本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2013年6月17日、申請(qǐng)?zhí)枮?01310239097.7、發(fā)明名稱為“喜樹堿類化合物及其制備和用途”的中國發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及一類新的具有抗腫瘤活性的喜樹堿類化合物，其藥物組合物及其用途。

背景技術(shù)：

喜樹堿(camptothecin，cpt，iupac命名：(s)-4-乙基-4-羥基-1h-吡喃[3’4’:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4h,12h)-二酮)是在1966年首先由wall等人[j.am.chem.soc.,1966,88(16),3888-990]從中國珙桐科植物喜樹(camptothecaacuminate)中提取出來的一種生物堿。試驗(yàn)表明，它對(duì)白血病和許多實(shí)體瘤具有抗腫瘤活性，是一種天然的細(xì)胞毒性化合物。到20世紀(jì)70年代，已經(jīng)對(duì)cpt進(jìn)行了i期和ii期臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)盡管其具有抗腫瘤活性，但存在著許多的副作用。副作用包括骨髓抑制、胃腸道毒性、出血性膀胱炎、脫發(fā)、腹瀉、惡心、嘔吐等。

為了得到活性高、毒性小的喜樹堿衍生物，人們進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化，通過半合成及全合成方法合成了一系列喜樹堿衍生物。1994年，美國fda批準(zhǔn)喜樹堿類藥物伊立替康(irinotecan，cpt-11)上市，用于治療結(jié)直腸癌。1996年，拓?fù)涮婵?topotecan)獲準(zhǔn)上市用于治療卵巢癌，美國fda又于1999年批準(zhǔn)其作為小細(xì)胞肺癌(sclc)的二線治療藥物。目前尚有十余種喜樹堿類藥物處于臨床試驗(yàn)階段。

喜樹堿是繼紫杉醇后的第二個(gè)從植物中提取的抗癌藥物。由于喜樹堿類藥物療效顯著、抗腫瘤譜廣、與其它抗腫瘤藥物無交叉耐藥性，因此自其上市以來，已成為臨床上使用最多的抗腫瘤藥物之一。但現(xiàn)有的喜樹堿類化合物依然存在明顯的副作用。因此提高喜樹堿類衍生物的活性，降低其毒性一直是這類化合物研究的重點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥：

其中：

x為cr3或n；

y為cr4或n；

z為cr5或n；

x、y、z中至少有一個(gè)為n；

r1、r2以及r3、r4、r5各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、單(烷基)氨基、二(烷基)氨基、環(huán)烷基氨基、巰基、烷硫基或氰基；

或者

r3和r4二者或r4和r5二者或r5和r1二者與它們所連接的碳原子共同組成五至七元非芳香環(huán)。

另一方面，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥：

其中：

x為cr3；

y為cr4；

z為cr5；

r3和r4二者或r4和r5二者或r5和r1二者與它們所連接的碳原子共同組成含有1個(gè)選自氮、氧或硫的雜原子的五至七元非芳香環(huán)，且r1、r2、r3、r4、r5中的其余基團(tuán)各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、單(烷基)氨基、二(烷基)氨基、環(huán)烷基氨基、巰基、烷硫基或氰基；或者

r1、r2、r3均為氫，且r4、r5互相不同且各自獨(dú)立地選自鹵素、羥基或烷氧基；或者

r1、r3均為氫，r2為氨基或烷基，且r4、r5各自獨(dú)立地選自鹵素、羥基、烷氧基、氨基、單(烷基)氨基或二(烷基)氨基。

另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥，以及藥學(xué)上可接受的載體。

另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥或者本發(fā)明的藥物組合物，其用于預(yù)防和/或治療腫瘤。

另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥或者本發(fā)明的藥物組合物在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。

另一方面，本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物、特別是人的腫瘤的方法，所述方法包括對(duì)有需要的哺乳動(dòng)物、特別是人給予治療有效量的本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥或者本發(fā)明的藥物組合物。

具體實(shí)施方式

定義

除非另有定義，否則本文所有科技術(shù)語具有的涵義與權(quán)利要求主題所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的涵義相同。除非另有說明，本文全文引用的所有專利、專利申請(qǐng)、公開材料通過引用方式整體并入本文。

應(yīng)理解，上述簡(jiǎn)述和下文的詳述為示例性且僅用于解釋，而不對(duì)本發(fā)明主題作任何限制。在本申請(qǐng)中，除非另有具體說明，否則使用單數(shù)時(shí)也包括復(fù)數(shù)。還應(yīng)注意，除非另有說明，否則所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，所用術(shù)語“包括”以及其它形式，例如“包含”、“含”和“含有”并非限制性。

可在參考文獻(xiàn)(包括careyandsundberg"advancedorganicchemistry,4^thed."vols.a(2000)andb(2001),plenumpress,newyork)中找到對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)術(shù)語的定義。除非另有說明，否則采用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的常規(guī)方法，如質(zhì)譜、nmr、ir和uv/vis光譜法和藥理學(xué)方法。除非提出具體定義，否則本文在分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)以及藥物和藥物化學(xué)的有關(guān)描述中采用的術(shù)語是本領(lǐng)域已知的?？稍诨瘜W(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、制劑和遞送，以及對(duì)患者的治療中使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。例如，可利用廠商對(duì)試劑盒的使用說明，或者按照本領(lǐng)域公知的方式或本發(fā)明的說明來實(shí)施反應(yīng)和進(jìn)行純化。通?？筛鶕?jù)本說明書中引用和討論的多個(gè)概要性和較具體的文獻(xiàn)中的描述，按照本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法實(shí)施上述技術(shù)和方法。在本說明書中，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇基團(tuán)及其取代基以提供穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)部分和化合物。

當(dāng)通過從左向右書寫的常規(guī)化學(xué)式描述取代基時(shí)，該取代基也同樣包括從右向左書寫結(jié)構(gòu)式時(shí)所得到的在化學(xué)上等同的取代基。舉例而言，-ch2o-等同于-och2-。

本文所用的章節(jié)標(biāo)題僅用于組織文章的目的，而不應(yīng)被解釋為對(duì)所述主題的限制。本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)或文獻(xiàn)部分包括但不限于專利、專利申請(qǐng)、文章、書籍、操作手冊(cè)和論文，均通過引用方式整體并入本文。

在本文中定義的某些化學(xué)基團(tuán)前面通過簡(jiǎn)化符號(hào)來表示該基團(tuán)中存在的碳原子總數(shù)。例如，c1-6烷基是指具有總共1至6個(gè)碳原子的如下文所定義的烷基。簡(jiǎn)化符號(hào)中的碳原子總數(shù)不包括可能存在于所述基團(tuán)的取代基中的碳。

除前述以外，當(dāng)用于本申請(qǐng)的說明書及權(quán)利要求書中時(shí)，除非另外特別指明，否則以下術(shù)語具有如下所示的含義。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴或碘。

“羥基”是指-oh基團(tuán)。

“巰基”是指-sh基團(tuán)。

“氧代”是指＝o基團(tuán)。

“氰基”是指-cn。

“氨基”是指-nh2。

在本申請(qǐng)中，作為基團(tuán)或是其它基團(tuán)的一部分(例如用在鹵素取代的烷基等基團(tuán)中)，術(shù)語“烷基”意指僅由碳原子和氫原子組成、不含不飽和鍵、具有例如1至12個(gè)(優(yōu)選為1至8個(gè)，更優(yōu)選為1至6個(gè))碳原子且通過單鍵與分子的其余部分連接的直鏈或支鏈的烴鏈基團(tuán)。烷基的實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、辛基、壬基和癸基等。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語“烷氧基”是指式-ora基團(tuán)，其中ra為如上文所定義的烷基。烷氧基的實(shí)例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語“烷硫基”是指式-sra基團(tuán)，其中ra為如上文所定義的烷基。烷氧基的實(shí)例包括但不限于甲硫基、乙硫基、丙硫基、異丙硫基等。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語“單(烷基)氨基”是指式-nhra基團(tuán)，其中ra為如上文所定義的烷基。單(烷基)氨基的實(shí)例包括但不限于甲氨基、乙氨基、異丙氨基等。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語“二(烷基)氨基”是指式-nrarb基團(tuán)，其中ra和rb各自獨(dú)立地為如上文所定義的烷基。二(烷基)氨基的實(shí)例包括但不限于二甲氨基、二乙氨基、二丙氨基、甲基乙基氨基等。

在本申請(qǐng)中，作為基團(tuán)或是其它基團(tuán)的一部分，術(shù)語“環(huán)烷基”意指僅由碳原子和氫原子組成的穩(wěn)定的非芳香族單環(huán)或多環(huán)烴基，其可包括稠合環(huán)體系、橋環(huán)體系或螺環(huán)體系，具有3至15個(gè)碳原子，優(yōu)選具有3至10個(gè)碳原子，更優(yōu)選具有3至8個(gè)碳原子，且其為飽和或不飽和并可經(jīng)由任何適宜的碳原子通過單鍵與分子的其余部分連接。除非本說明書中另外特別指明，環(huán)烷基中的碳原子可以任選地被氧化。環(huán)烷基的實(shí)例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、1h-茚基、2,3-二氫化茚基、1,2,3,4-四氫-萘基、5,6,7,8-四氫-萘基、8,9-二氫-7h-苯并環(huán)庚烯-6-基、6,7,8,9-四氫-5h-苯并環(huán)庚烯基、5,6,7,8,9,10-六氫-苯并環(huán)辛烯基、芴基、二環(huán)[2.2.1]庚基、7,7-二甲基-二環(huán)[2.2.1]庚基、二環(huán)[2.2.1]庚烯基、二環(huán)[2.2.2]辛基、二環(huán)[3.1.1]庚基、二環(huán)[3.2.1]辛基、二環(huán)[2.2.2]辛烯基、二環(huán)[3.2.1]辛烯基、金剛烷基、八氫-4,7-亞甲基-1h-茚基和八氫-2,5-亞甲基-并環(huán)戊二烯基等。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語“環(huán)烷基氨基”是指式-nhrc基團(tuán)，其中rc為如上文所定義的環(huán)烷基。

在本申請(qǐng)中，作為基團(tuán)或是其它基團(tuán)的一部分，術(shù)語“雜環(huán)基”意指由2至14個(gè)碳原子以及1至6個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子組成的穩(wěn)定的3元至20元非芳香族環(huán)狀基團(tuán)。除非本說明書中另外特別指明，否則雜環(huán)基可以為單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)或更多環(huán)的環(huán)體系，其可包括稠合環(huán)體系、橋環(huán)體系或螺環(huán)體系；其雜環(huán)基中的氮、碳或硫原子可任選地被氧化；氮原子可任選地被季銨化；且雜環(huán)基可為部分或完全飽和。雜環(huán)基可以經(jīng)由碳原子或者雜原子并通過單鍵與分子其余部分連接。在包含稠環(huán)的雜環(huán)基中，一個(gè)或多個(gè)環(huán)可以是下文所定義的芳基或雜芳基，條件是與分子其余部分的連接點(diǎn)為非芳香族環(huán)原子。就本發(fā)明的目的而言，雜環(huán)基優(yōu)選為包含1至3個(gè)選自氮、氧或硫的雜原子的穩(wěn)定的4元至11元非芳香性單環(huán)、雙環(huán)、橋環(huán)或螺環(huán)基團(tuán)，更優(yōu)選為包含1個(gè)選自氮、氧或硫的雜原子的穩(wěn)定的5元至7元非芳香性單環(huán)基團(tuán)。雜環(huán)基的實(shí)例包括但不限于：吡咯烷基、嗎啉基、哌嗪基、高哌嗪基、哌啶基、硫代嗎啉基、2,7-二氮雜-螺[3.5]壬烷-7-基、2-氧雜-6-氮雜-螺[3.3]庚烷-6-基、2,5-二氮雜-雙環(huán)[2.2.1]庚烷-2-基、氮雜環(huán)丁烷基、吡喃基、四氫吡喃基、噻喃基、四氫呋喃基、噁嗪基、二氧環(huán)戊基、四氫異喹啉基、十氫異喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、喹嗪基、噻唑烷基、異噻唑烷基、異噁唑烷基、二氫吲哚基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、吡咯烷基、吡唑烷基、鄰苯二甲酰亞氨基等。

本文單獨(dú)或組合使用的術(shù)語“稠合”是指其兩個(gè)或多個(gè)環(huán)共同具有一個(gè)或多個(gè)鍵的環(huán)結(jié)構(gòu)。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語“非芳香環(huán)”包括上文所定義的環(huán)烷基和雜環(huán)基環(huán)。本申請(qǐng)的非芳香環(huán)可包含不飽和鍵，但該不飽和鍵并不導(dǎo)致該環(huán)產(chǎn)生芳香性。

本文中使用的術(shù)語“芳香性”是指包含一個(gè)或多個(gè)環(huán)的環(huán)部分具有4n+2個(gè)電子的離域化電子共扼體系，其中n為整數(shù)。

在本申請(qǐng)中，“任選的”或“任選地”表示隨后描述的事件或狀況可能發(fā)生也可能不發(fā)生，且該描述同時(shí)包括該事件或狀況發(fā)生和不發(fā)生的情況。例如，“任選地被取代的烷基”表示烷基被取代或未被取代，即該描述同時(shí)包括被取代的烷基與未被取代的烷基。

本文所用術(shù)語“部分”、“結(jié)構(gòu)部分”、“化學(xué)部分”、“基團(tuán)”、“化學(xué)基團(tuán)”是指分子中的特定片段或官能團(tuán)?；瘜W(xué)部分通常被認(rèn)為是嵌入或附加到分子上的化學(xué)實(shí)體。

當(dāng)本發(fā)明的化合物中含有烯雙鍵時(shí)，除非另有說明，否則本發(fā)明的化合物旨在包含e-和z-幾何異構(gòu)體。

“互變異構(gòu)體”是指質(zhì)子從分子的一個(gè)原子轉(zhuǎn)移至相同分子的另一個(gè)原子而形成的異構(gòu)體。本發(fā)明的化合物的所有互變異構(gòu)形式也將包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽和藥學(xué)上可接受的堿加成鹽。

“藥學(xué)上可接受的酸加成鹽”是指能夠保留游離堿的生物有效性而無其它副作用的，與無機(jī)酸或有機(jī)酸所形成的鹽。無機(jī)酸鹽包括但不限于鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等；有機(jī)酸鹽包括但不限于甲酸鹽、乙酸鹽、2,2-二氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、己酸鹽、辛酸鹽、癸酸鹽、十一碳烯酸鹽、乙醇酸鹽、葡糖酸鹽、乳酸鹽、癸二酸鹽、己二酸鹽、戊二酸鹽、丙二酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、油酸鹽、肉桂酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、谷氨酸鹽、焦谷氨酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、水楊酸鹽、4-氨基水楊酸鹽、萘二磺酸鹽等。這些鹽可通過本領(lǐng)域已知的方法制備。

“藥學(xué)上可接受的堿加成鹽”是指能夠保持游離酸的生物有效性而無其它副作用的、與無機(jī)堿或有機(jī)堿所形成的鹽。衍生自無機(jī)堿的鹽包括但不限于鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽等。優(yōu)選的無機(jī)鹽為銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽。衍生自有機(jī)堿的鹽包括但不限于以下的鹽：伯胺類、仲胺類及叔胺類，被取代的胺類，包括天然的被取代胺類、環(huán)狀胺類及堿性離子交換樹脂，例如氨、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二環(huán)己胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚胺樹脂等。優(yōu)選的有機(jī)堿包括異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環(huán)己基胺、膽堿及咖啡因。這些鹽可通過本專業(yè)已知的方法制備。

“多晶型物”是指本發(fā)明的某些化合物在固體狀態(tài)下由于存在兩種或兩種以上不同分子排列而產(chǎn)生的不同固體結(jié)晶相。本發(fā)明的某些化合物可以存在一種以上的晶型，本發(fā)明旨在包括各種晶型及其混合物。

通常，結(jié)晶化作用會(huì)產(chǎn)生本發(fā)明化合物的溶劑化物。本發(fā)明中使用的術(shù)語“溶劑化物”是指包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明化合物分子與一個(gè)或多個(gè)溶劑分子的聚集體。溶劑可以是水，該情況下的溶劑化物為水合物。或者，溶劑可以是有機(jī)溶劑。因此，本發(fā)明的化合物可以以水合物存在，包括單水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及相應(yīng)的溶劑化形式。本發(fā)明化合物可形成真實(shí)的溶劑化物，但在某些情況下，也可以僅保留不定的水或者水加上部分不定溶劑的混合物。本發(fā)明的化合物可以在溶劑中反應(yīng)或者從溶劑中沉淀析出或結(jié)晶出來。本發(fā)明化合物的溶劑化物也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還包括上述化合物的前藥。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“前藥”表示可在生理學(xué)條件下或通過溶劑分解而被轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的生物活性化合物的化合物。因此，術(shù)語“前藥”是指本發(fā)明的化合物的藥學(xué)上可接受的代謝前體。當(dāng)被給予有需要的個(gè)體時(shí)，前藥可以不具有活性，但在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的活性化合物。前藥通常在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化，而產(chǎn)生本發(fā)明的母體化合物，例如通過在血液中水解來實(shí)現(xiàn)。前藥化合物通常在哺乳動(dòng)物生物體內(nèi)提供溶解度、組織相容性或緩釋的優(yōu)點(diǎn)。前藥包括已知的氨基保護(hù)基和羧基保護(hù)基。具體的前藥制備方法可參照saulnier,m.g.,etal.,bioorg.med.chem.lett.1994,4,1985-1990；greenwald,r.b.,etal.,j.med.chem.2000,43,475。

在本申請(qǐng)中，“藥物組合物”是指本發(fā)明化合物與本領(lǐng)域通常接受的用于將生物活性化合物輸送至哺乳動(dòng)物(例如人)的介質(zhì)的制劑。該介質(zhì)包括藥學(xué)上可接受的載體。藥物組合物的目的是促進(jìn)生物體的給藥，利于活性成分的吸收進(jìn)而發(fā)揮生物活性。

本文所用術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指不影響本發(fā)明化合物的生物活性或性質(zhì)的物質(zhì)(如載體或稀釋劑)，并且相對(duì)無毒，即該物質(zhì)可施用于個(gè)體而不造成不良的生物反應(yīng)或以不良方式與組合物中包含的任意組分相互作用。

在本申請(qǐng)中，“藥學(xué)上可接受的載體”包括但不限于任何被相關(guān)的政府管理部門許可為可接受供人類或家畜使用的佐劑、載體、賦形劑、助流劑、增甜劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、矯味劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、助懸劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。

本文所用的有關(guān)術(shù)語“受試者”、“患者”或“個(gè)體”是指患有疾病或病癥等的個(gè)體，包括哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于哺乳動(dòng)物綱的任何成員：人，非人的靈長類動(dòng)物(例如黑猩猩和其它猿類和猴)；家畜，例如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家養(yǎng)動(dòng)物，例如兔、狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，包括嚙齒類動(dòng)物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于鳥類和魚類等。在本文提供的一個(gè)有關(guān)方法和組合物的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物為人。

本文所用術(shù)語“預(yù)防的”、“預(yù)防”和“防止”包括使病患減少疾病或病癥的發(fā)生或惡化的可能性。

本文所用的術(shù)語“治療”和其它類似的同義詞包括以下含義：

(i)預(yù)防疾病或病癥在哺乳動(dòng)物中出現(xiàn)，特別是當(dāng)這類哺乳動(dòng)物易患有該疾病或病癥，但尚未被診斷為已患有該疾病或病癥時(shí)；

(ii)抑制疾病或病癥，即遏制其發(fā)展；

(iii)緩解疾病或病癥，即，使該疾病或病癥的狀態(tài)消退；或者

(iv)減輕該疾病或病癥所造成的癥狀。

本文所使用術(shù)語“有效量”、“治療有效量”或“藥學(xué)有效量”是指服用后足以在某種程度上緩解所治療的疾病或病癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀的至少一種藥劑或化合物的量。其結(jié)果可以為跡象、癥狀或病因的消減和/或緩解，或生物系統(tǒng)的任何其它所需變化。例如，用于治療的“有效量”是在臨床上提供顯著的病癥緩解效果所需的包含本文公開化合物的組合物的量。可使用諸如劑量遞增試驗(yàn)的技術(shù)測(cè)定適合于任意個(gè)體病例中的有效量。

本文所用術(shù)語“服用”、“施用”、“給藥”、“給予”等是指能夠?qū)⒒衔锘蚪M合物遞送到進(jìn)行生物作用的所需位點(diǎn)的方法。這些方法包括但不限于口服途徑、經(jīng)十二指腸途徑、胃腸外注射(包括靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)注射或輸注)、局部給藥和經(jīng)直腸給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可用于本文所述化合物和方法的施用技術(shù)，例如在goodmanandgilman,thepharmacologicalbasisoftherapeutics,currented.；pergamon；andremington's,pharmaceuticalsciences(currentedition),mackpublishingco.,easton,pa中討論的那些。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文討論的化合物和組合物通過口服施用。

本文所使用術(shù)語“藥物組合”、“藥物聯(lián)用”、“聯(lián)合用藥”、“施用其它治療”、“施用其它治療劑”等是指通過混合或組合不止一種活性成分而獲得的藥物治療，其包括活性成分的固定和不固定組合。術(shù)語“固定組合”是指以單個(gè)實(shí)體或單個(gè)劑型的形式向患者同時(shí)施用至少一種本文所述的化合物和至少一種協(xié)同藥劑。術(shù)語“不固定組合”是指以單獨(dú)實(shí)體的形式向患者同時(shí)施用、合用或以可變的間隔時(shí)間順次施用至少一種本文所述的化合物和至少一種協(xié)同制劑。這些也應(yīng)用到雞尾酒療法中，例如施用三種或更多種活性成分。

本發(fā)明的具體實(shí)施方式

一方面，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥：

其中：

x為cr3或n；

y為cr4或n；

z為cr5或n；

x、y、z中至少有一個(gè)為n；

r1、r2以及r3、r4、r5各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、單(烷基)氨基、二(烷基)氨基、環(huán)烷基氨基、巰基、烷硫基或氰基；

或者

r3和r4二者或r4和r5二者或r5和r1二者與它們所連接的碳原子共同組成五至七元非芳香環(huán)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥，其中：

r1、r2以及r3、r4、r5各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、羥基、c1-6烷氧基、氨基、單(c1-6烷基)氨基、二(c1-6烷基)氨基、c3-8環(huán)烷基氨基、巰基、c1-6烷硫基或氰基；

或者

r3和r4二者或r4和r5二者或r5和r1二者與它們所連接的碳原子共同組成含有0至3個(gè)選自氮、氧或硫的雜原子的五至七元非芳香環(huán)。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥，其中：

r1、r2以及r3、r4、r5各自獨(dú)立地選自氫、羥基、c1-6烷氧基、氨基、單(c1-6烷基)氨基、二(c1-6烷基)氨基、巰基或c1-6烷硫基。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥，其中：

r1、r2均為氫；且

r3、r4、r5各自獨(dú)立地選自氫、羥基、c1-6烷氧基、氨基、單(c1-6烷基)氨基或二(c1-6烷基)氨基。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥，其選自：

另一方面，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥：

其中：

x為cr3；

y為cr4；

z為cr5；

r3和r4二者或r4和r5二者或r5和r1二者與它們所連接的碳原子共同組成含有1個(gè)選自氮、氧或硫的雜原子的五至七元非芳香環(huán)，且r1、r2、r3、r4、r5中的其余基團(tuán)各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、單(烷基)氨基、二(烷基)氨基、環(huán)烷基氨基、巰基、烷硫基或氰基；或者

r1、r2、r3均為氫，且r4、r5互相不同且各自獨(dú)立地選自鹵素、羥基或烷氧基；或者

r1、r3均為氫，r2為氨基或烷基，且r4、r5各自獨(dú)立地選自鹵素、羥基、烷氧基、氨基、單(烷基)氨基或二(烷基)氨基。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥，其中：

r4和r5二者與它們所連接的碳原子共同組成含有1個(gè)選自氮、氧或硫的雜原子的五至七元非芳香環(huán)，且r1、r2、r3各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、羥基、c1-6烷氧基、氨基、單(c1-6烷基)氨基、二(c1-6烷基)氨基或c3-8環(huán)烷基氨基。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥，其中：

r4和r5二者與它們所連接的碳原子共同組成含有1個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子的五元非芳香環(huán)，且r1、r2、r3均為氫。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥，其中：

r1、r2、r3均為氫，且r4、r5互相不同且各自獨(dú)立地選自鹵素、羥基或c1-6烷氧基。

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥，其中：

r1、r3均為氫，r2為氨基或c1-6烷基，且r4、r5各自獨(dú)立地選自鹵素、羥基或c1-6烷氧基。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥，其選自：

另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥，以及藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明的藥物組合物可以被配制為固態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)制劑，如片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、膏劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球及氣溶膠。

本發(fā)明的藥物組合物可以通過制藥領(lǐng)域中公知的方法制備。例如，旨在注射給藥的藥物組合物可以通過將本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或前藥與滅菌的蒸餾水組合來制備，從而形成溶液劑?？商砑颖砻婊钚詣┮源龠M(jìn)形成均勻溶液或混懸液。制備藥物組合物的實(shí)際方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，例如可參見thescienceandpracticeofpharmacy(制藥科學(xué)與實(shí)踐)，20^thedition(philadelphiacollegeofpharmacyandscience,2000)。

本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑包括但不限于口服、局部、經(jīng)皮、肌肉、靜脈、吸入、腸胃外、舌下、直腸、陰道及鼻內(nèi)。例如，適合口服給藥的劑型包括膠囊、片劑、顆粒劑以及糖漿等。這些制劑中包含的本發(fā)明的化合物可以是固體粉末或顆粒；水性或非水性液體中的溶液或是混懸液；油包水或水包油的乳劑等。上述劑型可由活性化合物與一種或多種載體或輔料經(jīng)由通用的藥劑學(xué)方法制成。上述的載體需要與活性化合物或其他輔料兼容。對(duì)于固體制劑，常用的無毒載體包括但不限于甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、纖維素、葡萄糖、蔗糖等。用于液體制劑的載體包括但不限于水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、乙二醇和聚乙二醇等?；钚曰衔锟膳c上述載體形成溶液或是混懸液。具體的給藥方式和劑型取決于化合物本身的理化性質(zhì)以及所應(yīng)用疾病的嚴(yán)重程度等。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)上述因素并結(jié)合其自身具有的知識(shí)來確定具體的給藥途徑。例如可參見：李俊，《臨床藥理學(xué)》，人民衛(wèi)生出版社，2008.06；丁玉峰，論臨床劑型因素與合理用藥，醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，26(5)，2007；howardc.ansel,loydv.allen,jr.,nicholasg.popovich著，江志強(qiáng)主譯，《藥物劑型與給藥體系》，中國醫(yī)藥科技出版社，2003.05。

另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥或者本發(fā)明的藥物組合物，其用于預(yù)防和/或治療腫瘤。

另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥或者本發(fā)明的藥物組合物在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。

另一方面，本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物、特別是人的腫瘤的方法，所述方法包括對(duì)有需要的哺乳動(dòng)物、特別是人給予治療有效量的本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、多晶型物、互變異構(gòu)體或前藥或者本發(fā)明的藥物組合物。

在本申請(qǐng)中，術(shù)語“腫瘤”包括但不限于：白血病、胃腸間質(zhì)瘤、組織細(xì)胞性淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、肺癌、肺鱗癌、肺腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、皮膚癌、上皮細(xì)胞癌、宮頸癌、卵巢癌、腸癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、腦癌、骨癌、食道癌、黑色素瘤、腎癌、口腔癌等疾病。

通常，治療有效的日劑量為約0.001mg/kg至約100mg/kg；優(yōu)選的治療有效劑量為約0.01mg/kg至約50mg/kg；更優(yōu)選的治療有效劑量為約1mg/kg至約25mg/kg。

本文中所提供的有效劑量的范圍并非意圖限制本發(fā)明的范圍，而是代表優(yōu)選的劑量范圍。但是，最優(yōu)選的劑量可針對(duì)個(gè)別個(gè)體而進(jìn)行調(diào)整，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解且可決定的(例如參閱berkow等人編著，merck手冊(cè)，第16版，merck公司，rahway，n.j.，1992)。

本發(fā)明化合物可以與一種或多種其它的本發(fā)明化合物或者一種或多種其它抗癌藥物聯(lián)合或組合使用，以治療和/或預(yù)防腫瘤。可以與本發(fā)明化合物聯(lián)用的藥物包括但不限于多西他賽、吉西他濱、順鉑、卡鉑、格列衛(wèi)、替莫唑胺、阿霉素、達(dá)卡巴嗪、特羅凱、依托泊苷、柔紅霉素以及阿糖胞苷等。

實(shí)驗(yàn)部分

以下反應(yīng)方案示例性地說明本發(fā)明化合物的制備方法。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在以下描述中，只有當(dāng)取代基的組合可以得到穩(wěn)定的化合物時(shí)，這類取代基的組合才是允許的。

本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解，在下文所述的方法中，中間體化合物官能團(tuán)可能需要由適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)。這樣的官能團(tuán)包括羥基、氨基、巰基及羧酸。合適的羥基保護(hù)基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氫吡喃基、芐基等。合適的氨基、脒基及胍基的保護(hù)基包括叔丁氧羰基、芐氧羰基等。合適的巰基保護(hù)基包括-c(o)-r”(其中r”為烷基、芳基或芳烷基)、對(duì)甲氧基芐基、三苯甲基等。合適的羧基保護(hù)基包括烷基、芳基或芳烷基酯類。

保護(hù)基可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和如本文所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來引入和除去。

保護(hù)基的使用詳述于greene,t.w.與p.g.m.wuts,protectivegroupsinorganisynthesis,(1999),4^thed.,wiley中。保護(hù)基還可為聚合物樹脂。

本發(fā)明通式i所示化合物可通過以下的合成路線一或二來制備。

合成路線一：

試驗(yàn)條件：a.對(duì)甲苯磺酸(催化量)，甲苯，回流。

合成路線二：

試驗(yàn)條件：a.對(duì)甲苯磺酸(催化量)，甲苯，回流。

可通過以下的方法制備合成路線一和二中所用的化合物2。

(s)-4-乙基-4-羥基-1,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮

步驟1：2,4-二氧代戊酸乙酯

在30分鐘內(nèi)，向無水乙醇(600ml)中加入金屬鈉(25.3g，1.1mol)，將反應(yīng)液在室溫下攪拌2小時(shí)。在1小時(shí)的時(shí)間里，向所得的醇鈉溶液中緩慢滴加草酸二乙酯(146g，1.0mol)和干燥的丙酮(58g，1.0mol)的混合液，滴加完畢后將反應(yīng)液室溫下繼續(xù)攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)液過濾，將濾餅轉(zhuǎn)入冰(500g)、水(1l)混合物中，用濃硫酸酸化至ph值為1，再用乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯相用鹽水洗，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮，得到標(biāo)題所示化合物(95g，60％)。¹hnmr(cdcl3):δ6.37(1h,s),4.35(2h,q,j＝7.2hz),2.26(3h,s),1.38(3h,t,j＝7.2hz)。

步驟2：6-氰基-1-羥基-7-甲基-5-氧代-3,5-二氫吲哚嗪-2-羧酸甲酯

將2,4-二氧代戊酸乙酯(95g，0.60mol)，原甲酸三乙酯(177.6g，1.2mol)，一水合對(duì)甲苯磺酸(2.28g，12mmol)與無水甲醇(150ml)的混合液在40℃下攪拌1小時(shí)，然后加入氰基乙酰胺(55.0g，0.66mol)，碳酸鉀(91g，0.66mol)和二甲亞砜(2l)。將反應(yīng)液加熱至70℃，攪拌3小時(shí)。然后在2小時(shí)內(nèi)，向混合液中滴加丙烯酸甲酯(413g，4.8mol)，并將反應(yīng)液在70℃下攪拌過夜。將反應(yīng)液冷至室溫，傾入水(10l)中，用濃硫酸酸化至ph值為1，并繼續(xù)在室溫下攪拌1小時(shí)。將混合液過濾，將濾餅用甲醇洗滌并干燥，得到標(biāo)題所示化合物(45.5g，31％)。¹hnmr(dmso-d6):δ6.79(1h,s),4.62(2h,s),3.73(3h,s),2.43(3h,s)。

步驟3：7-甲基-1,5-二氧代-1,2,3,5-四氫吲哚嗪-6-甲腈

將6-氰基-1-羥基-7-甲基-5-氧代-3,5-二氫吲哚嗪-2-羧酸甲酯(45.5g，185mmol)加入至1:1的濃鹽酸與醋酸的混合液(500ml)中，將反應(yīng)液加熱至100℃，攪拌2小時(shí)，冷卻到室溫。真空濃縮，得到標(biāo)題所示化合物(34.0g，97.8％)。¹hnmr(dmso-d6):δ6.84(1h,s),4.08(2h,t,j＝6.4hz),2.85(2h,t,j＝6.4hz),2.46(3h,s)。

步驟4：7'-甲基-5'-氧代-3',5'-二氫-2'h-螺[[1,3]二氧環(huán)戊烷-2,1'-吲哚嗪]-6'-甲腈

將7-甲基-1,5-二氧代-1,2,3,5-四氫吲哚嗪-6-甲腈(34.0g，181mmol)溶于二氯甲烷(1.5l)中，向此溶液中加入乙二醇(22.4g，361mmol)和三甲基氯硅烷(78.1g，723mmol)。將反應(yīng)液在25℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌72小時(shí)。將反應(yīng)液過濾除去黑色懸浮物，然后用1m的氫氧化鈉溶液洗滌。將有機(jī)相用鹽水洗，用無水硫酸鈉干燥，將真空濃縮的殘余物通過柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(32.0g，76％)。¹hnmr(cdcl3):δ6.19(1h,s),4.19-4.11(6h,m),2.48(3h,s),2.39(2h,t,j＝7.8hz)。

步驟5：2-(6'-氰基-5'-氧代-3',5'-二氫-2'h-螺[[1,3]二氧環(huán)戊烷-2,1'-吲哚嗪]-7'-基)乙酸乙酯

向7'-甲基-5'-氧代-3',5'-二氫-2'h-螺[[1,3]二氧環(huán)戊烷-2,1'-吲哚嗪]-6'-甲腈(32.0g，138mmol)，碳酸二乙酯(32.6g，276mmol)與干燥甲苯(500ml)的混合液中，加入氫氧化鈉(11.0g，276mmol，60％)和無水乙醇(5ml)。將反應(yīng)液加熱至100℃，攪拌3小時(shí)。然后除去溶劑，將殘余物傾入水中，并用二氯甲烷萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，用無水硫酸鈉干燥后真空濃縮，并用柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(30.2g，72％)。¹hnmr(cdcl3):δ6.33(1h,s),4.22-4.13(8h,m),3.78(2h,s),2.41(2h,t,j＝7.8hz),1.29(3h,q,j＝7.8hz)。

步驟6：溴-[6-氰基-1,1-(亞乙二氧基)-5-氧代-1,2,3,5-四氫吲哚嗪-7-基]乙酸乙酯

在30℃下，向2-(6'-氰基-5'-氧代-3',5'-二氫-2'h-螺[[1,3]二氧環(huán)戊烷-2,1'-吲哚嗪]-7'-基)乙酸乙酯(30.2g，99mmol)，氫氧化鈉(3.96g，99mmol,60％)與干燥的乙二醇二甲醚(300ml)的混合液中滴加冷的干燥的液溴(1.56g，99mmol)的乙二醇二甲醚(20ml)溶液。將反應(yīng)液保持在該溫度下攪拌30分鐘，隨后一次加入冰水混合物(100ml)。真空濃縮除去有機(jī)溶劑，將殘余物傾入水中，并用二氯甲烷萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮，得到標(biāo)題所示化合物(33.6g，89％)。¹hnmr(cdcl3):δ6.68(1h,s),5.60(1h,s),4.31-4.14(8h,m),2.43(2h,t,j＝7.8hz),1.26(3h,q,j＝7.8hz)。

步驟7：2-[n-對(duì)甲苯磺?；?(r)-脯氨酸基]-2-[6-氰基-1,1-(亞乙二氧基)-5-氧代-l,2,3,5-四氫吲哚嗪-7-基]乙酸乙酯

將溴-[6-氰基-1,1-(亞乙二氧基)-5-氧代-1,2,3,5-四氫吲哚嗪-7-基]乙酸乙酯(33.6g，88mmol)，(r)-1-對(duì)甲苯磺酰基吡硌-2-甲酸(47.3g，176mmol)與碳酸鈉(18.3g，176mmol)加入到干燥的n,n-二甲基甲酰胺(300ml)中，將該反應(yīng)液加熱至100℃，攪拌過夜。除去溶劑后，將殘余物傾入水中，用二氯甲烷萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮并用柱層析純化，得標(biāo)題所示化合物(光學(xué)異構(gòu)體混合物，比例約為1:1)(41.7g，83％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.72(2h,d,j＝8.4hz),7.32(2h,d,j＝8。0hz),6.66(0.5h,s),6.63(0.5h,s),6.31(0.5h,s),6.18(0.5h,s),4.56-4.53(0.5h,m),4.41-4.38(0.5h,m),4.34-4.00(8h,m),3.62-3.57(0.5h,m),3.48-3.43(0.5h,m),3.31-3.24(1h,m),2.45-2.40(5h,m),1.81-1.77(4h,m),1.26(3h,t,j＝7.6hz)。

步驟8：(s)-2-[n-對(duì)甲苯磺?；?(r)-脯氨酸基]-2-[6-氰基-1,1-(亞乙二氧基)-5-氧代-1,2,3,5-四氫吲哚嗪-7-基]丁酸乙酯

向干燥的n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中加入2-[n-對(duì)甲苯磺酰基-(r)-脯氨酸基]-2-[6-氰基-1,1-(亞乙二氧基)-5-氧代-l,2,3,5-四氫吲哚嗪-7-基]乙酸乙酯(11.42g，20mmol)，碘乙烷(3.43g，22mmol)和氫氧化鈉(840mg，21mmol，60％)。將反應(yīng)液加熱至30℃，攪拌3小時(shí)，隨后加入水(30ml)。濃縮除去溶劑，將殘余物傾入水中，用二氯甲烷萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮并用柱層析純化，得白色固體(6.10g)。在80℃下，將此固體溶于異丙醇(450ml)，然后緩慢降溫至室溫，有晶體析出。過濾，將母液濃縮得到標(biāo)題所示化合物(2.10g，17％，e.e.>95％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.78(2h,d,j＝8.4hz),7.34(2h,d,j＝8.0hz),6.60(1h,s),4.51-4.47(1h,m),4.33-4.05(8h,m),3.56-3.51(1h,m),3.25-3.19(1h,m),2.59(2h,q,j＝7.6hz),2.45-2.41(5h,m),2.16-1.92(3h,m),1.73-1.65(1h,m),1.32(3h,t,j＝7.2hz),0.90(3h,t,j＝7.6hz)。

步驟9：(s)-2-[n-對(duì)甲苯磺?；?(r)-脯氨酸基]-2-[6-(乙酰胺甲基)-1,1-(亞乙二氧基)-5-氧代-1,2,3,5-四氫吲哚嗪-7-基]丁酸乙酯

將(s)-2-[n-對(duì)甲苯磺?；?(r)-脯氨酸基]-2-[6-氰基-1,1-(亞乙二氧基)-5-氧代-1,2,3,5-四氫吲哚嗪-7-基]丁酸乙酯(1.0g，1.7mmol)，雷尼鎳(1.0g)，醋酸酐(15ml)和醋酸(5ml)的混合液在氫氣(1.5atm)氣氛下加熱至40℃，攪拌4小時(shí)。過濾，將濾液濃縮并用柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(890mg，82％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.76(2h,d,j＝8.4hz),7.32(2h,d,j＝8.0hz),7.03(1h,t,j＝4.8hz),6.70(1h,s),4.78-4.73(1h,m),4.45-4.02(10h,m),3.55-3.50(1h,m),3.26-3.20(1h,m),2.73-2.64(1h,m),2.59-2.51(1h,m),2.43-2.40(5h,m),2.05-1.92(6h,m),1.74-1.67(1h,m),1.28(3h,t,j＝7.2hz),0.88(3h,t,j＝7.2hz)。

步驟10：(s)-2-[n-對(duì)甲苯磺?；?(r)-脯氨酸基]-2-[6-(乙酰氧甲基)-1,1-(亞乙二氧基)-5-氧代-1,2,3,5-四氫吲哚嗪-7-基]-丁酸乙酯

將(s)-2-[n-對(duì)甲苯磺酰基-(r)-脯氨酸基]-2-[6-(乙酰胺甲基)-1,1-(亞乙二氧基)-5-氧代-1,2,3,5-四氫吲哚嗪-7-基]丁酸乙酯(890mg，1.4mmol)溶于醋酸酐(15ml)和醋酸(5ml)的混合溶液中。在0℃下，向反應(yīng)液中加入亞硝酸鈉(380mg，5.5mmol)，并保持在該溫度下攪拌4小時(shí)。隨后過濾，向?yàn)V液中加入四氯化碳(30ml)，加熱回流過夜。濃縮除去溶劑后，將殘余物傾入水中，并用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮后用柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(660mg，74％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.75(2h,d,j＝8.0hz),7.34(2h,d,j＝8.0hz),6.78(1h,s),5.27(1h,d,j＝11.2hz),5.22(1h,d,j＝11.2hz),4.39-4.06(9h,m),3.61-3.56(1h,m),3.27-3.22(1h,m),2.68-2.62(1h,m),2.45-2.33(6h,m),2.05-1.92(6h,m),1.71-1.67(1h,m),1.24(3h,t,j＝7.2hz),0.90(3h,t,j＝7.6hz)。

步驟11：(s)-4-乙基-6,6-(亞乙二氧基)-1,4,7,8-四氫-4-羥基吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,10(6h)-二酮

向甲醇(6ml)和水(2ml)的混合液中加入(s)-2-[n-對(duì)甲苯磺?；?(r)-脯氨酸基]-2-[6-(乙酰氧甲基)-1,1-(亞乙二氧基)-5-氧代-1,2,3,5-四氫吲哚嗪-7-基]-丁酸乙酯(660mg，1.0mmol)，水合氫氧化鋰(171mg，4.1mmol)，并在室溫下攪拌2小時(shí)。隨后真空濃縮除去甲醇，向反應(yīng)液中加入醋酸(1ml)和二氯甲烷(20ml)。將混合液在室溫下攪拌10小時(shí)。真空濃縮，殘余物用柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(270mg，86％)。¹hnmr(cdcl3):δ6.58(1h,s),5.60(1h,d,j＝16.4hz),5.17(1h,d,j＝16.4hz),4.21-4.11(6h,m),3.77(1h,s),2.42(2h,t,j＝6.8hz),1.85-1.75(2h,m),0.98(3h,t,j＝7.6hz)。

步驟12：(s)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮(標(biāo)題化合物)

將(s)-4-乙基-6,6-(亞乙二氧基)-1,4,7,8-四氫-4-羥基吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,10(6h)-二酮(270mg，0.88mmol)與三氟醋酸(2ml)和水(0.5ml)的混合液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢?小時(shí)。真空濃縮，將殘余物用柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(202mg，87％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.22(1h,s),5.68(1h,d,j＝17.2hz),5.24(1h,d,j＝17.2hz),4.36-4.32(2h,m),3.65(1h,s),2.99-2.95(2h,m),1.84-1.78(2h,m),0.98(3h,t,j＝7.6hz)。

實(shí)施例

涉及對(duì)水和/或氧氣敏感的實(shí)驗(yàn)的所有操作都在預(yù)干燥的玻璃儀器中于氮?dú)夥障逻M(jìn)行。除非另有說明，所有原料均為商業(yè)原料，并且在使用前未作進(jìn)一步純化。

柱層析采用的是青島海洋化工所生產(chǎn)的硅膠(200-300目)。薄層色譜采用默克公司(e.merck)的預(yù)涂色譜板(硅膠60pf254，0.25毫米)。

核磁共振光譜分析使用的儀器為瓦里安vnmrs-400共振光譜儀?；瘜W(xué)位移以四甲基硅烷(tms＝δ0.00)為內(nèi)標(biāo)。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)的記錄格式為：質(zhì)子數(shù)，峰型(s，單峰；d，雙重峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰)，耦合常數(shù)(以赫茲為單位)。

液質(zhì)聯(lián)用使用的是安捷倫lc1200系列(5微米c18色譜柱)儀器。

實(shí)施例1：10-甲氧基-11-氮雜-20(s)-喜樹堿

步驟1：2-甲氧基吡啶-4-甲醛

0℃下，向2-甲氧基異煙酸(5.0g，33mmol)的四氫呋喃(40ml)溶液中分批加入四氫鋁鋰(1.9g，49mmol)。反應(yīng)液在0℃下繼續(xù)攪拌1小時(shí)，然后緩慢滴加飽和硫酸鈉溶液。過濾，所得濾液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相飽和食鹽水洗，真空濃縮。將所得殘余物溶于二氯甲烷(30ml)中，加入三氧化鉻吡啶(10.6g，49mmol)。反應(yīng)混合物室溫下攪拌2小時(shí)后傾倒于硅膠短柱上并用乙酸乙酯淋洗，所得溶液真空濃縮去除溶劑。通過柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)對(duì)所得殘余物純化得到標(biāo)題所示化合物(646mg，14％)。¹hnmr(cdcl3):δ10.01(1h,s),8.36(1h,d,j＝5.2hz),7.29(1h,dd,j＝1.2hz,5.2hz),7.14(1h,d,j＝1.2hz),3.99(3h,s)。

步驟2：4-(1,3-二氧戊環(huán)-2-基)-6-甲氧基吡啶-3-胺

室溫下，向2-甲氧基吡啶-4-甲醛(137mg，1.0mmol)的三氟乙酸酐(2ml)溶液中滴加發(fā)煙硝酸(1ml)。反應(yīng)液在25℃下攪拌3天后傾倒于冰水混合物中，加入飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)ph值到大于10。所得混合物用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用鹽水洗，干燥并真空去除溶劑。將所得殘余物溶于甲苯(5ml)，并加入對(duì)甲苯磺酸(5mg)和乙二醇(105mg，1.7mmol)。使反應(yīng)混合液回流過夜，冷卻后用飽和碳酸鈉和食鹽水洗，干燥，并真空去除溶劑。將殘余物溶于甲醇(10ml)，加入鈀/碳催化劑(20mg)并氫氣置換。反應(yīng)體系在1大氣壓的氫氣氛下攪拌2小時(shí)，過濾去除催化劑并真空濃縮去除溶劑。通過柱層析對(duì)所得殘余物純化，得到標(biāo)題所示化合物(15mg，8％)。¹hnmr(dmso-d6):δ9.31(1h,s),8.56(1h,s),7.42(1h,s),7.34(1h,s),6.55(1h,s),5.43(2h,s),5.30(2h,s),4.02(3h,s),2.04-1.91(2h,m),0.90-0.85(3h,m)。

步驟3：10-甲氧基-11-氮雜-20(s)-喜樹堿(標(biāo)題化合物)

向4-(1,3-二氧戊環(huán)-2-基)-6-甲氧基吡啶-3-胺(11mg，0.05mmol)的甲苯溶液中加入(s)-4-乙基-4-羥基-1,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮(13mg，0.05mmol)和對(duì)甲苯磺酸(2mg)并氮?dú)庵脫Q。使反應(yīng)液在氮?dú)夥障录訜峄亓魅r(shí)，真空濃縮去除溶劑。通過高效液相色譜將所得殘余物純化，得到標(biāo)題所示化合物(3mg，16％)。¹hnmr(dmso-d6):δ9.31(1h,s),8.56(1h,s),7.42(1h,s),7.34(1h,s),6.55(1h,s),5.43(2h,s),5.30(2h,s),4.02(3h,s),2.04-1.91(2h,m),0.90-0.85(3h,m)。

實(shí)施例2：9-甲氧基-10-氮雜-20(s)-喜樹堿

步驟1：4-[(二叔丁氧羰基)氨基]-2-氯吡啶

在0℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向2-氯-4-氨基吡啶(1.0g，7.8mmol)的干燥四氫呋喃(30ml)溶液中滴加nahmds(9ml，2m，18mmol)。繼續(xù)攪拌30分鐘，然后加入二碳酸二叔丁酯(3.75g，17mmol)的干燥四氫呋喃溶液。將反應(yīng)液在室溫下攪拌過夜，然后傾倒于飽和氯化銨溶液中。將混合物用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗，真空濃縮去除溶劑。通過柱層析(石油醚:乙酸乙酯＝8:1)將所得殘余物純化，得到標(biāo)題所示化合物(923mg，36％)。¹hnmr(cdcl3):δ8.39(1h,d,j＝5.2hz),7.19(1h,d,j＝1.6hz),7.05(1h,dd,j＝1.6hz,5.2hz),1.47(18h,s)。

步驟2：2-氯-4-(叔丁氧羰基氨基)煙酸叔丁酯

在0℃和氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向二異丙胺(2.74g，27mmol)的干燥四氫呋喃(50ml)溶液中滴加正丁基鋰(11.3ml，2.4m，27mmol)。繼續(xù)攪拌30分鐘后冷卻至-60℃，并在此溫度下滴加4-[(二叔丁氧羰基)氨基]-2-氯吡啶(2.55g，7.8mmol)的四氫呋喃溶液。繼續(xù)攪拌1小時(shí)候，加入飽和氯化銨溶液。將所得混合物用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用鹽水洗，干燥并真空濃縮去除溶劑。通過柱層析(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)將所得殘余物純化，得到標(biāo)題所示化合物(1.85g，73％)。¹hnmr(cdcl3):δ8.72(1h,s),8.24-8.20(2h,m),1.64(9h,s),1.53(9h,s)。

步驟3：2-甲氧基-4-氨基煙酸甲酯

向2-氯-4-(叔丁氧羰基氨基)煙酸叔丁酯(330mg，1mmol)的干燥甲苯(15ml)溶液中加入氫化鈉(60％，120mg，3.0mmol)和甲醇(約0.5ml)。將混合物在封管中加熱到100℃并攪拌6小時(shí)。冷卻后，將反應(yīng)液傾倒于硅膠短柱上并用乙酸乙酯淋洗，真空濃縮去除溶劑。通過柱層析將所得殘余物純化，得到標(biāo)題所示化合物(155mg，92％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.77(1h,d,j＝6.0hz),6.18(1h,d,j＝6.0hz),6.09(2h,br),3.95(3h,s),3.89(3h,s)。

步驟4：2-甲氧基-4-氨基-3吡啶醛

在0℃下，向2-甲氧基-4-氨基煙酸甲酯(30mg，0.18mmol)的四氫呋喃(3ml)溶液中滴加硼烷的四氫呋喃溶液(0.9ml，1m，0.9mmol)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。滴加大約1ml水，并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用食鹽水洗，干燥并真空濃縮去除溶劑。將殘余物溶于四氫呋喃(5ml)溶液中，加入二氧化錳(42mg，0.48mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜。過濾，將濾液真空濃縮去除溶劑。通過柱層析(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)將所得殘余物純化，得到標(biāo)題所示化合物(22mg，81％)。¹hnmr(cdcl3):δ10.31(1h,s),7.81(1h,d,j＝6.4hz),6.15(1h,d,j＝6.4hz),3.98(3h,s)。

步驟5：9-甲氧基-10-氮雜-20(s)-喜樹堿(標(biāo)題化合物)

以類似于實(shí)施例1步驟3中所描述的方法，由2-甲氧基-4-氨基-3吡啶醛和(s)-4-乙基-4-羥基-1,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮反應(yīng)，得到標(biāo)題所示化合物。¹hnmr(cd3od):δ8.86(1h,s),7.63(1h,d,j＝7.6hz),7.54(1h,s),6.81(1h,d,j＝7.6hz),5.49(1h,d,j＝16.4hz),5.30(1h,d,j＝16.4hz),5.22(2h,s),3.56(3h,s),1.87-1.84(2h,m),0.92-0.88(3h,m)。

實(shí)施例3：9-羥基-10-氮雜-20(s)-喜樹堿

9-羥基-10-氮雜-20(s)-喜樹堿為合成9-甲氧基-10-氮雜-20(s)-喜樹堿(實(shí)施例2，步驟5)時(shí)所得副產(chǎn)物。¹hnmr(dmso-d6):δ11.70(1h,br),8.86(1h,s),7.54(1h,dd,j＝6.0hz,7.2hz),7.30(1h,s),6.75(1h,d,j＝7.2hz),6.54(1h,s),5.43(2h,s),5.24(2h,s),1.89-1.82(2h,m),0.88-0.84(3h,m)。

實(shí)施例4：9-(二甲氨基)-10-氮雜-20(s)-喜樹堿

步驟1：2-(二甲氨基)-4-(叔丁氧羰基氨基)煙酸叔丁酯

向2-氯-4-(叔丁氧羰基氨基)煙酸叔丁酯(657mg，2.0mmol)的dme(10ml)溶液中加入二甲胺鹽酸鹽(490mg，6.0mmol)和三乙胺(1.01g，10mmol)。將反應(yīng)液在封管中加熱到110℃，攪拌過夜。冷卻后，將反應(yīng)液傾倒于飽和碳酸鈉溶液中，用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相并用飽和食鹽水洗，真空濃縮去除溶劑。通過柱層析(石油醚:乙酸乙酯＝8:1)將所得殘余物純化，得到標(biāo)題所示化合物(670mg，96％)。¹hnmr(cdcl3):δ9.22(1h,br),8.03(1h,d,j＝6.4hz),7.55(1h,d,j＝6.4hz),3.00(6h,s),1.60(9h,s),1.51(9h,s)。

步驟2：2-(二甲氨基)-4-氨基煙酸叔丁酯

以類似于實(shí)施例2步驟3中所描述的方法，由2-(二甲氨基)-4-(叔丁氧羰基氨基)煙酸叔丁酯合成標(biāo)題所示化合物。¹hnmr(cdcl3):δ7.75(1h,d,j＝6.4hz),5.92(1h,d,j＝6.4hz),5.45(2h,br),3.01(6h,s),1.59(9h,s)。

步驟3：2-(二甲氨基)-4-氨基-3吡啶醛

以類似于實(shí)施例2步驟4中所描述的方法，由2-(二甲氨基)-4-氨基煙酸叔丁酯合成標(biāo)題所示化合物。¹hnmr(cdcl3):δ9.74(1h,s),7.84(1h,d,j＝6.0hz),6.02(1h,d,j＝6.0hz),3.08(6h,s)。

步驟4：9-(二甲氨基)-10-氮雜-20(s)-喜樹堿(標(biāo)題化合物)

以類似于實(shí)施例1步驟3中所描述的方法，由2-(二甲氨基)-4-氨基-3吡啶醛和(s)-4-乙基-4-羥基-1,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮反應(yīng)，得到標(biāo)題所示化合物。¹hnmr(cd3od):δ9.16(1h,s),7.92(1h,d,j＝6.8hz),7.66(1h,s),7.48(1h,d,j＝6.8hz),5.58(1h,d,j＝8.8hz),5.41-5.36(3h,m),3.56(6h,s),1.96-1.93(2h,m),1.00-0.96(3h,m)。

實(shí)施例5：9-氮雜-10-甲氧基-20-(s)-喜樹堿

步驟1：6-氯-3-硝基吡啶腈

將2,6-二氯-3-硝基吡啶(3.00g，16mmol)，氰化亞銅(2.87g，32mmol)和n-甲基吡咯烷酮(10ml)的混合液在180℃下攪拌3小時(shí)。隨后冷卻至室溫，過濾。將濾餅用乙酸乙酯(30ml)洗滌兩次，將所得的乙酸乙酯合并，真空濃縮得到標(biāo)題所示化合物(1.10g，39％)。¹hnmr(cdcl3):δ8.58(1h,d,j＝8.8hz),7.79(1h,d,j＝8.8hz)。

步驟2：6-甲氧基-3-硝基吡啶亞胺甲酯

向甲醇(30ml)中加入氫氧化鈉(560mg，14mmol)，室溫?cái)嚢?0分鐘后，加入6-氯-3-硝基吡啶腈(1.00g，5.6mmol)。將反應(yīng)液在室溫下繼續(xù)攪拌3小時(shí)，然后傾入水中，用二氯甲烷萃取。有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮，得到標(biāo)題所示化合物(1.10g，93％)。¹hnmr(cdcl3):δ8.28(1h,br),8.08(1h,d,j＝8.8hz),6.88(1h,d,j＝8.8hz),4.05(3h,s),3.92(3h,s)。

步驟3：6-甲氧基-3-硝基吡啶甲酸甲酯

將6-甲氧基-3-硝基吡啶亞胺甲酯(1.10g，5.2mmol)溶于甲醇(10ml)，加入濃鹽酸(3ml)。將反應(yīng)液室溫?cái)嚢?小時(shí)后，用碳酸鈉溶液中和。所得混合液用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮，得到標(biāo)題所示化合物(1.03g，93％)。¹hnmr(cdcl3):δ8.34(1h,d,j＝9.2hz),6.92(1h,d,j＝9.2hz),4.06(3h,s),4.03(3h,s)。

步驟4：3-氨基-6-甲氧基吡啶甲酸甲酯

將6-甲氧基-3-硝基吡啶甲酸甲酯(1.03g，4.8mmol)，鐵粉(1.08g，19mmol)，氯化銨(389mg，7.3mmol)和乙醇/水(50ml,4:1)的混合液在80℃下攪拌4小時(shí)。冷卻后過濾，將濾液傾入水中，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用水洗，干燥，真空濃縮，所得殘余物經(jīng)柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(420mg，48％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.05(1h,d,j＝8.8hz),6.81(1h,d,j＝8.8hz),5.46(2h,br),3.94(3h,s),3.92(3h,s)。

步驟5：(3-氨基-6-甲氧基吡啶-2-基)甲醇

0℃下，向3-氨基-6-甲氧基吡啶甲酸甲酯(420mg，2.3mmol)的四氫呋喃(10ml)溶液中加入四氫鋁鋰(262mg，6.9mmol)。將反應(yīng)液在0℃下攪拌1小時(shí)，然后滴加飽和硫酸鈉溶液，混合液繼續(xù)攪拌2小時(shí)，然后過濾。將濾液用乙酸乙酯萃取，將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮。所得殘余物經(jīng)柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(170mg，48％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.04-7.02(1h,m),6.56(1h,d,j＝8.4hz),4.61(2h,s),3.90(3h,s),3.39(2h,br)。

步驟6：3-氨基-6-甲氧基吡啶甲醛

將(3-氨基-6-甲氧基吡啶-2-基)甲醇(154mg，1.0mmol)，二氧化錳(522mg，6.0mmol)和二氯甲烷(10ml)的混合液在室溫下攪拌6小時(shí)。然后過濾，將濾餅用二氯甲烷洗滌，合并有機(jī)相，真空濃縮。所得殘余物經(jīng)柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(28mg，18％)。¹hnmr(cdcl3):δ9.92(1h,s),7.01(1h,d,j＝8.8hz),6.79(1h,d,j＝8.8hz),5.82(2h,br),3.90(3h,s)。

步驟7：9-氮雜-10-甲氧基-20-(s)-喜樹堿(標(biāo)題化合物)

將3-氨基-6-甲氧基吡啶甲醛(10mg，0.066mmol)，(s)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮(17mg，0.066mmol)，對(duì)甲苯磺酸(2mg)與干燥的甲苯(5ml)的混合液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流3小時(shí)。然后將反應(yīng)液真空濃縮，向所得殘余物加入甲醇(10ml)，室溫?cái)嚢?0分鐘，過濾，固體用甲醇洗滌，干燥得到標(biāo)題所示化合物(12mg，49％)。¹hnmr(dmso-d6):δ8.49(1h,s),8.42(1h,d,j＝9.2hz),7.38(1h,d,j＝9.2hz),7.28(1h,s),6.51(1h,s),5.42(2h,s),5.28(2h,s),4.05(3h,s),1.89-1.82(2h,m),0.88-0.85(3h,m)。

實(shí)施例6：2,3-二氫呋喃并[2,3-j]-20-(s)-喜樹堿

步驟1：2-(2,5-二溴苯氧基)乙醇

將1,4-二溴-2-氟苯(6.86g，27mmol)，乙二醇(35ml)，n-甲基吡咯烷酮(35ml)和叔丁醇鉀(11.2g，95mmol)的混合液在100℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌過夜。冷卻至室溫，在30分鐘內(nèi)慢慢加入水(15ml)。過濾，將濾餅用乙二醇洗滌，向?yàn)V液中加入水，攪拌30分鐘。冷卻至15℃，靜置1小時(shí)。將析出的固體過濾，用水洗滌，干燥，得到標(biāo)題所示化合物(4.70g，59％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.40(1h,d,j＝8.4hz),7.05(1h,d,j＝2.4hz),7.02-6.70(1h,m),4.14(2h,t,j＝4.4hz),4.02-3.98(2h,m),2.13(1h,t,j＝6.4hz)。

步驟2：1,4-二溴-2-(2-溴乙氧基)苯

向2-(2,5-二溴苯氧基)乙醇(2.00g，6.8mmol)的甲苯(20ml)溶液中加入三溴化磷(2.01g，7.4mmol)。將混合液加熱至90℃，攪拌10小時(shí)，然后冷卻至室溫。緩慢加入1n的氫氧化鈉溶液猝滅反應(yīng)。將有機(jī)相用水洗，干燥，真空濃縮，得到標(biāo)題所示化合物(2.13g，88％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.41(1h,d,j＝9.2hz),7.04-7.01(2h,m),4.33(2h,t,j＝6.4hz),3.68(2h,t,j＝6.4hz)。

步驟3：6-溴-2,3-二氫苯并呋喃

在-78℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向1,4-二溴-2-(2-溴乙氧基)苯(2.13g，5.9mmol)的苯/四氫呋喃(28ml，2:5)溶液中滴加正丁基鋰(2.5ml，6.1mmol)。將混合液在-78℃下攪拌1小時(shí)，然后用醋酸猝滅。加入水，分離有機(jī)相，干燥，真空濃縮，得到標(biāo)題所示化合物(1.00g，85％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.03(1h,d,j＝8.0hz),6.91-6.93(2h,m),4.58(2h,t,j＝4.8hz),3.15(2h,t,j＝4.8hz)。

步驟4：2,3-二氫苯并呋喃-6-甲醛

將6-溴-2,3-二氫苯并呋喃(1.00g，5.0mmol)的干燥的四氫呋喃(20ml)溶液冷卻至-78℃，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下滴加正丁基鋰(2.3ml，2.4m，5.5mmol)。將反應(yīng)液在-78℃下攪拌30分鐘，然后滴加干燥的n,n-二甲基甲酰胺(731mg，10mmol)。將反應(yīng)液在-78℃下繼續(xù)攪拌1小時(shí)，然后用飽和氯化銨溶液猝滅。將混合液用乙酸乙酯萃取，分離有機(jī)相，干燥濃縮得到標(biāo)題所示化合物(384mg，52％)。¹hnmr(cdcl3):δ9.92(1h,s),7.40-7.33(2h,m),4.64(2h,t,j＝8.8hz),3.31-3.26(2h,m)。

步驟5：5-氨基-2,3-二氫苯并呋喃-6-甲醛

將2,3-二氫苯并呋喃-6-甲醛(249mg，1.7mmol)加入濃硝酸(5ml)中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后傾入冰水中，用乙酸乙酯萃取，用鹽水洗，真空濃縮。向殘余物中加入乙醇/水(12ml，5:1)混合液，鐵粉(290mg，5.2mmol)和氯化銨(104mg，1.9mmol)。將混合液在80℃下攪拌2小時(shí)，過濾。將濾液濃縮，將殘余物用柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(56mg，27％)。¹hnmr(cdcl3):δ9.75(1h,s),6.84(1h,s),6.57(1h,s),5.89(2h,br),4.52(2h,t,j＝8.4hz),3.19-3.15(2h,m)。

步驟6：2,3-二氫呋喃并[2,3-j]-20-(s)-喜樹堿(標(biāo)題化合物)

向干燥的甲苯(5ml)中加入5-氨基-2,3-二氫苯并呋喃-6-甲醛(35mg，0.22mmol)，(s)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮(37mg，0.14mmol)和對(duì)甲苯磺酸(3mg)，使反應(yīng)液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流3小時(shí)，真空濃縮。所得殘余物經(jīng)制備型高效液相色譜分離，得到標(biāo)題所示化合物(7mg，13％)。¹hnmr(dmso-d6):δ8.45(1h,s),8.00(1h,s),7.33(1h,s),7.26(1h,s),6.51(1h,s),5.41(2h,s),5.23(2h,s),4.71(2h,t,j＝8.0hz),3.47(2h,t,j＝8.0hz),1.99-1.86(2h,m),0.90-0.85(3h,m)。

實(shí)施例7：10-甲氧基-11-羥基-20-(s)-喜樹堿

步驟1：4-(芐氧基)-3-甲氧基苯甲醛

將4-羥基-3-甲氧基苯甲醛(2.0g，12.8mmol)，芐溴(2.2g，12.8mmol)和碳酸鉀(880mg，6.4mmol)加入丙酮(30ml)中，使反應(yīng)液回流過夜。加入水，過濾，將濾餅用水洗滌，在乙醇中重結(jié)晶，得到標(biāo)題所示化合物(3.1g，99％)。¹hnmr(cdcl3):δ9.84(1h,s),7.45-7.31(7h,m),6.99(1h,d,j＝8.4hz),5.25(2h,s),3.95(3h,s)。

步驟2：4-(芐氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲醛

向濃硝酸(3ml)中加入4-(芐氧基)-3-甲氧基苯甲醛(242mg，1.0mmol)，在0℃下攪拌1小時(shí)，過濾。將所得固體水洗，干燥，得到標(biāo)題所示化合物(280mg，97％)。¹hnmr(cdcl3):δ10.45(1h,s),7.68(1h,s),7.48-7.35(7h,m),5.28(2h,s),4.03(3h,s)。

步驟3：2-胺基-4-羥基-5-甲氧基苯甲醛

將4-(芐氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲醛(280mg，0.97mmol)和醋酸(3ml)的混合物加熱至85℃，然后加入氫溴酸(48％，1ml)。將反應(yīng)液在85℃下攪拌1小時(shí)。冷卻，加入水，用乙酸乙酯萃取，將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮。向所得殘余物中加入乙醇/水(10ml，4:1)，鐵粉(212mg，3.8mmol)和氯化銨(76mg，1.4mmol)。將混合液在80℃下攪拌30分鐘，過濾。向?yàn)V液中加入水，用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮。所得殘余物經(jīng)柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(62mg，52％)。¹hnmr(cdcl3):δ9.67(1h,s),6.86(1h,s),6.22(1h,s),6.20(1h,br),6.03(2h,br),3.89(3h,s)。

步驟4：10-甲氧基-11-羥基-20-(s)-喜樹堿(標(biāo)題化合物)

將2-胺基-4-羥基-5-甲氧基苯甲醛(19mg，0.11mmol)，(s)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮(26mg，0.1mmol)和水合對(duì)甲苯磺酸(1mg)與干燥的甲苯(3ml)的混合液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至90℃，攪拌2小時(shí)。真空濃縮以除去溶劑，向殘余物中加入甲醇(10ml)，在室溫下攪拌30分鐘，過濾，將固體用甲醇洗滌，干燥，得到標(biāo)題所示化合物(19mg，48％)。¹hnmr(dmso-d6):δ10.30(1h,br),8.41(1h,s),7.44(1h,s),7.37(1h,s),7.23(1h,s),6.49(1h,s),5.40(2h,s),5.21(2h,s),3.94(3h,s),1.97-1.84(2h,m),0.89-0.82(3h,m)。

實(shí)施例8：10-羥基-11-氟-20-(s)-喜樹堿

步驟1：(4-氟-3-甲氧基苯基)甲醇

在0℃下，向4-氟-3-甲氧基苯甲酸甲酯(8.3g，45mmol)的四氫呋喃(30ml)溶液中加入四氫鋁鋰(3.42g，90mmol)。將反應(yīng)液在0℃下攪拌1小時(shí)，然后滴加飽和硫酸鈉溶液。過濾，將濾液真空濃縮，得到標(biāo)題所示化合物(7.1g，100％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.06-7.00(2h,m),6.81-6.83(1h,m),4.63(2h,s),3.89(3h,s),1.90(1h,s)。

步驟2：4-氟-3-甲氧基苯甲醛

向(4-氟-3-甲氧基苯基)甲醇(1.56g，10mmol)的二氯甲烷(40ml)溶液中加入三氧化鉻吡啶(4.31g，20mmol)。將混合液在室溫下攪拌30分鐘，過濾。將濾液傾入硅膠短柱中，用二氯甲烷洗脫。將所得溶液真空濃縮，得到標(biāo)題所示化合物(1.25g，81％)。¹hnmr(cdcl3):δ9.92(1h,s),7.52(1h,dd,j＝2.0hz,8.4hz),7.47-7.43(1h,m),7.26-7.22(1h,m),3.96(3h,s)。

步驟3：2-氨基-4-氟-5-羥基苯甲醛

在0℃下，向4-氟-3-甲氧基苯甲醛(770mg，5.0mmol)的濃硫酸(10ml)溶液中滴加發(fā)煙硝酸(95％，315mg，4.8mmol)。將反應(yīng)液在室溫下攪拌1小時(shí)，傾入冰水中，過濾，將濾餅用水洗，干燥。將所得殘余物溶于n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中，加入氯化鋰(1.06g，25mmol)，回流4小時(shí)，傾入水中，滴加濃鹽酸酸化至ph<4，然后用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮。向所得殘余物中加入乙醇/水(25ml，4:1)混合液，鐵粉(1.21g，22mmol)和氯化銨(433mg，8.1mmol)。將混合液加熱至80℃攪拌2小時(shí)，過濾。向?yàn)V液中加入水，用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮，所得殘余物經(jīng)柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(125mg，16％)。¹hnmr(cdcl3):δ9.75(1h,s),7.14(1h,d,j＝9.6hz),6.41(1h,d,j＝12.0hz),5.96(2h,br),4.58(1h,d,j＝3.6hz)。

步驟4：10-羥基-11-氟-20-(s)-喜樹堿(標(biāo)題化合物)

使2-氨基-4-氟-5-羥基苯甲醛(33mg，0.21mmol)，(s)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮(37mg，0.14mmol)，對(duì)甲苯磺酸(3mg)與干燥甲苯(5ml)的混合液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流3小時(shí)。然后將反應(yīng)液真空濃縮，殘余物經(jīng)制備型高效液相色譜分離，得到標(biāo)題所示化合物(5mg，10％)。¹hnmr(dmso-d6):δ11.01(1h,s),8.53(1h,s),7.93(1h,d,j＝12.4hz),7.49(1h,d,j＝9.6hz),7.27(1h,s),6.51(1h,s),5.42(2h,s),5.24(2h,s),1.86-1.84(2h,m),0.89-0.86(3h,m)。

實(shí)施例9：10-甲氧基-11-氟-20-(s)-喜樹堿

步驟1：2-氨基-4-氟-5-甲氧基苯甲醛

0℃下，向4-氟-3-甲氧基苯甲醛(770mg，5.0mmol)的濃硫酸(10ml)溶液中滴加發(fā)煙硝酸(95％，315mg，4.8mmol)。將反應(yīng)液在室溫下攪拌1小時(shí)后，傾入冰水中，過濾，將濾餅水洗，干燥。向所得殘余物中加入乙醇/水(25ml，4:1)，鐵粉(1.12g，20mmol)和氯化銨(404mg，7.6mmol)。將反應(yīng)液在80℃攪拌2小時(shí)，過濾。向?yàn)V液中加入水，用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮。所得殘余物經(jīng)柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(180mg，21％)。¹hnmr(cdcl3):δ9.78(1h,s),7.04(1h,d,j＝9.2hz),6.41(1h,d,j＝11.6hz),6.03(2h,br),3.86(1h,s)。

步驟2：10-甲氧基-11-氟-20-(s)-喜樹堿(標(biāo)題化合物)

使2-氨基-4-氟-5-甲氧基苯甲醛(34mg，0.20mmol)，(s)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮(34mg，0.13mmol)，對(duì)甲苯磺酸(3mg)與干燥的甲苯(6ml)的混合液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流3小時(shí)。將反應(yīng)液真空濃縮，將所得殘余物用甲醇洗滌，干燥，得到標(biāo)題所示化合物(40mg，78％)。¹hnmr(dmso-d6):δ8.58(1h,s),7.96(1h,d,j＝12.4hz),7.74(1h,d,j＝8.8hz),7.27(1h,s),6.51(1h,s),5.40(2h,s),5.26(2h,s),1.86-1.82(2h,m),0.87-0.83(3h,m)。

實(shí)施例10：11-甲氧基-12-羥基-20-(s)-喜樹堿

步驟1：2-氨基-3-羥基-4-甲氧基苯甲醛

向3-羥基-4-甲氧基苯甲醛(456mg，3.0mmol)的醋酸(10ml)溶液中滴加濃硝酸(65％，290mg，3.0mmol)，將反應(yīng)液在室溫下攪拌2小時(shí)后，傾入水中，用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮。向所得殘余物中加入乙醇/水(50ml,4:1)混合液，鐵粉(672mg，12mmol)和氯化銨(636mg，12mmol)，加熱至80℃，攪拌1小時(shí)。過濾，向?yàn)V液中加入水，用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮，所得殘余物經(jīng)柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(140mg，28％)。¹hnmr(cdcl3):δ9.77(1h,s),7.09(1h,d,j＝8.8hz),6.40(1h,d,j＝8.8hz),5.37(2h,br),5.06(1h,br),3.95(3h,s)。

步驟2：11-甲氧基-12-羥基-20-(s)-喜樹堿(標(biāo)題化合物)

將2-氨基-3-羥基-4-甲氧基苯甲醛(19mg，0.11mmol)，(s)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮(26mg，0.1mmol)，對(duì)甲苯磺酸(1mg)與干燥的甲苯(5ml)的混合液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至90℃，攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)液真空濃縮，向殘余物中加入甲醇(10ml)，在室溫下攪拌30分鐘。過濾，所得固體用甲醇洗滌，干燥，得到標(biāo)題所示化合物(17mg，43％)。¹hnmr(dmso-d6):δ9.50(1h,br),8.54(1h,s),7.56-7.55(2h,m),6.54-6.53(1h,m),5.41(2h,s),5.23(2h,s),3.94(3h,s),1.97-1.84(2h,m),0.89-0.82(3h,m)。

實(shí)施例11：7-氨基-9-甲氧基-10-氟-20-(s)-喜樹堿

步驟1：4-氟-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸

0℃下，向4-氟-3-甲氧基苯甲酸(3.40g，20mmol)的濃硫酸(25ml)溶液中加入硝酸鉀(202mg，20mmol)，將反應(yīng)液在40℃下攪拌2小時(shí)。冷至室溫后，傾入冰水中，用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮。所得殘余物經(jīng)柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(1.81g，42％)。¹hnmr(dmso-d6):δ8.08-8.05(1h,m),7.49-7.47(1h,m),3.95(3h,s)。

步驟2：4-氟-5-甲氧基-2-硝基苯甲酰胺

向二氯亞砜/氯仿(10ml，1:2)混合液中加入4-氟-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(860mg，4.0mmol)，將反應(yīng)液加熱至65℃，攪拌過夜。真空濃縮，將所得殘余物溶于干燥的乙酸乙酯etoac(30ml)，在0℃下通入氨氣15分鐘。然后將混合液用飽和碳酸鈉溶液洗滌，將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮，得到標(biāo)題所示化合物(856mg，100％)。¹hnmr(cdcl3):δ8.08-8.02(1h,m),7.70(1h,br),7.33-7.31(1h,m),3.93(3h,s)。

步驟3：4-氟-5-甲氧基-2-硝基苯腈

向三氟醋酸酐/二氯甲烷(10ml，1:2)混合液中加入4-氟-5-甲氧基-2-硝基苯甲酰胺(856mg，4.0mmol)，將反應(yīng)液在室溫下攪拌4小時(shí)。然后加入水，用二氯甲烷萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮。所得殘余物經(jīng)柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(675mg，86％)。¹hnmr(dmso-d6):δ8.12-8.09(1h,m),7.40-7.38(1h,m),4.11(3h,s)。

步驟4：2-氨基-4-氟-5-甲氧基苯腈

向乙醇/水(30ml，1:1)混合液中加入4-氟-5-甲氧基-2-硝基苯腈(196mg，1.0mmol)和保險(xiǎn)粉(522mg，3.0mmol)，將反應(yīng)液加熱至80℃，攪拌2小時(shí)。真空濃縮后，加入水，用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，干燥，真空濃縮。所得殘余物用柱層析純化，得到標(biāo)題所示化合物(130mg，78％)。¹hnmr(cdcl3):δ6.95-6.93(1h,m),6.53-6.50(1h,m),4.23(2h,br),3.82(3h,s)。

步驟5：7-氨基-9-甲氧基-10-氟-20-(s)-喜樹堿(標(biāo)題化合物)

使2-氨基-4-氟-5-甲氧基苯腈(18mg，0.11mmol)，(s)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮(26mg，0.10mmol)，對(duì)甲苯磺酸(1mg)和干燥的甲苯(5ml)的混合液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流24小時(shí)。真空濃縮，所得殘余物經(jīng)制備型高效液相色譜分離，得到標(biāo)題所示化合物(3mg，7％)。¹hnmr(dmso-d6):δ8.10(1h,br),7.91-7.89(1h,m),7.68-7.65(1h,m),7.31(1h,s),6.50(1h,br),5.39(2h,s),5.01(2h,m),3.85(3h,s),1.97-1.84(2h,m),0.89-0.82(3h,m)。

實(shí)施例12：10-甲氧基-11-氟-7-甲基-20(s)-喜樹堿

步驟1：4-氟-n,3-二甲氧基-n-甲基苯甲酰胺

室溫下，向4-氟-3-甲氧基苯甲酸(1.7g，10mmol)，n,o-二甲基羥胺鹽酸鹽(1.17g，12mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液中加入三乙胺(7.0mmol，50mmol)，edci(2.11g，11mmol)。反應(yīng)液在室溫下攪拌36小時(shí)，然后傾入30ml水中，用二氯甲烷萃取。將有機(jī)相用飽和食鹽水洗，真空濃縮。所得殘余物通過柱層析純化得到標(biāo)題所示化合物(628mg，29％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.37-7.35(1h,m),7.32-7.28(1h,m),7.10-7.05(1h,m),3.91(3h,s),3.55(3h,s),3.36(3h,s)。

步驟2：4-氟-3-甲氧基苯乙酮

將4-氟-n,3-二甲氧基-n-甲基苯甲酰胺(628mg，2.9mmol)的四氫呋喃(5ml)溶液冷卻至0℃。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，滴加甲基溴化鎂溶液(3.2ml，4.4mmol)。在0℃攪拌15分鐘后，用飽和氯化銨溶液猝滅。所得混合物用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，干燥并真空去除溶劑得到標(biāo)題所示化合物(465mg，94％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.64-7.61(1h,m),7.55-7.52(1h,m),7.17-7.12(1h,m),3.96(3h,s),2.60(3h,s)。

步驟3：4-氟-5-甲氧基-2-硝基苯乙酮

將4-氟-3-甲氧基苯乙酮(465mg，2.8mmol)溶于濃硫酸(3ml)中，冷卻至0℃，緩慢滴加發(fā)煙硝酸(183mg，2.8mmol)。反應(yīng)液在0℃繼續(xù)攪拌半小時(shí)后，傾入水中。所得混合物用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗，干燥并真空去除溶劑得到標(biāo)題所示化合物(435mg，74％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.94(1h,d,j＝10.4hz),6.87(1h,d,j＝8.0hz),4.02(3h,s),2.54(3h,s)。

步驟4：2-氨基-4-氟-5-甲氧基苯乙酮

將4-氟-5-甲氧基-2-硝基苯乙酮(435mg，2.0mmol)、氯化銨(164mg，3.0mmol)和鐵粉(456mg，8.2mmol)在乙醇/水(20ml，4:1)混合溶液中回流3小時(shí)，然后過濾。將濾液傾入水(30ml)中，用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用飽和食鹽水洗，真空濃縮。所得殘余物通過柱層析純化得到標(biāo)題所示化合物(271mg，72％)。¹hnmr(cdcl3):δ7.26(1h,d,j＝9.2hz),6.39(1h,d,j＝12.8hz),6.18(2h,br),3.85(3h,s),2.54(3h,s)。

步驟5：10-甲氧基-11-氟-7-甲基-20(s)-喜樹堿(標(biāo)題化合物)

向2-氨基-4-氟-5-甲氧基苯乙酮(13mg，0.071mmol)的甲苯溶液中加入(s)-4-乙基-4-羥基-1,8-二氫-1h-吡喃并[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10(4h)-三酮(13mg，0.05mmol)和對(duì)甲苯磺酸(2mg)并氮?dú)庵脫Q。將反應(yīng)液在氮?dú)夥障录訜峄亓魅r(shí)，真空濃縮去除溶劑。通過高效液相色譜對(duì)所得殘余物純化得到標(biāo)題所示化合物(6mg，30％)。¹hnmr(dmso-d6):δ7.92(1h,d,j＝12.4hz),7.61(1h,d,j＝9.2hz),7.24(1h,s),6.51(1h,s),5.41(2h,s),5.21(2h,s),4.03(3h,s),2.74(3h,s),1.87-1.83(2h,m),0.88-0.84(3h,m)。

體外活性實(shí)驗(yàn)：

將人肺癌細(xì)胞a549用補(bǔ)充有10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；將人結(jié)腸癌細(xì)胞sw620，ht-29和人前列腺癌細(xì)胞pc-3用補(bǔ)充有10％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。上述細(xì)胞的培養(yǎng)條件是37℃，95％空氣和5％co2，培養(yǎng)于25cm²或75cm²塑料組織培養(yǎng)瓶中，一周傳代培養(yǎng)2～3次。

將細(xì)胞以1×10³細(xì)胞/孔(a549)，2×10³細(xì)胞/孔(sw620和ht29)，3×10³細(xì)胞/孔(pc-3)的密度接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，195μl/孔，并在37℃，95％空氣和5％co2中進(jìn)行培養(yǎng)。24小時(shí)后加入待測(cè)化合物，將化合物從10mm(溶于100％dmso中)開始用100％dmso進(jìn)行3倍梯度稀釋，每個(gè)濃度取4μl加入到96μl的無血清培養(yǎng)基中，最后取5μl培養(yǎng)基稀釋后的化合物加入到接種有細(xì)胞的培養(yǎng)板中。細(xì)胞培養(yǎng)液中dmso終濃度為0.1％，所試化合物的終濃度是0.3nm～10μm。將所述細(xì)胞于37℃溫育3天。

3天后，根據(jù)atp和螢光素酶的反應(yīng)用發(fā)光計(jì)測(cè)量活細(xì)胞的活力水平(celltitre螢光試劑盒，promega)。在該方法中，可以根據(jù)所述化合物對(duì)細(xì)胞生長的影響來判斷化合物的效力。由產(chǎn)生的數(shù)據(jù)生成劑量響應(yīng)曲線，并通過prism程序計(jì)算ic50。

本發(fā)明代表性化合物的生物活性：

盡管本文描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是這些實(shí)施方式僅作為示例提供。應(yīng)理解本文所述的本發(fā)明實(shí)施方式的變體也可用于實(shí)施本發(fā)明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，可出現(xiàn)多種變體、變化和替換而不脫離本發(fā)明的范圍。應(yīng)理解本發(fā)明各個(gè)方面的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書決定，并且這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)以及其等價(jià)的方法和結(jié)構(gòu)均在隨附的權(quán)利要求書涵蓋的范圍之內(nèi)。