本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種支氣管原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定方法。

背景技術(shù)：

人支氣管上皮細(xì)胞主要功能：(1)支氣管表面的上皮細(xì)胞構(gòu)成了基底柱狀結(jié)構(gòu)，清除粘液纖毛。(2)由纖毛、無纖毛和能分泌黏液的細(xì)胞等混合細(xì)胞群組成物理屏障，可有效防止多種有毒物質(zhì)。(3)產(chǎn)生和分泌大量化學(xué)介質(zhì)和細(xì)胞因子形成高度復(fù)雜的宿主防御系統(tǒng)。人支氣管上皮細(xì)胞與主要病理生理疾病有關(guān)，如支氣管肺癌(多簡稱為肺癌)、慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、支氣管狹窄。為了獲得體外穩(wěn)定傳代的人正常支氣管上皮細(xì)胞，使人們可以更全面地研究細(xì)胞的正常功能，疾病發(fā)病機(jī)理，組織器官功能重建或再造，以及測定藥物對正常細(xì)胞的毒性，研究人員做出了大量的工作。

目前，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法主要為：原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)、ali培養(yǎng)基添加成分、預(yù)鋪膠原類型的選擇、細(xì)胞的接種密度等各不相同。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法缺陷在于：體外培養(yǎng)支氣管原代上皮細(xì)胞的存活率非常低。因此，有必要提供一種支氣管原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定方法，提高體外培養(yǎng)支氣管原代上皮細(xì)胞的存活率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供支氣管原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定方法，以提高支氣管原代上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的成活率。

第一方面，本發(fā)明提供了支氣管原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

s1、用膠原蛋白鋪滿器皿的表面，包被處理后備用；

s2、經(jīng)支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細(xì)胞，用一次性吸液管吹吸離心管內(nèi)毛刷數(shù)次后，加入培養(yǎng)基內(nèi)，點到包被好的培養(yǎng)皿中間培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液消化細(xì)胞孔，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1-2天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞瓶。

本發(fā)明中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟s1的詳細(xì)過程為：用無菌0.006-0.008mol/l乙酸將膠原蛋白稀釋到0.03-0.05mg/ml，在12孔板內(nèi)每孔加300-400ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置1-2小時后，用保護(hù)性毛刷洗3-5次后，在超凈臺中利用風(fēng)機(jī)吹干并用紫外消毒30-40min后使用。

本發(fā)明中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述膠原蛋白為鼠尾膠原蛋白(索萊寶)。

本發(fā)明中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟s2的詳細(xì)過程為：經(jīng)支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細(xì)胞，力道均勻刷3-4次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養(yǎng)液的離心管內(nèi)(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內(nèi)毛刷數(shù)次后，1000-1200rpm離心10-15分鐘，去上清后加入150-170ulbegm培養(yǎng)基，吸取30-50ul點到包被好的細(xì)胞培養(yǎng)皿中央，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時；取出以后加入500-600ul培養(yǎng)基，放細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1-2天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞孔。

本發(fā)明中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為37℃、5％co2。

本發(fā)明中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟s3的詳細(xì)過程為：用胰蛋白酶－edta消化液消化細(xì)胞孔5-10min，加入1mlrpmi1640培養(yǎng)液終止消化后，1500-1700rpm離心5-10分鐘，去上清后加入1mlbegm培養(yǎng)基，1600-1800rpm離心5-10分鐘，去上清后加入4mlbegm培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1-2天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞瓶。

本發(fā)明中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，胰蛋白酶－edta消化液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％。

第二方面，本發(fā)明提供了支氣管原代上皮細(xì)胞的鑒定方法，包括細(xì)胞免疫組化染色鑒定方法。

本發(fā)明中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，細(xì)胞免疫組化染色鑒定方法的具體步驟為：

兔抗人的角蛋白8單克隆抗體標(biāo)記支氣管上皮細(xì)胞：將爬片用無水乙醇洗三次，每次浸泡5min，然后取出爬片，自然晾干，把消化好的支氣管上皮細(xì)胞離心、計數(shù)以后，取5萬個細(xì)胞，接種于爬片上進(jìn)行培養(yǎng)，定期光鏡下觀察，待爬片長滿細(xì)胞以后，爬片制作完成→4％多聚甲醛固定20min→pbs洗5min*3次→5％牛血清白蛋白室溫孵育1小時→pbs洗5min、3次→1:20稀釋一抗，取30ul，將爬片正面向下貼合一抗，放于濕盒中4℃冰箱孵育一整夜→pbs洗5min、3次→加入檢測試劑山羊抗兔igg/hrp聚合物15min→pbs洗5min、3次→dapi染色7min→pbs洗5min、3次→90％甘油封片→倒置相差顯微鏡下觀察。

由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明具有如下有益效果，

本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)支氣管原代上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定，操作方便、細(xì)胞存活率高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明培養(yǎng)過程示意圖；

圖2為刷檢獲得的人支氣管上皮細(xì)胞，原代培養(yǎng)第1天，接種于begm培養(yǎng)基的細(xì)胞形態(tài)實物圖(x100)；

圖3為支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第3天的細(xì)胞形態(tài)實物圖(x400)；

圖4為支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第5天的細(xì)胞形態(tài)實物圖(x400)；

圖5為支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第11天的細(xì)胞形態(tài)實物圖(x100)；

圖6為支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第13天的細(xì)胞形態(tài)實物圖(x100)；

圖7為支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第15天的細(xì)胞形態(tài)實物圖(x100)；

圖8為支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第16天的細(xì)胞形態(tài)實物圖(x100)；

圖9為支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第17天的細(xì)胞形態(tài)實物圖(x100)；

圖10為支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第18天的細(xì)胞形態(tài)實物圖(x100)；

圖11為兔抗人細(xì)胞角蛋白8單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫組化染色，胞漿著色圖(x100)；

圖12為兔抗人細(xì)胞角蛋白8單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫組化染色，胞漿著色圖(x400)；

圖13為兔抗人細(xì)胞角蛋白8單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫組化染色，胞核復(fù)染圖(x100)；

圖14為兔抗人細(xì)胞角蛋白8單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫組化染色，胞核復(fù)染圖(x400)。

具體實施方式

下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，因此只作為示例，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1

支氣管原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，如圖1所示，包括如下步驟：

s1、用無菌0.006mol/l乙酸將鼠尾膠原蛋白(索萊寶)稀釋到0.03mg/ml，在12孔板內(nèi)每孔加300ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置1小時后，用保護(hù)性毛刷洗3次后，在超凈臺中利用風(fēng)機(jī)吹干并用紫外消毒30min后使用；

s2、經(jīng)支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細(xì)胞，力道均勻刷3次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養(yǎng)液的離心管內(nèi)(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內(nèi)毛刷數(shù)次后，1000rpm離心10分鐘，去上清后加入150ulbegm培養(yǎng)基，吸取30ul點到包被好的細(xì)胞培養(yǎng)皿中央，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱(細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為37℃、5％co2)培養(yǎng)4小時；取出以后加入500ul培養(yǎng)基，放細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液(胰蛋白酶－edta消化液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％)消化細(xì)胞孔5min，加入1mlrpmi1640培養(yǎng)液終止消化后，1500rpm離心5分鐘，去上清后加入1mlbegm培養(yǎng)基，1600rpm離心5分鐘，去上清后加入4mlbegm培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞瓶。

實施例2

支氣管原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，如圖1所示，包括如下步驟：

s1、用無菌0.008mol/l乙酸將鼠尾膠原蛋白(索萊寶)稀釋到0.05mg/ml，在12孔板內(nèi)每孔加400ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置2小時后，用保護(hù)性毛刷洗5次后，在超凈臺中利用風(fēng)機(jī)吹干并用紫外消毒40min后使用；

s2、經(jīng)支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細(xì)胞，力道均勻刷4次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養(yǎng)液的離心管內(nèi)(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內(nèi)毛刷數(shù)次后，1200rpm離心15分鐘，去上清后加入170ulbegm培養(yǎng)基，吸取50ul點到包被好的細(xì)胞培養(yǎng)皿中央，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱(細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為37℃、5％co2)培養(yǎng)4小時；取出以后加入600ul培養(yǎng)基，放細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液(胰蛋白酶－edta消化液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％)消化細(xì)胞孔10min，加入1mlrpmi1640培養(yǎng)液終止消化后，1700rpm離心5-10分鐘，去上清后加入1mlbegm培養(yǎng)基，1800rpm離心10分鐘，去上清后加入4mlbegm培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞瓶。

實施例3

支氣管原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，如圖1所示，包括如下步驟：

s1、用無菌0.007mol/l乙酸將鼠尾膠原蛋白(索萊寶)稀釋到0.04mg/ml，在12孔板內(nèi)每孔加350ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置1.5小時后，用保護(hù)性毛刷洗4次后，在超凈臺中利用風(fēng)機(jī)吹干并用紫外消毒35min后使用；

s2、經(jīng)支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細(xì)胞，力道均勻刷4次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養(yǎng)液的離心管內(nèi)(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內(nèi)毛刷數(shù)次后，1100rpm離心13分鐘，去上清后加入160ulbegm培養(yǎng)基，吸取40ul點到包被好的細(xì)胞培養(yǎng)皿中央，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱(細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為37℃、5％co2)培養(yǎng)4小時；取出以后加入550ul培養(yǎng)基，放細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液(胰蛋白酶－edta消化液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％)消化細(xì)胞孔8min，加入1mlrpmi1640培養(yǎng)液終止消化后，1600rpm離心8分鐘，去上清后加入1mlbegm培養(yǎng)基，1700rpm離心8分鐘，去上清后加入4mlbegm培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞瓶。

實施例4

支氣管原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，如圖1所示，包括如下步驟：

s1、用無菌0.006mol/l乙酸將鼠尾膠原蛋白(索萊寶)稀釋到0.05mg/ml，在12孔板內(nèi)每孔加300ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置2小時后，用保護(hù)性毛刷洗3次后，在超凈臺中利用風(fēng)機(jī)吹干并用紫外消毒40min后使用；

s2、經(jīng)支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細(xì)胞，力道均勻刷3次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養(yǎng)液的離心管內(nèi)(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內(nèi)毛刷數(shù)次后，1200rpm離心10分鐘，去上清后加入170ulbegm培養(yǎng)基，吸取30ul點到包被好的細(xì)胞培養(yǎng)皿中央，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱(細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為37℃、5％co2)培養(yǎng)4小時；取出以后加入600ul培養(yǎng)基，放細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液(胰蛋白酶－edta消化液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％)消化細(xì)胞孔5min，加入1mlrpmi1640培養(yǎng)液終止消化后，1700rpm離心5分鐘，去上清后加入1mlbegm培養(yǎng)基，1800rpm離心5分鐘，去上清后加入4mlbegm培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞瓶。

實施例5

支氣管原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，如圖1所示，包括如下步驟：

s1、用無菌0.008mol/l乙酸將鼠尾膠原蛋白(索萊寶)稀釋到0.03mg/ml，在12孔板內(nèi)每孔加360ul，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺中常溫放置1.5小時后，用保護(hù)性毛刷洗4次后，在超凈臺中利用風(fēng)機(jī)吹干并用紫外消毒40min后使用；

s2、經(jīng)支氣管鏡，用一次性氣管刷取支氣管前壁上皮細(xì)胞，力道均勻刷3-4次后，用無菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有rpmi1640培養(yǎng)液的離心管內(nèi)(無菌操作)；用一次性吸液管吹吸離心管內(nèi)毛刷數(shù)次后，1000rpm離心10-15分鐘，去上清后加入170ulbegm培養(yǎng)基，吸取30ul點到包被好的細(xì)胞培養(yǎng)皿中央，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱(細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為37℃、5％co2)培養(yǎng)4小時；取出以后加入520ul培養(yǎng)基，放細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞孔；

s3、用胰蛋白酶－edta消化液(胰蛋白酶－edta消化液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25％)消化細(xì)胞孔7min，加入1mlrpmi1640培養(yǎng)液終止消化后，1550rpm離心10分鐘，去上清后加入1mlbegm培養(yǎng)基，1750rpm離心6分鐘，去上清后加入4mlbegm培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1天換液一次，至細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞瓶。

選擇實施例3培養(yǎng)過程進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，過程如下：

刷檢獲得的支氣管上皮細(xì)胞，收集、離心以后，接種于begm培養(yǎng)基，細(xì)胞形態(tài)桿狀透明，呈單個、散在分布，懸浮于培養(yǎng)基中，鏡下可見纖毛擺動，見圖2；第2-3天，細(xì)胞逐漸貼壁、變大，呈多邊形，細(xì)胞聚集成團(tuán)，部分生長旺盛者，呈鋪路石樣，見圖3；第5到6天，細(xì)胞逐漸增殖，數(shù)量增多，體積變大，細(xì)胞大小不一，較小的細(xì)胞團(tuán)塊融合成片狀，見圖4；第7--12天細(xì)胞生長旺盛，大小均勻一致，可見大片的扁平狀、多邊形，密集呈鋪路石樣分布生長，約占整個孔的80％--90％，見圖5；第13天，將孔板上的細(xì)胞消化、離心，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，鏡下見細(xì)胞呈單個、散在分布，懸浮于培養(yǎng)基中，見圖6；第15天，細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶1--2天，逐漸貼壁，呈多邊形，散在分布，少數(shù)聚集成團(tuán)，見圖7；第16天，細(xì)胞增多，鋪路石樣生長，細(xì)胞團(tuán)變大，見圖8；第17天，細(xì)胞體積逐漸變大，細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，相鄰較小的細(xì)胞團(tuán)塊逐漸融合呈片狀，見圖9；第18天，細(xì)胞增值明顯，可見大片的扁平狀、多邊形細(xì)胞，密集呈鋪路石樣分布生長，細(xì)胞大小均勻一致，增殖成片狀，約占瓶壁的70％-80％，見圖10；第20天，凍存細(xì)胞。

支氣管原代上皮細(xì)胞存活率測定

原代支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)消化、離心后，臺盼藍(lán)染色，鏡下可見，活細(xì)胞為無色透明細(xì)胞，鏡下為強(qiáng)光點，提示細(xì)胞活性高，死細(xì)胞被染成藍(lán)色；

臺盼藍(lán)染色以后，計數(shù)，測定細(xì)胞存活率。隨機(jī)選取三個實施例作為樣本，臺盼藍(lán)染色以后分別計數(shù)，活細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)分別為97.39％、99.60％、93.40％，平均細(xì)胞存活率為96.80％。

支氣管上皮細(xì)胞免疫組化染色鑒定實施例

選擇實施例3得到的培養(yǎng)后的細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫組化染色鑒定方法進(jìn)行鑒定，具體步驟為：兔抗人的角蛋白8單克隆抗體標(biāo)記支氣管上皮細(xì)胞：將爬片用無水乙醇洗三次，每次浸泡5min，然后取出爬片，自然晾干，把消化好的支氣管上皮細(xì)胞離心、計數(shù)以后，取5萬個細(xì)胞，接種于爬片上進(jìn)行培養(yǎng)，定期光鏡下觀察，待爬片長滿細(xì)胞以后，爬片制作完成→4％多聚甲醛固定20min→pbs洗5min、3次→5％牛血清白蛋白室溫孵育1小時→pbs洗5min、3次→1:20稀釋一抗，取30ul，將爬片正面向下貼合一抗，放于濕盒中4℃冰箱孵育一整夜→pbs洗5min、3次→加入檢測試劑山羊抗兔igg/hrp聚合物15min→pbs洗5min、3次→dapi染色7min→pbs洗5min、3次→90％甘油封片→倒置相差顯微鏡下觀察。

原代培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)消化、離心，爬片以后，用兔抗人細(xì)胞角蛋白8單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫組化染色鑒定，光鏡下，支氣管上皮細(xì)胞胞漿著色為綠色，見圖11、12；胞核復(fù)染為藍(lán)色，見圖13、14。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求和說明書的范圍當(dāng)中。