本發(fā)明涉及細(xì)胞分裂素kinetinriboside(kr)作為一種細(xì)胞周期阻滯劑對(duì)肺癌細(xì)胞株抗腫瘤作用，屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肺癌目前是全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤。近20年來(lái)，由于大力推行戒煙，歐洲和美國(guó)等西方國(guó)家男性肺癌的發(fā)病率已開(kāi)始下降，但女性肺癌的發(fā)病率卻持續(xù)上升。我國(guó)是香煙生產(chǎn)和銷(xiāo)售大國(guó)，不論男性還是女性，肺癌的發(fā)病率均呈持續(xù)上升趨勢(shì)，尤以女性發(fā)病率上升更快。臨床研究表明，原位癌治愈率接近100％，i期肺癌患者的5年生存率達(dá)60％～90％，而ⅲb和ⅳ患者的5年生存率僅5％～20％。臨床上用于治療肺癌的常規(guī)藥物雖然對(duì)治療起到重要作用，但卻存在著明顯的毒副作用。經(jīng)大量實(shí)踐證明，運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)，從天然產(chǎn)物中獲得的天然活性物質(zhì)的活性成分能治療肺癌，同時(shí)減輕放化療的毒副作用。因此，尋找有效提高治療效率，毒副作用小的天然藥物來(lái)治療肺癌是十分必要的。

細(xì)胞分裂素ck(cytokinin)是二十世紀(jì)五十年代年被發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)植物激素，它在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起決定性作用，如：促進(jìn)細(xì)胞的分裂、組織分化、側(cè)芽生長(zhǎng)，抑制不定根、側(cè)根形成，抑制衰老，調(diào)節(jié)植物的頂端優(yōu)勢(shì)，營(yíng)養(yǎng)引號(hào)的傳遞等，天然存在的細(xì)胞分裂素是腺嘌呤的衍生物，是其嘌呤n6位置上的h被其它基團(tuán)取代形成的?；钚砸騻?cè)鏈的長(zhǎng)度、不飽和度和其它性質(zhì)不同而有很大差異。細(xì)胞分裂素的存在形式包括：游離、核苷，核苷-5’磷酸、3-,7-,9-和o-糖苷和氨基結(jié)合物。常見(jiàn)的天然存在的細(xì)胞分裂素有：玉米素(zeatin,zt)、玉米素核苷(zeatinriboside,zr)、二氫玉米素(dihydrozeatin,dhzt)、異戊烯基腺苷(isopentenyladenosine,i6a)。目前越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，ck不僅調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育同時(shí)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的增值和分化也起到很重要的影響。

kr(kinetinriboside)是一種存在于植物中的細(xì)胞分裂素ck的核苷形式，俗名為激動(dòng)素核苷，分子式為c15h17n5o5,分子量為347.3。核苷類(lèi)化合物的共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是由糖基和堿基構(gòu)成，從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來(lái)看天然核苷與核苷類(lèi)化合物存在不同程度的相似之處，從而猜測(cè)kr也可以干擾或者直接作用于蛋白質(zhì)、核酸的生物合成，而干擾腫瘤細(xì)胞和病毒復(fù)制，在抗腫瘤和抗病毒方面發(fā)揮著重要的作用。據(jù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)kr是一種能誘導(dǎo)某些細(xì)胞株凋亡的抗增殖劑，其原理是可以上調(diào)cdkn1a引起atp耗竭，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在g0/g1期。在體外對(duì)癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性和促凋亡作用。當(dāng)用kr處理肺癌細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞周期不同程度的受阻和(或者)凋亡。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了kr在人肺癌細(xì)胞株中抗腫瘤的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種細(xì)胞周期阻滯劑kr在人肺癌細(xì)胞中的應(yīng)用，步驟如下：

(1)細(xì)胞復(fù)蘇：將裝有凍存人肺癌細(xì)胞株a549的凍存管從-80℃冰箱中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕微搖動(dòng)，待液體融化；將凍存管中的人肺癌細(xì)胞株a549懸浮于含有10％滅活胎牛血清的無(wú)菌rpmi1640培養(yǎng)液的離心管中，1000rpm，5min離心，離心結(jié)束后，棄上清，輕輕彈起細(xì)胞，再次入無(wú)菌rpmi1640培養(yǎng)液與離心管中，把細(xì)胞懸浮起來(lái)，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中左右輕輕搖動(dòng)，使培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞均勻分布，得到復(fù)蘇的人肺癌細(xì)胞株a549；

(2)細(xì)胞培養(yǎng)：將復(fù)蘇的人肺癌細(xì)胞株a549置于濃度為5％co2、相對(duì)濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10h后觀察細(xì)胞，若已貼壁，將培養(yǎng)液全部吸出，再次加入等量的rpmi1640培養(yǎng)液；待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底面積的70％～80％傳代1次；

(3)藥物配制：用無(wú)菌的不含血清的rpmi1640培養(yǎng)基溶解kr粉末，使kr溶液的母液濃度達(dá)到1.2mm，繼續(xù)用無(wú)菌rpmi1640培養(yǎng)基將溶解好的kr溶液的母液稀釋至濃度為2μm-200μm，過(guò)濾除菌，室溫保存；

(4)處理細(xì)胞：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，稀釋?zhuān)♂尲?xì)胞密度為3×10⁴～5×10⁴個(gè)/ml，吹打混勻，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔取100μl人肺癌細(xì)胞株a549，12h后，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置7組實(shí)驗(yàn)，每組4個(gè)復(fù)孔，第1組：空白對(duì)照組；第2組：120μμkr組；第3組：20μμkr組；第4組：10μμkr組；第5組：2μμkr組；第6組：1μμkr組；第7組：0.2μμkr組；分別向各組中加入10μl對(duì)應(yīng)的藥物，輕輕混勻后，置于濃度為5％co2、相對(duì)濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育2天，檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制活性；

(5)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率：將步驟(4)處理后的細(xì)胞，置于濃度為5％co2、相對(duì)濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育48h，各4個(gè)復(fù)孔；采用mtt試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每孔細(xì)胞懸液中加20μlmtt溶液，置于37℃，co2培養(yǎng)箱中孵育3h，測(cè)定490nm處各組細(xì)胞的吸光度，記錄數(shù)據(jù)；

(6)檢測(cè)細(xì)胞周期：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取適量細(xì)胞進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尲?xì)胞密度為1×10⁵～1.5×10⁵個(gè)/ml，吹打混勻，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2ml人肺癌細(xì)胞株a549，12h后，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置空白對(duì)照組和10μμkr組，向10μμkr組中加入kr，使kr的濃度為10μμkr，輕輕混勻后，置于濃度為5％co2、相對(duì)濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育36h，用15ml離心管分裝成兩個(gè)樣品，按照細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)固定細(xì)胞并配制碘化丙染色緩沖液，12h后，每個(gè)樣品中加入pbs洗多次次，重懸細(xì)胞，每個(gè)樣品加入所需碘化丙染色緩沖液37℃避光孵育30min，最后用pbs洗兩次；300目篩網(wǎng)過(guò)濾后用bdfacscalibur流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的數(shù)據(jù)建立在kr可以上調(diào)cdkn1a引起atp耗竭，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在g0/g1期，有非常顯著的體外增殖抑制活性的基礎(chǔ)之上。

附圖說(shuō)明

圖1為不同濃度kr對(duì)人肺癌細(xì)胞株增殖的抑制作用。

圖2為kr對(duì)人肺癌細(xì)胞株a549細(xì)胞周期的影響。(a)為對(duì)照組。(b)為10μμkr處理36h后a549細(xì)胞的細(xì)胞周期。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和技術(shù)方案，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

本發(fā)明使用的細(xì)胞、試劑盒以及試劑：人肺癌細(xì)胞株a549，胎牛血清、雙抗(青霉素/鏈霉素)，rpmi1640培養(yǎng)基，mtt試劑盒，細(xì)胞周期與凋亡染色試劑盒，kr。

實(shí)施例1

kr對(duì)人肺癌細(xì)胞株a549的體外增殖抑制活性：將復(fù)蘇的人肺癌細(xì)胞株a549培養(yǎng)于含有10％fbs滅活胎牛血清、1％青霉素/1％鏈霉素(雙抗)的無(wú)菌rpmi1640培養(yǎng)液中，置于懸浮細(xì)胞瓶中，在37℃、5％co2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至70％-80％左右傳代1次。繼續(xù)培養(yǎng)得到生長(zhǎng)狀態(tài)活躍的人肺癌細(xì)胞株，收集細(xì)胞。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5×10³個(gè)細(xì)胞接種于每孔含有100μlrpmi1640培養(yǎng)液的96孔板中，按照實(shí)驗(yàn)需求，處理組分別加入10μl的120μm、200μm、100μm、20μm、10μm、2μm濃度kr，放入培養(yǎng)箱中孵育2天，各4個(gè)復(fù)孔。采用mtt試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每孔細(xì)胞中加20μlmtt溶液，置于37℃，co2培養(yǎng)箱中孵育3h。測(cè)定490nm處各組細(xì)胞的吸光度，記錄數(shù)據(jù)，采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析方法來(lái)分析各組數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖1所示。圖1可見(jiàn)，施用不同濃度的kr對(duì)人肺癌細(xì)胞株a549的增殖速率顯著低于對(duì)照組，表明kr可以抑制人肺癌細(xì)胞株a549的增殖速率。

實(shí)施例2

kr誘導(dǎo)a549細(xì)胞凋亡：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期上述培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取適量細(xì)胞進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尲?xì)胞密度為1×10⁵～1.5×10⁵個(gè)/ml，吹打混勻，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔取2ml人肺癌細(xì)胞株a549，12h后，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置空白對(duì)照組和10μμkr組，向10μμkr組中加入200μl100μμkr(工作濃度為10μμkr)，輕輕混勻后，置于濃度為5％co2、相對(duì)濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育36h，用15ml離心管分裝成兩個(gè)樣品，按照細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)固定細(xì)胞并配制碘化丙染色緩沖液，12h后，每個(gè)樣品中加入10mlpbs洗兩次，重懸細(xì)胞，每個(gè)樣品加入500μl碘化丙染色緩沖液37℃避光孵育30min，最后用pbs洗兩次；300目篩網(wǎng)過(guò)濾后用bdfacscalibur流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)；結(jié)果如圖2所示，圖2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，施加kr可以上調(diào)cdkn1a引起atp耗竭，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在g0/g1期，從而在體外對(duì)人肺癌細(xì)胞株a549具有很強(qiáng)的毒性和促凋亡作用。當(dāng)用kr處理人肺癌細(xì)胞株a549后導(dǎo)致細(xì)胞周期受阻和(或者)凋亡。