本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種具有廣泛的應(yīng)用的適用于多種克隆策略并具有表達(dá)功能的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

基因克隆是分子生物學(xué)的核心技術(shù)，是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)?？寺》椒煞譃閮深?lèi)：連接酶依賴(lài)性克隆和連接酶非依賴(lài)性克隆。其中，連接酶依賴(lài)性克隆方法主要有三種，包括：粘性末端連接、平末端連接和ta克隆。近些年，各種連接酶非依賴(lài)性克隆方法也得到快速發(fā)展，比如：gateway、lic、user、slic、pipe、cpec、oec、fastcloning、slice和重組酶克隆等技術(shù)（yaos,hartdj,any.recentadvancesinuniversaltacloningmethodsforuseinfunctionstudies.proteinengdessel.2016;1-6.）。盡管連接酶非依賴(lài)性克隆方法有很多成功的應(yīng)用實(shí)例，但是仍然不能完全替代連接酶依賴(lài)性克隆方法成為主要的克隆策略。

連接酶依賴(lài)性克隆中效率最高的是粘性末端連接，該方法也是目前使用最為廣泛的分子克隆策略。但在某些情況下，該方法無(wú)法獲取合適的限制性酶切位點(diǎn)，而這無(wú)疑增加了克隆的難度。相對(duì)而言，平末端產(chǎn)物比較容易獲得（比如通過(guò)酶切或者pcr獲得），兩條具有平末端的dna序列可以通過(guò)連接酶連接起來(lái)。平末端連接也是一種有效的連接方式，但是其連接效率比粘性末端連接要低。ta克隆技術(shù)（tacloning）利用taq聚合酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，可在pcr產(chǎn)物的3'端加上一個(gè)非模板依賴(lài)堿基“a”。而ta克隆載體（即t載體）的3'端有一個(gè)凸出的“t”，可以與上述pcr產(chǎn)物的3'-“a”互補(bǔ)配對(duì)，實(shí)現(xiàn)ta克隆。ta克隆是目前克隆pcr產(chǎn)物最簡(jiǎn)便、快捷的方法之一。該方法不需要合適的酶切位點(diǎn)，可用于克隆未知序列的dna片段，并且具有令人滿意的克隆效率。目前，用于ta克隆的載體（也就是t載體）的制備方法常見(jiàn)的有兩種。第一種方法是利用taq酶不依賴(lài)模板的末端轉(zhuǎn)移酶活性，將單個(gè)脫氧胸腺核苷酸（dttp）添加到線狀載體3'端（marchukd,drummm,saulinoa,collinsfs.constructionoft-vectors,arapidandgeneralsystemfordirectcloningofunmodifiedpcrproducts.nucleicacidsres.1991;19(5):1154.）。第二種方法是在質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)中引入特定的酶切位點(diǎn)，用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生3'端具有單個(gè)t突出的線性t載體。前一種方法在制備t載體時(shí)，會(huì)出現(xiàn)加尾效率較低和加尾過(guò)程中線性質(zhì)粒兩端的序列有時(shí)會(huì)被部分刪除等問(wèn)題（shumans.novelapproachtomolecularcloningandpolynucleotidesynthesisusingvacciniadnatopoisomerase.jbiolchem.1994dec23;269(51):32678-32684.）。與第一種方法相比，第二種方法更高效、更快捷并且更穩(wěn)定。

在連接酶非依賴(lài)性克隆策略中，基于重組酶的克隆方法是最近興起的，也是目前應(yīng)用最為廣泛的一種方法之一。采用該方法，插入片段和載體的分子末端僅需要15-20bp的重疊區(qū)，即可在重組酶的作用下發(fā)生體外同源重組，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)分子克隆。因此，采用重組酶克隆不需要尋找合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，不需要連接酶的作用，就可以實(shí)現(xiàn)高效的定向克隆。目前，市場(chǎng)上已經(jīng)有很多商業(yè)化試劑盒可用于基于重組酶的分子克隆。

盡管上述克隆方法都有很多成功的例子，但是無(wú)論使用哪種方法，在載體制備和克隆過(guò)程中都存在潛在的問(wèn)題：

1）現(xiàn)有的載體一般只適用于一種或者少數(shù)幾種克隆策略，使得在克隆方法的選擇上缺乏靈活性。2）在現(xiàn)有的克隆方法中，在載體的制備過(guò)程中，部分酶切的前載體混雜在載體中，會(huì)導(dǎo)致非重組轉(zhuǎn)化子的本底過(guò)高（harrisonj,molloypl,clarksj.directcloningofpolymerasechainreactionproductsinanxcmit-vector.analbiochem.1994;216(1):235-236.）。而在制備載體的過(guò)程中，雖然可以通過(guò)電泳和膠回收的方法幫助去除這些前載體污染，但是效果往往不夠理想，并且顯著增加了工作量。3）很多載體只適用于克隆，而實(shí)現(xiàn)插入基因的表達(dá)和純化則需要亞克隆到表達(dá)載體上，這無(wú)疑增加了工作量。4）目前絕大多數(shù)克隆載體的大小都在3kb甚至5kb以上。通常情況下，大片段的克隆效率較低。

綜上所述，現(xiàn)急需一種具有廣泛的應(yīng)用前景、適用于多種克隆策略并具有表達(dá)功能的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有廣泛的應(yīng)用前景、適用于多種克隆策略并具有表達(dá)功能的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種用于多種克隆策略并具有表達(dá)功能的質(zhì)粒載體，載體包括啟動(dòng)子和終止子，載體為閉合環(huán)狀雙鏈dna，含有兩個(gè)能夠識(shí)別多種克隆策略的多克隆位點(diǎn)區(qū)，兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)之間為毒性蛋白標(biāo)記ccdb基因；其中，所述多克隆位點(diǎn)區(qū)之一（mcs-1）中的位點(diǎn)為bamhi、spei、stui、sali和ahdi位點(diǎn)；另一多克隆位點(diǎn)區(qū)（mcs-2）中位點(diǎn)為sali、ahdi、stui、ncoi、saci和psti位點(diǎn)。

所述載體還包括抗性基因序列、pmb1復(fù)制子和his-tag編碼序列。

所述啟動(dòng)子為t7啟動(dòng)子，終止子為t7終止子。

所述載體為seqidno:1中所示的堿基序列；載體中所示的dna功能區(qū)：特殊設(shè)計(jì)的多克隆位點(diǎn)區(qū)的stui位點(diǎn)用于制備平末端載體，進(jìn)行平末端克隆；ahdi位點(diǎn)用于制備t載體，進(jìn)行ta克??；bamhi、spei、sali、ncoi、saci和psti位點(diǎn)用于制備粘性末端載體，進(jìn)行粘性末端克隆；所有多克隆位點(diǎn)區(qū)的位點(diǎn)都可以用于制備線性片段，進(jìn)行重組酶克??；t7promoter和t7terminator使該質(zhì)粒具有蛋白表達(dá)功能；his-tag區(qū)使得表達(dá)后的蛋白能被鎳柱純化，而tev位點(diǎn)則可以將純化蛋白中的組氨酸尾巴從蛋白中切掉；ccdb基因序列編碼毒性蛋白，作為克隆過(guò)程的負(fù)篩選標(biāo)記，確?？寺](méi)有假陽(yáng)性。

一種用于多種克隆策略并具有表達(dá)功能的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，

1）以質(zhì)粒pyum6002為模板，bamhi-t-for和psti-t-rev為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物待用；bamhi-t-for：5’-tcgcggatcccccctgaaaatacaaattctcggtagttgg-3’和psti-t-rev：5’-tcatctgcagttggctgctgccaccgctgagcaataac-3’；

2）以質(zhì)粒phiskan5為模板，ccdb-for和ccdb-rev為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物待用；ccdb-for:5’-cgcggatccactagtaggcctgtcgacggtcagtccggcttactaaaagccagataacagtatgcg-3’和ccdb-rev:5’-catctgcaggagctcccatggaggcctgacggtcagtcgactggctgtgtataagggagcctgac-3’；

3）將步驟1）和2）獲得兩個(gè)pcr產(chǎn)物經(jīng)pcr純化后，同時(shí)用bamhi和psti雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠,回收酶切產(chǎn)物；

4）將步驟3）得到的兩個(gè)片段于連接體系內(nèi)在室溫下進(jìn)行連接，而后轉(zhuǎn)化db3.1菌株，再經(jīng)抗性篩選即得質(zhì)粒載體pany1。

所述連接體系為含175ut4dna連接酶（takara），1×連接buffer，約30ng酶切產(chǎn)物（步驟3）得到的兩個(gè)片段）。

與現(xiàn)有的克隆和表達(dá)質(zhì)粒相比，pany1具有以下顯著優(yōu)勢(shì)：

1）國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的載體一般只適用于一種或者少數(shù)幾種克隆策略，使得在克隆方法的選擇上缺乏靈活性。pany1由于該載體具有特別設(shè)計(jì)的多克隆位點(diǎn)區(qū)，可以同時(shí)滿足平末端，粘性末端連接，ta克隆和重組酶克隆的需要。

2）在國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的克隆方法中，在載體的制備過(guò)程中，部分酶切的前載體混雜在載體中，會(huì)導(dǎo)致非重組轉(zhuǎn)化子的本底過(guò)高。而在制備載體的過(guò)程中，雖然可以通過(guò)電泳和膠回收的方法幫助去除這些前載體污染，但是效果往往不夠理想，并且顯著增加了工作量。而pany1在多克隆位點(diǎn)間隔區(qū)引入了毒蛋白基因ccdb。這樣，在載體制備過(guò)程中不需要膠回收等復(fù)雜步驟，就可以徹底清除前載體污染，實(shí)現(xiàn)零背景克隆。

3）目前國(guó)內(nèi)外多數(shù)克隆載體只適用于克隆，而實(shí)現(xiàn)插入基因的表達(dá)則需要亞克隆到表達(dá)載體上，這無(wú)疑增加了工作量。因此，既有克隆功能，又具有表達(dá)功能的載體將具有顯著的優(yōu)勢(shì)。而pany1包含本實(shí)驗(yàn)室自主合成的蛋白表達(dá)原件和組氨酸標(biāo)簽his-tag，因此既可以進(jìn)行分子克隆，又可以對(duì)克隆的片段進(jìn)行表達(dá)和純化。

4）目前國(guó)內(nèi)外絕大多數(shù)克隆載體的大小都在3kb甚至5kb以上。通常情況下，大片段的克隆效率較低。而pany1的載體部分小于2kb，使得該載體在克隆的過(guò)程中效率顯著優(yōu)于現(xiàn)在的克隆載體。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1質(zhì)粒圖譜及其功能區(qū)示意圖，其中a為pany1質(zhì)粒的圖譜；b為pany1質(zhì)粒的功能區(qū)；其中histag：組氨酸尾巴；t7promotor：t7啟動(dòng)子；pmb1replicon：大腸桿菌pmb1型復(fù)制子；kana：卡那霉素抗性蛋白；t7terminator：t7終止子；mcs-1：多克隆位點(diǎn)1；mcs2：多克隆位點(diǎn)2；tev：tev酶切位點(diǎn)；ccdb：編碼ccdb毒蛋白的基因序列，ccdb蛋白通過(guò)干擾大腸桿菌的dna促旋酶，抑制大多數(shù)大腸桿菌（如jm109）的生長(zhǎng)增殖，但是不抑制某些特殊大腸桿菌菌株（如db3.1）的生長(zhǎng)繁殖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1雙酶切（bamhi，psti雙酶切）電泳圖（m：dnaladder；1-5：pany1雙酶切）。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1的ahdi酶切電泳圖（m：dnaladder；1：pany1酶切）。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1-xynii雙酶切（bamhi，ecori雙酶切）電泳圖（m：dnaladder；1：pany1-xynii雙酶切）。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1-xynii物理圖譜，其中histag：組氨酸尾巴；t7promotor：t7啟動(dòng)子；pmb1replicon：大腸桿菌pmb1型復(fù)制子；kanamycinxnsii：卡那霉素抗性蛋白；t7terminator：t7終止子；xyn-ii：編碼木聚糖酶基因序列。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1-as雙酶切（bamhi，sali雙酶切）電泳圖（m：dnaladder；1-4：pany1-as雙酶切）。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1-as物理圖譜，其中histag：組氨酸尾巴；t7promotor：t7啟動(dòng)子；pmb1replicon：大腸桿菌pmb1型復(fù)制子；kanamycinxnsii：卡那霉素抗性蛋白；t7terminator：t7終止子；mcs-1：多克隆位點(diǎn)1；iftase：編碼菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1-xynii-flat雙酶切（bamhi，ecori雙酶切）電泳圖（m：dnaladder；1-3：pany1-xynii-flat雙酶切）。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1-xynii-flat物理圖譜，其中histag：組氨酸尾巴；t7promotor：t7啟動(dòng)子；pmb1replicon：大腸桿菌pmb1型復(fù)制子；kanamycinxnsii：卡那霉素抗性蛋白；t7terminator：t7終止子；xyn-ii：編碼木聚糖酶基因序列。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1-pflama雙酶切（bamhi，psti雙酶切）電泳圖（m：dnaladder；1-3：pany1-pflama雙酶切）。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1-pflama物理圖譜，其中histag：組氨酸尾巴；t7promotor：t7啟動(dòng)子；pmb1replicon：大腸桿菌pmb1型復(fù)制子；kanamycinxnsii：卡那霉素抗性蛋白；t7terminator：t7終止子；pf-lama：編碼昆布多糖酶基因序列。

圖12為本發(fā)明實(shí)施例提供的pany1質(zhì)粒表達(dá)功能驗(yàn)證圖，a.酶活性檢測(cè)圖（1：空白；2：pany1-xynii表達(dá)粗酶液；:3：pany1-xynii表達(dá)純酶液；4：petm11-xynii表達(dá)粗酶液；5：petm11-xynii表達(dá)純酶液）；b.pany1-xyniisds-page電泳圖（m：proteinladder；1：pany1-xynii表達(dá)粗酶液；2：pany1-xynii表達(dá)純酶液；3：petm11-xynii表達(dá)粗酶液；4：petm11-xynii表達(dá)純酶液）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說(shuō)明。

目前通用的質(zhì)粒載體存在一些缺點(diǎn)，比如在克隆策略的選擇方面不夠靈活多樣，或者克隆過(guò)程中無(wú)法保證無(wú)假陽(yáng)性克隆，或者不能兼具克隆和表達(dá)功能。與常用質(zhì)粒載體相比，本發(fā)明質(zhì)粒同時(shí)兼具以下顯著的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：1）克隆策略更多樣：可用于ta克隆、粘性末端克隆、平末端克隆、重組酶克隆，而國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有質(zhì)粒都不能兼具這些特點(diǎn)；2）本質(zhì)粒載體部分dna片段長(zhǎng)度小于2000bp，具有非常高的克隆效率和成功率，也是已知目前最小的表達(dá)型質(zhì)粒之一；3）該質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)之間插入了ccdb毒蛋白編碼基因，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)假陽(yáng)性克??；4）該質(zhì)粒既有目的基因克隆的功能，又能實(shí)現(xiàn)iptg誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，同時(shí)還能利用鎳柱對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。在應(yīng)用實(shí)例中，本發(fā)明質(zhì)粒載體在分子克隆、蛋白表達(dá)和純化方面的功能得到了驗(yàn)證。本發(fā)明質(zhì)粒載體既可以應(yīng)用各種不同的克隆要求，而且可方便高效地進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化，而不需要亞克隆步驟，因此本發(fā)明質(zhì)粒載體因其更方便、高效，將在基因工程領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

實(shí)施例1

質(zhì)粒載體pany1的獲得：

1）以質(zhì)粒pyum6002（any,meressep,maspj,hartdj.coesprit:alibrary-basedconstructscreeningmethodforidentificationandexpressionofsolubleproteincomplexes.plosone.2011;6(2):e16261.）為模板，bamhi-t-for和psti-t-rev為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物待用；bamhi-t-for：5’-tcgcggatcccccctgaaaatacaaattctcggtagttgg-3’和psti-t-rev：5’-tcatctgcagttggctgctgccaccgctgagcaataac-3’；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：20μl反應(yīng)體系中含10xpfubuffer2μl，引物各10μmol/l，2upfu酶，0.2mmol/ldntps，模板2ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，4min）×25，72℃最后延伸10min。該pcr產(chǎn)物為構(gòu)建質(zhì)粒pany1的載體部分。

2）以質(zhì)粒phiskan5（freulerf,stettlert,meyerhoferm,lederl,mayrlm.developmentofanovelgateway-basedvectorsystemforefficient,multiparallelproteinexpressioninescherichiacoli.proteinexprpurif.2008jun;59(2):232-241.）為模板，ccdb-for和ccdb-rev為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物待用；ccdb-for:5’-cgcggatccactagtaggcctgtcgacggtcagtccggcttactaaaagccagataacagtatgcg-3’和ccdb-rev:5’-catctgcaggagctcccatggaggcctgacggtcagtcgactggctgtgtataagggagcctgac-3’），進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：20μl反應(yīng)體系中含10xpfubuffer2μl，引物各10μmol/l，2upfu酶，0.2mmol/ldntps，模板2ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。該pcr片段含有ccdb基因序列及其兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)區(qū)。多克隆位點(diǎn)功能區(qū)如圖1b所示。；

3）將步驟1）和2）獲得兩個(gè)pcr產(chǎn)物經(jīng)pcr純化后，同時(shí)用bamhi和psti雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠,回收酶切產(chǎn)物（兩個(gè)大片段）；

4）將步驟3）得到的兩個(gè)片段于連接體系內(nèi)在室溫下進(jìn)行連接16小時(shí)，而后轉(zhuǎn)化db3.1菌株，經(jīng)kana抗性和雙酶切（bamhi和psti）驗(yàn)證篩選（電泳圖如圖2所示）得到陽(yáng)性菌落，陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后命名為pany1。該質(zhì)粒具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。

所述連接體系為含175ut4dna連接酶（takara），1×連接buffer（takaraco.），約30ng酶切產(chǎn)物（步驟3）得到的兩個(gè)片段）。

seqidno:1pany1(2663bp)：

actagtaggcctgtcgacggtcagtccggcttactaaaagccagataacagtatgcgtatttgcgcgctgatttttgcggtataagaatatatactgatatgtatacccgaagtatgtcaaaaagaggtatgctatgaagcagcgtattacagtgacagttgacagcgacagctatcagttgctcaaggcatatatgatgtcaatatctccggtctggtaagcacaaccatgcagaatgaagcccgtcgtctgcgtgccgaacgctggaaagcggaaaatcaggaagggatggctgaggtcgcccggtttattgaaatgaacggctcttttgctgacgagaacaggggctggtgaaatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggctcccttatacacagccagtcgactgaccgtcaggcctccatgggagctcctgcagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaacaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgggccaccatcatcaccaccatgattatgatattccaactaccgagaatttgtattttcaggggggatcc

實(shí)施例2、上述實(shí)例獲得pany1用于ta克隆的功能驗(yàn)證

1）用ahdi酶切上述獲得質(zhì)粒pany1（電泳圖如圖3所示），酶切反應(yīng)體系如下：120μl酶切體系中包含10uahdi內(nèi)切酶（newenglandbiolabs），1×buffer，大約4μg質(zhì)粒。37℃酶切6小時(shí)后，經(jīng)過(guò)酶切后的大片段即是t載體，命名為pany1-t，不需膠回收。

2）以質(zhì)粒pjexpress401-xynii（wanq,kovalevskya,zhangq,hamilton-brehms,uptonr,weisskl,mustyakimovm,grahamd,coatesl,langanp.heterologousexpression,purification,crystallizationandpreliminaryx-rayanalysisoftrichodermareeseixylanaseiiandfourvariants.actacrystallogrsectfstructbiolcrystcommun.2013;69(pt3):320-323.）為模板，用xyn2-for2（5’-acgatccaaccaggcacgggctacaac-3’）和xyn2-rev2（5’-ttagctaacggtgatgcttgcagaaccgctg-3’）引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：20μl反應(yīng)體系中含10×pcrbuffer（takara）2μl，引物各10μmol/l，2utaq酶，0.2mmol/ldntps，模板1ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。將pcr產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收600bp左右的片段。

3）將上述步驟2得到的片段與pany1-t（即t載體）進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系如下：20μl連接體系中含175ut4dna連接酶（takara），1×連接buffer，約30ngpcr和酶切產(chǎn)物。室溫連接16小時(shí)。將連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化bl21（de3）菌株后，挑經(jīng)kana抗性篩選得到的菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行bamhi和ecori雙酶切驗(yàn)證（電泳圖如圖4所示），取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序鑒定，將測(cè)序鑒定ta連接成功的質(zhì)粒命名為pany1-xynii（物理圖譜如圖5所示），該質(zhì)粒具有序列表中序列2核苷酸序列。結(jié)果表明，pany1可以有效的進(jìn)行t載體制備，并且用于ta克隆。

seqidno:2pany1-xynii(2558bp)：

actagtaggcctgtcgacggtacgatccaaccaggcacgggctacaacaacggctatttctactcttactggaacgacggtcatggtggtgttacctatactaatggccctggtggccagttcagcgtcaattggagcaattccggcaacttcgttggtggtaaaggctggcagccgggcaccaagaataaggtgattaactttagcggttcctacaatccgaatggcaacagctacctgagcgtgtacggctggagccgtaatccgctgattgaatactatatcgtggagaactttggtacgtacaacccgtccaccggtgccaccaaactgggtgaggttactagcgatggtagcgtgtatgatatctatcgcacccagcgtgttaatcaaccgtcgattattggtacggcgaccttttatcaatactggagcgtgcgtcgcaaccaccgttctagcggcagcgtcaacaccgcaaaccactttaatgcgtgggctcagcagggtttgaccctgggtacgatggactaccaaatcgtcgcggtcgaaggttatttcagcagcggttctgcaagcatcaccgttagctaaaccgtcaggcctccatgggagctcctgcagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaacaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgggccaccatcatcaccaccatgattatgatattccaactaccgagaatttgtattttcaggggggatcc

實(shí)施例3、對(duì)上述實(shí)例獲得pany1用于粘性末端克隆的功能驗(yàn)證

1）分別用bamhi和sali對(duì)人工合成的arthrobactersp.的一段含有編碼菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶（iftase）基因片段進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系如下：162μl酶切體系中包含3μlbamhi和3μlsali（takara），1×buffer，大約4μg質(zhì)粒，去離子水補(bǔ)齊。37℃酶切6小時(shí)后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收1200bp左右的片段。

pany1用上述相同的酶切體系進(jìn)行酶切，并用pcr純化試劑盒進(jìn)行純化。

2）建立如下的連接體系：20μl連接體系中含175ut4dna連接酶（takara），1×連接buffer，約30ng酶切產(chǎn)物。室溫連接16小時(shí)。將連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化bl21（de3）菌株，涂布在含有kana的平板上。對(duì)于陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（bamhi和sali）驗(yàn)證（電泳圖如圖6所示）。經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pany1-as（物理圖譜如圖7所示）。該質(zhì)粒具有序列表中序列3核苷酸序列。結(jié)果表明，pany1可以有效的進(jìn)行粘性末端克隆。

seqidno:3pany1-as(3193bp)：

ggatccgcggactctaccgaagaaaccaaccgttacgacgttacctcttggaaaatcaaaggtcgtccggaagttaccgcgcagatcgacatcggtgcggttatcaacgacatcatcgcggacgttaaaaaacgtcagaccaccgcggacgcgcgtccgggtgcggttatcaccatcccgccgggtgactacgacctgcgtacccaggttgttgttgacgtttcttacctgaccatcgcgggtttcggtcacggtttcttctctcgttctatcaaagacaacgttgacacctctggttggctggaactgcaaccgggtggttctcacatccgtgttctgaccccgtctaccgcgccgcaggcgttcctggttcgtcgtgcgggttctccgcgtctgtctggtgttgttttccgtgacttctgcctggacggtgttgaatttccgccggacggtaactcttaccgtaacggtcgtaccggtatcgaagttgcgtctgacaacgactctttccacatcaccggtatgggtttcgtttacctggaacacgcgctgatcgttcgtggtgcggacgcgctgcgtgttcacgacaacatgatcgcggaatgcggtaactgcgttgaactgaccggtgcgggtcaggcgaccatcgtttctaacaacctgatgggtgcgggtccggaaggtgcgaccctgctggcggaaaaccacgaaggtctgctgatcaccggtaacaacctgttcccgcgtggtcgttctctggttgaactgaccggttgcaaccgttgctctgttacctctaaccgtttccagggtttcttcccgggtatcatgcgtctgatcaacaactgcaaagaaaacctgatcaccggtaaccacttccgtcgtggtatggaaggtttcccgccgttcctgggcacctctaacggtctggacgacctgtacggtgttgttcacatcgcgggtgacaacaacttcttcgcgaacaacctgatcgcgtacgacgtttctccggaccgtatcgttccgccgaacgcgcagccgaccatgatcctggttgcgggtggtgactctaacgttgttgcgaccaaccacgttgtttctaacgttgaaacccagcacgttgttctggacgcgtctaccgttcgttctaaagttctggactctggtccggcgtctaaagttacctcttactctgcggacaccgcgatccgtccgaccccgtaggtcgactgaccgtcaggcctccatgggagctcctgcagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaacaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgggccaccatcatcaccaccatgattatgatattccaactaccgagaatttgtattttcagggg

實(shí)施例4、pany1用于平末端克隆的功能驗(yàn)證

1）以質(zhì)粒pjexpress401-xynii（來(lái)源同實(shí)施例2）為模板，用xyn2-for2和xyn2-rev2引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：20μl反應(yīng)體系中含10xpfubuffer2μl，引物各10μmol/l，2upfu酶，0.2mmol/ldntps，模板1ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。將pcr產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收600bp左右的片段。

2）用stui酶切上述pany1，酶切反應(yīng)體系如下：30μl酶切體系中包含1μlstui（takara），1×buffer，大約1μg質(zhì)粒（pany1），去離子水補(bǔ)齊。將酶切產(chǎn)物用pcr純化試劑盒進(jìn)行純化。

3）建立如下的連接體系：20μl連接體系中含700ut4dna連接酶（takara），1×連接buffer，1×quickcutbuffer，1μlstui（takara），約30ng上述兩個(gè)dna片段。室溫連接16小時(shí)。將連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化bl21（de3）菌株，涂布在含有kana的平板上。對(duì)于陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（bamhi和ecori）鑒定（電泳圖如圖8所示）。經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pany1-xynii-flat（物理圖譜如圖9所示）具有序列表中序列4核苷酸序列。結(jié)果表明，pany1可以有效的進(jìn)行平末端克隆。

seqidno:4pany1-xynii-flat(2537bp)：

actagtaggacgatccaaccaggcacgggctacaacaacggctatttctactcttactggaacgacggtcatggtggtgttacctatactaatggccctggtggccagttcagcgtcaattggagcaattccggcaacttcgttggtggtaaaggctggcagccgggcaccaagaataaggtgattaactttagcggttcctacaatccgaatggcaacagctacctgagcgtgtacggctggagccgtaatccgctgattgaatactatatcgtggagaactttggtacgtacaacccgtccaccggtgccaccaaactgggtgaggttactagcgatggtagcgtgtatgatatctatcgcacccagcgtgttaatcaaccgtcgattattggtacggcgaccttttatcaatactggagcgtgcgtcgcaaccaccgttctagcggcagcgtcaacaccgcaaaccactttaatgcgtgggctcagcagggtttgaccctgggtacgatggactaccaaatcgtcgcggtcgaaggttatttcagcagcggttctgcaagcatcaccgttagctaacctccatgggagctcctgcagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaacaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgggccaccatcatcaccaccatgattatgatattccaactaccgagaatttgtattttcaggggggatcc

實(shí)施例5、pany1用于重組酶克隆的功能驗(yàn)證

1）將pany1轉(zhuǎn)化大腸桿菌db3.1菌株，并用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。用bamhi和saci對(duì)pany1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并將酶切產(chǎn)物用pcr純化試劑盒進(jìn)行純化。

2）用ecori和sali對(duì)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pet9d-pflama（ilaria,fiorilloa,angelaccios,florior,chiaralucer,vanderoostj,consalviv.crystalstructureofafamily16endoglucanasefromthehyperthermophilepyrococcusfuriosus--structuralbasisofsubstraterecognition.febsj.2009;276(4):1048-1058.）質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收1700bp左右的片段。以上述膠回收片段為模板，用pflama-bamhi-czm（5’-tttgtattttcaggggggatccgtccctgaagtgatagaaatagatggaaaacagtgg-3’）和pflama-saci-czm（5’-gcagcagccaactgcaggagctctcaaccactaacgaatgagtaaacccttacataatc-3’）引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：20μl反應(yīng)體系中含10xpfubuffer2μl，引物各10μmol/l，2upfu酶，0.2mmol/ldntps，模板1ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。將pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化。

3）按照一步法快速克隆試劑盒（翊圣生物）說(shuō)明進(jìn)行克隆。將重組產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化bl21（de3）菌株，涂布在含有kana的平板上。對(duì)于陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（bamhi和psti）鑒定（電泳圖如圖10所示），篩選得到陽(yáng)性菌落。從陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pany1-pflama（物理圖譜如圖11所示）。該質(zhì)粒具有序列表中序列5核苷酸序列。結(jié)果表明，pany1可以有效的進(jìn)行重組酶克隆。

seqidno:5pany1-pflama(2741bp)：

gtccctgaagtgatagaaatagatggaaaacagtggagacttatttggcacgatgagtttgaaggttccgaagtaaataaagaatactggacatttgagaagggaaatggaatagcttatggaatcccgggatgggggaatggagagcttgaatactacacggaaaacaacacctatattgtaaatggcacccttgtcattgaggccagaaaagaaataattactgatcctaacgaaggaacgtttctctacacttcatcaagacttaagactgaaggtaaggtagaatttagccctccagtagttgttgaggctagaataaagcttccaaaaggtaaaggtttatggcctgcattctggatgttggggagcaacataagggaagtaggctggccaaattgtggagaaatagacataatggagttccttggccatgagccacggacaattcacggaactgttcatggcccaggttactcgggaagtaaaggaattactagggcctatacactccctgaaggtgttccagactttacagaagacttccatgtatttggaatagtttggtatccggataaaataaagtggtacgttgatggaactttttatcatgaggttacaaaagaacaagtggaggctatgggctatgagtgggtcttcgataagcccttctatataatccttaatcttgcagtgggtggttattggccaggaaaccccgatgctacaactccatttccagcaaagatggtggtggattatgtaagggtttactcattcgttagtggttgagagctcctgcagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaacaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgggccaccatcatcaccaccatgattatgatattccaactaccgagaatttgtattttcaggggggatcc

實(shí)施例6、pany1用于蛋白表達(dá)和蛋白純化的功能驗(yàn)證

1）將上述實(shí)施例2中所獲得的pany1-xynii轉(zhuǎn)化bl21（de3）感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行iptg誘導(dǎo)表達(dá)，提取木聚糖酶xynii的粗酶液。作為對(duì)照，將xynii克隆于通用載體petm11的重組質(zhì)粒petm11-xynii也轉(zhuǎn)化bl21（de3），并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和酶的提取。

2）將步驟1）得到的兩份粗酶液進(jìn)行純化，根據(jù)1mlhisgravitrapni-nta蛋白純化試劑盒（starbio）進(jìn)行操作。

3）將步驟1）和2）得到的兩份粗酶液和兩份純化后的酶液以木聚糖為底物進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程如下列方程所示：

通過(guò)dns法測(cè)定酶催化反應(yīng)的結(jié)果，如圖12a所示。并同時(shí)進(jìn)行sds-page電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖12b所示。結(jié)果表明，pany1可以有效的進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和純化。其蛋白表達(dá)水平優(yōu)于petm11。同時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物還能進(jìn)行有效的純化。