本發(fā)明屬于生物免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種腫瘤抑制因子p16的抗原多肽和其應(yīng)用以及和含有腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的用于檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒。

背景技術(shù)：

大量研究表明，血清或血漿中的腫瘤相關(guān)抗原能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生自身抗體，在惡性腫瘤惡變的前3-5年，患者血中可出現(xiàn)高濃度的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體。這說明，既可以利用抗體檢測腫瘤抗原，也可以利用腫瘤抗原檢測自身抗體，但是利用腫瘤自身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢測腫瘤要高的多。原因是很多腫瘤相關(guān)抗原不僅在腫瘤患者體內(nèi)存在，在正常人體內(nèi)也存在，導(dǎo)致近年來的臨床報道抗體檢測方法敏感度低，特異性差，假陰性比率可高達50％以上。其主要原因是由于每一種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在患者中的陽性檢測率平均在10％左右。因此，檢測血中腫瘤相關(guān)抗原自身抗體具有預(yù)測腫瘤發(fā)病風(fēng)險和早期診斷腫瘤的重要價值，是腫瘤臨床診斷領(lǐng)域的重點發(fā)展方向之一。

在正常人體內(nèi)自身抗體含量很低檢測不到或根本不存在，若體內(nèi)自身抗體水平明顯增高，則表明體內(nèi)存在異常免疫情況，表明體內(nèi)相關(guān)抗原水平發(fā)生波動，預(yù)示疾病的存在或原有疾病加重。

p16為細胞周期依賴激酶(cdk)抑制蛋白的基因家族中發(fā)現(xiàn)的突變率最高的基因，又稱多種腫瘤抑癌基因1(mts1)。p16蛋白的功能是g1周期中與cyclind1競爭性結(jié)合cdk4并特異性抑制cdk4阻止細胞尤其是帶有損傷dna的細胞進入s期，對細胞周期直接起反向調(diào)節(jié)作用，從而控制細胞分裂。當p16基因發(fā)生缺失、突變、轉(zhuǎn)錄和表達異常時，p16蛋白的合成障礙則引起細胞增殖的失控，使細胞無限制生長、分裂并向癌變轉(zhuǎn)化。說明p16作為一種細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其表達異常和功能喪失都能引起腫瘤的惡性進展和不良預(yù)后。通過測定細胞中p16蛋白的含量可判斷腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及估計患者的預(yù)后。

雖然自身抗體對腫瘤的診斷和預(yù)后是一種極有前途的生物標志物，對于腫瘤的早期診斷、改善患者預(yù)后和降低死亡率方面有重要的意義。但是，自身抗體作為腫瘤診斷標志物還存在很多問題：①檢測陽性率低，②研究隊列的樣本量小，③敏感性不足，④檢測成本較高。這些不足制約了自身抗體作為常用生物標志物的應(yīng)用。

另外，目前以重組蛋白為抗原，要經(jīng)過載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、表達、篩選、純化等繁瑣的過程，蛋白空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，抗原表位不易暴露，抗原抗體結(jié)合的特異性差。同時，elisa法的高靈敏性對純化技術(shù)的穩(wěn)定性要求極高，成本昂貴。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種腫瘤抑制因子p16的抗原多肽和含有腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的用于檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒，以解決現(xiàn)有將自身抗體作為腫瘤診斷標志物的方法存在的靈敏度和特異性不高，且成本高的不足。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明一方面，提供了一種腫瘤抑制因子p16的抗原多肽。所述腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的多肽活性片段為下列至少一種氨基酸序列：

(1)seqidno:1所示的氨基酸序列：dwlatpaardpveevr

(2)seqidno:1所示的氨基酸序列經(jīng)缺失、插入或替換所獲得的具有相同功能的氨基酸序列。

本發(fā)明另一方面，提供了本發(fā)明腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的一種應(yīng)用方法。所述腫瘤抑制因子p16的抗原多肽在制備檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明又一方面，提供了用于檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒。所述試劑盒包括本發(fā)明抗原多肽。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明腫瘤抑制因子p16的抗原多肽由于含有seqidno:1所示序列的氨基酸序列的多肽活性片段，其具有的特定抗原決定簇，從而提高了本發(fā)明抗原多肽與待測樣本中所含的腫瘤抑制因子p16的自身抗體之間的特異結(jié)合率，同時降低了檢測腫瘤抑制因子p16的自身抗體的成本。

本發(fā)明用于檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒由于含有本發(fā)明腫瘤抑制因子p16的抗原多肽，因此，賦予本發(fā)明試劑盒能夠快速檢測樣品中腫瘤抑制因子p16的自身抗體的含量，并提高了檢查的靈敏度高和檢測效率，從而能夠準確預(yù)測早期腫瘤的危險性，并為腫瘤新藥研究提供可靠數(shù)據(jù)，同時降低了預(yù)測早期腫瘤的經(jīng)濟成本。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的疏水性分析圖；

圖2是本發(fā)明實施例腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的表面可及性分析圖；

圖3是本發(fā)明實施例腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的彈性區(qū)域分析圖；

圖4是本發(fā)明實施例sbi特異性結(jié)合曲線圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下文所述的相關(guān)術(shù)語解釋：

多肽：α-氨基酸以肽鍵連接在一起而形成的化合物，它也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物。

抗體(antibody)：是一種由漿細胞(效應(yīng)b細胞)分泌，被免疫系統(tǒng)用來鑒別與中和外來物質(zhì)如細菌、病毒等的大型y形蛋白質(zhì)。

抗原(antigen，縮寫ag)：任何可誘發(fā)免疫反應(yīng)的物質(zhì)。

抗原-抗體反應(yīng)(antigen－antibodyreaction)：是抗原和對應(yīng)抗體在一定條件下特異結(jié)合形成可逆性抗原－抗體復(fù)合物的過程。

抗原決定簇：它可以是由連續(xù)序列(蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu))組成或由不連續(xù)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)組成，決定抗原性的特殊化學(xué)基團，又稱抗原表位。

大量研究表明，血清或血漿中的腫瘤相關(guān)抗原能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生自身抗體，在惡性腫瘤惡變的前3-5年，患者血中可出現(xiàn)高濃度的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體。而且利用腫瘤自身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢測腫瘤要高的多。因此，本發(fā)明實施例以細胞周期依賴激酶(cdk)抑制蛋白基因p16的自身抗體作為腫瘤標志物，并依據(jù)抗原-抗體反應(yīng)的結(jié)合實際上只發(fā)生在抗原決定簇(抗原表位)和抗體的抗原結(jié)合位點之間實現(xiàn)兩者在空間結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上完全互補特性，本發(fā)明實施例提供了下文的含有特異序列的腫瘤抑制因子p16的抗原多肽和相應(yīng)的試劑盒。

(一)腫瘤抑制因子p16的抗原多肽

一方面，本發(fā)明實施例提供了一種基于特異性免疫應(yīng)答腫瘤抑制因子p16蛋白的抗原多肽。所述腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的多肽活性片段為下列至少一種氨基酸序列：

(1)seqidno:1所示的氨基酸序列：dwlatpaardpveevr；

(2)seqidno:1所示的氨基酸序列經(jīng)缺失、插入或替換所獲得的具有相同功能的氨基酸序列。

上述含有seqidno:1所示氨基酸序列的腫瘤抑制因子p16的抗原多肽由于含有特定的抗原決定簇，使得其能夠與腫瘤抑制因子p16自身抗體抗原結(jié)合位點發(fā)生特異識別和結(jié)合，從而提高了上述抗原多肽與待測樣本中所含的腫瘤抑制因子p16的自身抗體之間的特異反應(yīng)，并提高兩者的特異結(jié)合率。這樣，將用其與待測樣本如血樣本中的腫瘤抑制因子p16的自身抗體特異識別和結(jié)合后，能夠間接檢測出待測樣本中腫瘤抑制因子p16的自身抗體的含量水平，通過對自身抗體的含量水平判斷，從而間接判斷待測樣本來源體的腫瘤發(fā)病風(fēng)險和進展。例如在正常人體內(nèi)腫瘤抑制因子p16的自身抗體含量很低檢測不到或根本不存在，若體內(nèi)腫瘤抑制因子p16的自身抗體水平明顯增高，則表明體內(nèi)存在異常免疫情況，表明體內(nèi)相關(guān)抗原水平發(fā)生波動，預(yù)示疾病的存在或原有疾病加重。其中，腫瘤抑制因子p16的自身抗體可以是抗腫瘤抑制因子p16的特異性自身igg抗體。一實施例中，可以利用上述腫瘤抑制因子p16的抗原多肽采用酶聯(lián)免疫法對待測樣本如血液樣本中腫瘤抑制因子p16的自身抗體的含量檢測，具體采用酶聯(lián)免疫法檢測方法如下文所述。

另外，上述腫瘤抑制因子p16的抗原多肽所含的seqidno:1所示氨基酸序列為簡單的線性多肽氨基酸序列，其相對于現(xiàn)有重組蛋白的抗原而言，其獲得的成本顯著降低，而且與腫瘤抑制因子p16的自身抗體的特異性強。其中，設(shè)計上述含有seqidno:1所示氨基酸序列的腫瘤抑制因子p16的抗原多肽是按照如下線性多肽原則設(shè)計：

(1)盡可能是在蛋白表面；(2)保證抗原片段序列不形成α-helix；(3)n端和c端的肽段比中間的肽段更好；(4)避免蛋白內(nèi)部重復(fù)或接近重復(fù)段的序列；(5)避免同源性太強的肽段；(6)交聯(lián)可以交聯(lián)在n，c兩端，選擇依據(jù)就是交聯(lián)在對產(chǎn)生抗體不太重要的一端；(7)序列中不能有太多的脯氨酸(pro)，但有1～2個pro有好處，可以使肽鏈結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定一些，對產(chǎn)生特異性抗體有益。

進一步地，設(shè)計上述含有seqidno:1所示氨基酸序列的腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的抗原設(shè)計選擇為：利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫資料和在線工具對蛋白的結(jié)構(gòu)進行分析，預(yù)測蛋白的ph值、疏水性、柔性、表面可及性、抗原性等相關(guān)參數(shù)。遵循線性多肽設(shè)計原則和方法，設(shè)計了如seqidno:1氨基酸序列。其中p16抗原蛋白(cyclin-dependentkinase4inhibitora[p16-ink4a])的序列如下seqidno:2所示，其中加框部分為上述腫瘤抑制因子p16的抗原多肽以及在p16抗原蛋白中的位置)：

上述seqidno:1和seqidno:2序列中的每一個大寫字母均是對應(yīng)一個相應(yīng)簡稱的氨基酸。

在上文各實施例的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，還可以對上文所述的腫瘤抑制因子p16的抗原多肽進行化學(xué)修飾，以便增加腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的抗原性和有助于多肽的包被處理。

上述抗原多肽可通過化學(xué)合成得到，也可以通過基因工程技術(shù)得到，此技術(shù)為行業(yè)內(nèi)所熟悉。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可以有效地通過常規(guī)合成方法，合成上述腫瘤抑制因子p16的抗原多肽，從而代替重組表達的生物合成方式。

因此，上文腫瘤抑制因子p16的抗原多肽由于含有seqidno:1所示序列的氨基酸序列的多肽活性片段，其具有的特定抗原決定簇，從而提高了與待測樣本中所含的腫瘤抑制因子p16的自身抗體之間的特異結(jié)合率。而且優(yōu)選采用化學(xué)合成方法合成上文腫瘤抑制因子p16的抗原多肽，有效避免了采用基因工程技術(shù)要經(jīng)過載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、表達、篩選、純化等繁瑣的過程，獲得蛋白空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、抗原表位不易暴露、抗原抗體結(jié)合的特異性差的不足，有效降低了檢測腫瘤抑制因子p16的自身抗體的成本。

(二)腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的應(yīng)用

另一方面，本發(fā)明實施例提供了上文腫瘤抑制因子p16的抗原多肽在制備檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒中的應(yīng)用。由于上文腫瘤抑制因子p16的抗原多肽其具有特定抗原決定簇，從而提高了與待測樣本中所含的腫瘤抑制因子p16的自身抗體之間的特異結(jié)合率。因此，應(yīng)用上文腫瘤抑制因子p16的抗原多肽可以檢測胃癌、肝癌、宮頸癌等含有p16基因異常表達的癌癥患者血液中相應(yīng)的特異性自身抗體。通過檢測體內(nèi)自身抗體含量變化情況，可以間接監(jiān)控體內(nèi)相關(guān)抗原水平發(fā)生波動，預(yù)示疾病的存在或原有疾病加重，如判斷腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及估計患者的預(yù)后。因此，在具體實施例中，該檢測血樣品為血漿或血清。

為此，在本發(fā)明實施例的第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒。所述試劑盒至少包括上文所述的腫瘤抑制因子p16的抗原多肽。

在一實施例中，上述試劑盒所含的腫瘤抑制因子p16的抗原多肽可以是溶劑的形式存在，也可以直接被包被在酶標板上。其中，腫瘤抑制因子p16的抗原多肽包被在酶標板上的方法可以是本領(lǐng)域常規(guī)的包被處理方法。

在進一步實施例中，上述試劑盒還可以包括抗原包被緩沖液、參比抗原、pbst洗滌緩沖液、樣品稀釋分析液、二抗標準液、終止緩沖液、底物顯色液中的至少一種。

在具體實施例中，上述試劑盒所含的包被緩沖液只要是能夠保證抗原多肽活性的均可，具體可以是下文中表1的包被緩沖液。該包被緩沖液可以用來包被上文腫瘤抑制因子p16的抗原多肽。

上述試劑盒所含的參比抗原可以為gag。

上述試劑盒所含的pbst洗滌緩沖液可以是酶聯(lián)免疫法中常用的pbst洗滌緩沖液。具體可以是下文中表4的pbst洗滌緩沖液，其可以用來洗滌酶標板等。因此，在一實施例中，上述試劑盒還可以包含酶標板，如96孔酶標板。

上述試劑盒所含的樣品稀釋分析液可以是酶聯(lián)免疫法中常用的樣品稀釋分析液。具體可以是下文中表5的樣品稀釋分析液，其可以用來稀釋待測樣本、腫瘤抑制因子p16的抗原多肽和二抗等。

上述試劑盒所含的二抗標準液中的二抗為羊抗人igg和羊抗人iga，具體可以是以hrp-lgg或hrp-iga的形式存在。

上述試劑盒所含的底物顯色液的顯色劑可以為3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺。當然還可以是酶聯(lián)免疫法中其他顯色劑。

因此，上述用于檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒由于含有上文腫瘤抑制因子p16的抗原多肽，因此，賦予上述試劑盒能夠快速檢測樣品中腫瘤抑制因子p16的自身抗體的含量，并提高了檢查的靈敏度高和檢測效率，從而能夠準確預(yù)測早期腫瘤的危險性，并為腫瘤新藥研究提供可靠數(shù)據(jù)，并降低成本。同時，通過在上述試劑盒中配置抗原包被緩沖液、參比抗原、pbst洗滌緩沖液、樣品稀釋分析液、二抗標準液、終止緩沖液、底物顯色液中的至少一種。以提高上述試劑盒的使用方便，避免件檢測過程中需要額外的準備其他試劑，提高了檢查效率，同時保證了檢測樣品中腫瘤抑制因子p16的自身抗體的含量的穩(wěn)定性和準確性。

利用上文腫瘤抑制因子p16的抗原多肽或者上文用于檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒采用elisa法自身抗體檢測的實驗方法如下：

(1)實驗設(shè)計(對照)：96孔酶標板，每個血漿樣本設(shè)人抗原多肽雙復(fù)孔，對照參比抗原(gag)雙復(fù)孔和陰性對照雙復(fù)孔(nc)。gag抗原與人類蛋白質(zhì)組無同源性，減小非特異性結(jié)合反應(yīng)的干擾；

(2)固相包被：抗原用包被緩沖液包被于96孔酶標板，每孔100μl，抗原多肽包被濃度1.0～5.0μg/ml，gag包被濃度為10μg/ml，4℃過夜；

(3)血漿樣本(一抗)：采用洗液(0.01mtris-hcl，ph8.8)清洗每孔3遍，利用分析液將血漿1:200稀釋，每孔100μl，25℃孵育2h；

(4)酶標抗體(二抗)：洗液(0.01mtris-hcl，ph8.8)清洗每孔3遍，利用分析液稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗人igg或辣根過氧化物酶標記的羊抗人iga，每孔加100μl，25℃孵育2h；

(5)顯色：洗液(0.01mtris-hcl，ph8.8)清洗每孔3遍，利用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)為過氧化物酶的底物，每孔加100μl，室溫避光20～30min。

(6)檢測：每孔加50μl10％hci為反應(yīng)終止液，10min內(nèi)使用酶標儀檢測od值，檢測波長為450nm，參考波長為630nm。

其中，上述采用elisa法自身抗體檢測的質(zhì)控如下：

各樣本設(shè)雙復(fù)孔，取平均od值。od值離散度判定：離散度＝od1-od2/od1+od2，離散度≤0.1，為有效結(jié)果；離散度＞0.1，為無效結(jié)果。取100份健康人血清等體積混合作為質(zhì)控血qc，代表人群的普遍情況，每板均設(shè)2個qc血漿孔，以qc血漿孔的od值變異水平判定結(jié)果的穩(wěn)定性，批間變異cv＝所有批次qc孔sd/所有批次qc孔od均值＜10％。批內(nèi)變異cv＝每日各板qc孔sd/每日各板qc孔均值＜5％。

上述采用elisa法自身抗體檢測方法步驟(6)獲得的檢測數(shù)據(jù)分析：

采用spss19.0forwindows進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用特異結(jié)合指數(shù)(specificbindingindex，sbi)來判定p16抗原多肽與血漿自身抗體的結(jié)合程度，sbi＝p16od值-ncod/gagod值-ncod，nc為各樣本的陰性對照。以健康人sbi平均值+2sd判為陽性，判定靈敏度和特異度；進行秩和(z)檢驗，檢驗一類錯誤水準為a＝0.05。

現(xiàn)以具體的腫瘤抑制因子p16的抗原多肽和含有腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的試劑盒為例，對本發(fā)明做進一步詳細說明。

實施例1

本實施例1提供了一種腫瘤抑制因子p16的抗原多肽，所述腫瘤抑制因子p16的抗原多肽含有seqidno:1所示的氨基酸序列。當然，seqidno:1所示的氨基酸序列經(jīng)缺失、插入或替換所獲得的具有相同功能的氨基酸序列也在本實施例公開的范圍。

本實施例1提供的腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的合成方法如下：

一、通過多肽1的氨基酸序列合成編碼多肽1的基因序列，在多肽1的基因序列前后分別增加his-tag標簽，并在編碼多肽1基因序列和his-tag標簽之間插入消化酶酶切位點。

二、dh5α質(zhì)粒擴增載體轉(zhuǎn)化：

1.將插入多肽1基因序列的細菌37℃活化過夜；

2.以1:100的比例吸取過夜菌液(250μl)加入25mllb液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)2-3h至od600達到0.5左右；

3.將25ml菌液移至預(yù)冷的50mlep管中，在冰上放置30min，使培養(yǎng)基冷卻到0℃；

4.于4℃，4000rpm離心10min，回收細胞；

5.倒出培養(yǎng)基，將管倒置于吸水紙上1min；

6.每50ml菌液用10ml預(yù)冷的0.1mol/l的cacl2，重懸每份沉淀，冰浴30min；

7.于4℃，以4000rpm離心10min，回收細胞；

8.倒出培養(yǎng)液，將管倒置于吸水紙上1min；

9.每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol/l的cacl2(含15％甘油)重懸每份細胞沉淀；

10.取50μl大腸桿菌感受態(tài)細胞，加入4μl質(zhì)粒冰浴30min后，42℃熱激90s，馬上放回冰上，冰浴2min：加400μllb培養(yǎng)基，于37℃搖床慢搖振蕩培養(yǎng)45-60min；取50-100μl涂在含有氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜；

三、質(zhì)粒抽提：

1.挑取lb固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20mllb(含amp100ug/ml)液體培養(yǎng)基中，37℃、250rmp振蕩培養(yǎng)過夜(約12-14hr)；

2.取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mlep管中，12000rmp離心1-2min。棄上清，將離心管倒置于吸水紙上幾分鐘，使液體盡可能流盡；

3.菌體沉淀重懸浮于100μl溶液ⅰ中，需劇烈振蕩，室溫下放置5-10min；

4.加入新配制的溶液ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒ep管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物，冰浴5min，使細胞膜裂解；

5.加入150μl預(yù)冷的溶液ⅲ，蓋緊管口，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置5min。離心12000rmp，10min；

6.上清液移入干凈ep管中，加入450μl的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，12000rmp離心10min；

7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2-5min，離心12000rmp，10min；

8.棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，離心12000rmp，5min；

9.吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，室溫干燥；

10.將沉淀溶于20μlte緩沖液(ph8.0，含20μg/mlrnasea4μl，37℃水浴30min以降解rna分子，儲于-20℃冰箱中；

四、bl21質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)化：

1.感受態(tài)細胞使用前在冰中融化；

2.融化后，輕柔混合均勻，取100μl移入ep管中；

3.加入目的蛋白表達用質(zhì)粒(10ng以下)；

4.冰中放置30min；

5.于42℃放置45s；

6.立即移入冰中放置1-2min；

7.加入37℃預(yù)溫的soc培養(yǎng)基900μl；

8.于37℃振蕩培養(yǎng)1h(160-225rpm)；

9.將適量培養(yǎng)液涂布在含有抗生素的lb平板上；

10.于37℃過夜培養(yǎng)；

11.取50μl大腸桿菌感受態(tài)細胞，加入4μl質(zhì)粒冰浴30min后，42℃熱激90s，馬上放回冰上，冰浴2min：加400μllb培養(yǎng)基，于37℃搖床慢搖振蕩培養(yǎng)45-60min；取50-100μl涂在含有氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜；

五、bl21裂解：

1.挑取lb固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20mllb(含amp100ug/ml)液體培養(yǎng)基中，37℃、250rmp振蕩培養(yǎng)過夜(約12-14hr)；

2.收集培養(yǎng)液，4℃7000-8000g離心10min，收集沉淀的菌體；

3.取1-2g菌體加10ml破碎緩沖液在冰上混合45min；

4.把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎20s種，破碎四次，中間間隔要保持2min冷卻破碎液，控制ph為7-8；

5.破碎液4℃12000g離心10min；

6.破碎離心的上清加2m咪唑溶液0.12ml使終濃度為20mm，樣品的總體積為10ml；

六、多肽1分離與提純

1.平衡緩沖液：ph7.4的50mm磷酸緩沖液含0.5mnacl，含20mm咪唑；

2.洗脫緩沖液：ph7.4的50mm磷酸緩沖液含0.5mnacl，含500mm咪唑；

3.取1ml鎳瓊脂糖凝膠ff預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后取破碎上清10ml樣品以0.5ml/min上樣，然后2ml/管分管收集；

4.用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集；

5.用5ml洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集；

6.再用5ml平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20％乙醇，封閉，以備下次使用；

7.收集的部分用紫外分光光度法測定蛋白的濃度，再取有蛋白的部分電泳檢測純度。

對本實施例1提供的腫瘤抑制因子p16的抗原多肽相關(guān)性能如ph值、疏水性、柔性、表面可及性、抗原性等相關(guān)性能進行分析，，其分析結(jié)果如圖1-4所示。其中，

腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的疏水性分析結(jié)果如圖1所示，腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的表面可及性分析結(jié)果如圖2所示，腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的彈性區(qū)域分析結(jié)果如圖3所示。因此，本實施例提供的腫瘤抑制因子p16的抗原多肽具有如圖1-3的疏水性、柔性、表面可及性等相關(guān)性能，遵循線性多肽設(shè)計原則和方法。

實施例2

本實施例提供了實施例1中腫瘤抑制因子p16的抗原多肽(簡稱p16抗原多肽)與血清及血漿igg結(jié)合的方法，所述方法如下：

用96孔酶標板對p16多肽抗原包被，設(shè)置濃度梯度為1.0μg～5.0μg/ml，設(shè)置雙復(fù)孔，一抗用qc結(jié)合，最后酶標儀檢測得到sbi特異性結(jié)合曲線。

其中，所述sbi結(jié)合曲線圖如圖4所示。由圖4可知，p16濃度1.0～4.0μg/ml時，隨著濃度的增大，sbi值逐漸下降；當p16抗原多肽濃度4.0～4.5μg/ml時，隨著濃度的增大，sbi值逐漸上升。此sbi結(jié)合曲線表明，當p16抗原多肽為1.0μg/ml的較低濃度時，96孔酶標板的板底沒有被鋪滿，導(dǎo)致非特異性反應(yīng)高，所以此時sbi值偏高，為假陽性結(jié)果；隨著p16抗原多肽濃度增高，抗原逐漸鋪滿整個板底，其阻斷作用顯現(xiàn)，非特異性反應(yīng)逐漸減小，到4.0μg/ml時非特異性反應(yīng)最低，此時p16抗原多肽與igg抗體的特異性結(jié)合開始出現(xiàn)，并隨著抗原濃度的增高逐漸增強，趨于平穩(wěn)。此sbi結(jié)合曲線充分體現(xiàn)了p16抗原多肽與血漿中自身igg抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)過程。

實施例3

本實施例3提供含有實施例1中腫瘤抑制因子p16的抗原多肽的用于檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒。

1.本實施例提供的用于檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒包含下文表1-8所述的試劑：

表1.抗原包被緩沖液

表2.工作抗原

表3.參比抗原

表4.0.1mpbst洗滌緩沖液(1000ml體積)

表5.樣品稀釋分析液

表6.二抗標準液

表7.終止緩沖液

表8.底物顯色液

2.本實施例用于檢測血樣品中p16自身抗體水平的試劑盒的操作方法如下：

(1)包被：工作抗原及參比抗原包被液稀釋至工作濃度，包被于酶標板，4℃過夜；

(2)加血漿樣本(一抗)：洗滌緩沖液清洗酶標板3遍，分析液以1∶200將血漿稀釋至合適濃度，每孔加入100μl，25℃或室溫孵育2h；

(3)加酶標抗體(二抗)：洗滌緩沖液清洗3遍，利用分析液稀釋二抗標準液igg，每孔加200μl，25℃/室溫孵育2h；

(4)顯色：洗滌緩沖液清洗3遍，每孔加100μl底物顯色液，室溫避光20～30min。

(5)檢測：每孔加50μlhcl終止液，10min內(nèi)檢測od，波長為450nm，參考波長為630nm。

實施例4

實施例3提供的試劑盒在肝癌、胃癌患者的p16自身igg抗體檢測中的臨床應(yīng)用。

1.樣本收集：

健康組樣本：健康組188例，平均年齡為50.07±10.36歲，其中男112例，女76例；

肝癌組樣本：肝癌組113例，平均年齡為51.5±9.2歲，其中男67例，女46例。健康組與肝癌組在性別、年齡匹配，具有可比性(p＞0.05)；

胃癌組樣本：胃癌組122例，平均年齡為49.62±7.46歲，其中男69例，女53例。健康組與食管癌組在性別、年齡匹配，具有可比性(p＞0.05)。

2.檢測方法如實施例3中第2節(jié)所述的操作方法；

3.檢測結(jié)果：

由表10可知，肝癌腫瘤患者血漿中p16抗原多肽檢測igg抗體靈敏度為39.3％特異度為90.2％。通過對比分析，肝癌患者血漿中與p16抗原多肽結(jié)合的igg抗體陽性率明顯高于健康組(z＝-3.68，p＜0.001)。

胃癌腫瘤患者血漿中p16抗原多肽檢測igg抗體靈敏度為42.7％，特異度為89.8％。通過對比分析，肝癌患者血漿中與p16抗原多肽結(jié)合的igg抗體陽性率同樣明顯高于健康組(z＝-4.34，p＜0.001)。

以上數(shù)據(jù)充分表明，利用本發(fā)明所設(shè)計的抗原多肽檢測得到的肝癌患者自身抗體igg水平與正常健康組比較有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。通過檢測腫瘤患者血清及血漿中自身抗體含量，可開發(fā)相應(yīng)的快速檢測試劑盒，提前診斷早期腫瘤的危險性。

表10.胃癌與肝癌患者中p16自身igg抗體檢測及對比分析

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>深圳市華中生物藥械有限公司

<120>腫瘤抑制因子p16的抗原多肽和其應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<212>prt

<213>人工合成

<400>1

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<210>2

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<212>prt

<213>p16的抗原多肽序列

<400>2

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