果，搜索到芯片數(shù)據(jù)gse13507和gse32894兩個數(shù)據(jù)庫中含有被測樣本的kmt1a的表達量信息和臨床預(yù)后信息。首先根據(jù)kmt1a的表達量將膀胱癌樣本分為高(high)和低(low)兩組，然后對高、低兩組繪制生存曲線(kaplan–meieranalysis)進行比較。如圖5所示，kmt1a的表達量和膀胱癌患者的總體平均生存時間呈負相關(guān)性?？ㄆ仗m-邁耶曲線分析kmt1a高表達膀胱癌患者和kmt1a低表達膀胱癌患者的總體平均生存時間(對數(shù)秩和檢驗)，kmt1a高表達組的膀胱癌患者的總體平均生存時間顯著長于kmt1a低表達組的膀胱癌患者。利用kmt1a的差異表達對膀胱癌組織進行篩查選取100對人膀胱癌組織和癌旁組織(由昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供)，按天根的培養(yǎng)細胞/細菌總rna提取試劑盒(dp430)的步驟提取總rna，再利用nanodrop2000測定rna濃度和純度。采用北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司starscriptiione-steprt-pcr試劑盒(貨號a215-01)對提取的總rna反轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司2×realstarpowersybrmixtureung熒光定量試劑盒(貨號a312)，以反轉(zhuǎn)錄的cdna為模板進行熒光定量pcr擴增。kmt1a的檢測引物如下：kmt1a-f：5’-atgccgcctactatggcaac-3’kmt1a-r：5’-aaagttggagtccatgcggg-3’pcr條件如下：熒光定量pcr檢測膀胱癌組織樣本中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶kmt1a的表達量，產(chǎn)物擴增曲線在反應(yīng)的早期就可能被監(jiān)測到，起始點表示產(chǎn)物聚集的對數(shù)期開始，該期產(chǎn)物的熒光信號呈指數(shù)增長，檢測儀將此點定義為ct值。根據(jù)ct值可以預(yù)測靶基因產(chǎn)物的起始濃度，即在pcr反應(yīng)條件相同的情況下，靶基因起始濃度越大，則ct值就越低。將癌旁對照組均值的95％可信區(qū)間的上界(x±sd)作為本診斷實驗的cut-off值，其值為18.06。在此分界值條件下，本診斷實驗的靈敏度為91％，特異度為80％。如圖6所示，本發(fā)明的膀胱癌檢測試劑盒，在100對膀胱癌和癌旁組織中檢測kmt1a基因的表達量，結(jié)果表明kmt1a在膀胱癌中的表達量顯著高于癌旁組織，.p<0.01。表1.利用本發(fā)明試劑盒篩查膀胱癌臨床靈敏度可用來衡量某種試驗檢測出有病者的能力，靈敏度是將實際有病的人正確地判定為真陽性的比例。本實驗靈敏度＝91/(91+9)×％＝91％。臨床特異度是衡量試驗正確地判定無病者的能力，特異度是將實際無病的人正確地判定為真陰性的比例。本實驗特異度＝82/(18+82)×％＝83％。因此，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶kmt1a作為全新的膀胱癌診斷的腫瘤標志物，而且有望成為膀胱癌治療靶點，具有十分重要的科學(xué)意義和生理意義。sequencelisting<110>楊昭<120>一種膀胱癌篩選檢測試劑盒<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1atgccgcctactatggcaac20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2aaagttggagtccatgcggg20<210>3<211>423<212>prt<213>組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶kmt1a蛋白的氨基酸序列<400>3metvalglymetserargleuargasnaspargleualaaspproleu151015thrglycysservalcyscyslyssersertrpasnglnleuglnasp202530leucysargleualalysleusercysproalaleuglyileserlys354045argasnleutyraspphegluvalglutyrleucysasptyrlyslys505560ilearggluglnglutyrtyrleuvallystrpargglytyrproasp65707580sergluserthrtrpgluproargglnasnleulyscysvalargile859095leulysglnphehislysaspleugluarggluleuleuargarghis100105110hisargserlysthrproarghisleuaspproserleualaasntyr115120125leuvalglnlysalalysglnargargalaleuargargtrpglugln130135140gluleuasnalalysargserhisleuglyargilethrvalgluasn145150155160gluvalaspleuaspglyproproargalaphevaltyrileasnglu165170175tyrargvalglygluglyilethrleuasnglnvalalavalglycys180185190glucysglnaspcysleutrpalaprothrglyglycyscysprogly195200205alaserleuhislysphealatyrasnaspglnglyglnvalargleu210215220argalaglyleuproiletyrglucysasnserargcysargcysgly225230235240tyraspcysproasnargvalvalglnlysglyileargtyraspleu245250255cysilepheargthraspaspglyargglytrpglyvalargthrleu260265270glulysilearglysasnserphevalmetglutyrvalglygluile275280285ilethrsergluglualagluargargglyglniletyrasparggln290295300glyalathrtyrleupheaspleuasptyrvalgluaspvaltyrthr305310315320valaspalaalatyrtyrglyasnileserhisphevalasnhisser325330335cysaspproasnleuglnvaltyrasnvalpheileaspasnleuasp340345350gluargleuproargilealaphephealathrargthrileargala355360365glyglugluleuthrpheasptyrasnmetglnvalaspprovalasp370375380metgluserthrargmetaspserasnpheglyleualaglyleupro385390395400glyserprolyslysargvalargileglucyslyscysglythrglu405410415sercysarglystyrleuphe420當前第1頁12