本發(fā)明涉及病原體臨床檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種鑒別mev野毒株與mevb毒株的lamp引物組、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

水貂腸炎病毒(minkenteritisvirus,mev)屬于細小病毒科，細小病毒屬的成員。mev是一種單股dna病毒，病毒基因組包含大約5,000bp的核苷酸，病毒基因組包含兩個開放閱讀框，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白ns1和ns2以及衣殼蛋白vp1和vp2。病毒粒子呈二十立面體對稱，直徑只有20納米。

細小病毒科成員mev感染水貂后能引起水貂急性的病毒性腸炎。本病最早報道于1947年的加拿大，發(fā)現(xiàn)感染水貂死亡率高達80％。1952年，有學(xué)者首次分離鑒定了病原證實為病毒，隨后制備了組織滅活疫苗用于本病的預(yù)防。之后，本病報道于世界各地，在水貂養(yǎng)殖的不同國家均具有本病的發(fā)生。隨著毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，水貂病毒性腸炎已經(jīng)成為危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的三大疫病之一，給世界養(yǎng)貂業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。mev能感染所有品種的水貂引起出血性腸炎，尤其是新出生的水貂和幼年水貂，具有較高的發(fā)病率和死亡率。

mev診斷方法的建立對于本病的防治具有重要的意義，目前，多種實驗室方法已經(jīng)用于水貂病毒性腸炎的診斷(chenandcui,2009；riveraandsundquist,1984；shenetal.,1986；uttenthaletal.,1990；veijalainenetal.,1986；wangetal.,2011,2012；zhangetal.,2007)。但是現(xiàn)有的方法存在各自的弊端，電子顯微鏡技術(shù)和病毒分離具有較高的特異性和敏感性，但是這些技術(shù)或耗時或昂貴，前者不能在一般的實驗室操作。乳膠凝集試驗雖然快速但是特異性較低。血凝試驗缺乏穩(wěn)定性而且需要血凝抑制試驗符合實驗結(jié)果，而且隨時需要準備新鮮的豬紅血球，并且本方法對于無血凝特性的mev毒株是無效的(riveraandsundquist,1984)。雖然elisa和pcr技術(shù)具有較高的特異性和敏感性，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于mev的診斷上，但是這些技術(shù)需要專業(yè)的設(shè)備和專門的操作人員。

更為重要的是，現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種方便快捷的區(qū)分mev的野毒株和疫苗株的方法。由于臨床mev野毒經(jīng)典株、變異株的同時存在，加上疫苗的大量使用，給臨床監(jiān)測和診斷帶來很大的困難。建立mev野毒株、疫苗株的鑒別檢測方法是檢測和診斷該病的重要前提。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

參考文件：

chen,c.m.andcui,s.j.,2009.detectionofporcineparvovirusbyloop-mediatedisothermalamplification.journalofvirologicalmethods155,122-5.

rivera,e.andsundquist,b.,1984.anon-haemagglutinatingisolateofminkenteritisvirus.vetmicrobiol9,345-53.

shen,d.t.,ward,a.c.andgorham,j.r.,1986.detectionofminkenteritisvirusinminkfeces,usingenzyme-linkedimmunosorbentassay,hemagglutination,andelectronmicroscopy.amjvetres47,2025-30.

uttenthal,a.,larsen,s.,lund,e.,bloom,m.e.,storgard,t.andalexandersen,s.,1990.analysisofexperimentalminkenteritisvirusinfectioninmink:insituhybridization,serology,andhistopathology.jvirol64,2768-79.

veijalainen,p.m.,neuvonen,e.,niskanen,a.andjuokslahti,t.,1986.latexagglutinationtestfordetectingfelinepanleukopeniavirus,canineparvovirus,andparvovirusesoffuranimals.journalofclinicalmicrobiology23,556-9.

wang,j.k.,cheng,s.p.,yi,l.,yang,s.,luo,b.,xu,h.l.,yan,x.j.andwu,h.,2011.establishmentofdoubleantibodysandwichelisafordetectionofminkenteritisvirus.chineseveterinaryscience41,183-187.

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zhang,h.l.,yan,x.j.,chai,x.l.,wu,w.,yi,l.,luo,g.l.,tian,h.y.,shao,x.q.andwang,f.x.,2007.establishmentandapplicationofpcrfordetectionofminkenteritisvirus.specialwildeconomicanimalandplantresearch29,1-3.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供種一種用于檢測mev野毒株的lamp引物組和試劑盒，該引物組和試劑盒能特異性地對mev野毒株進行檢測，但不對疫苗株mevb進行擴增。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明涉及一種檢測mev野毒株的lamp引物組，所述lamp引物組包括f3和b3組成外引物對和fip和bip組成的內(nèi)引物對；

所述f3、b3、fip以及bip的核苷酸序列依次如seqidno:1～4所示。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediatedisothemalamplification,lamp)是近年來發(fā)展出來的一種核酸擴增技術(shù)。通過設(shè)計識別目的片段6個序列的4個特異引物，整個反應(yīng)可以在恒溫條件下1h左右完成，由于采用4個引物，與傳統(tǒng)的核酸擴增技術(shù)相比，它具有敏感、特異的特點。反應(yīng)不需要精密控溫設(shè)備和高級復(fù)雜的分析儀器，對操作人員的熟練度和專業(yè)水平要求不高，因此該方法特別適合基層或者實驗條件較差的試驗室進行病原微生物的快速檢測。

引物的特異性是lamp檢測方法成敗的關(guān)鍵。引物的設(shè)計及篩選有其獨特的設(shè)計原則及規(guī)律。lamp反應(yīng)中內(nèi)引物fip/bip和外引物f3/b3的特異性決定了反應(yīng)的特異性。本發(fā)明提供的lamp引物具有非常高的特異性，可針對snp位點進行檢測，所設(shè)計的lamp-snp引物只能將mev野毒株進行擴增，而mevb毒株和非mev毒株沒有擴增。

本發(fā)明還涉及一種用于檢測mev野毒株的lamp試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的lamp引物組、反應(yīng)混合液以及dna聚合酶。

本發(fā)明提供的檢測試劑盒具有用樣少、特異性強、敏感性高、快速準確等特點，為檢測mev野毒株提供了簡捷、有效的早期快速診斷途徑。

優(yōu)選的，如上所述的用于鑒別mev野毒株的lamp試劑盒，所述反應(yīng)混合液包括dntp、mgso4以及甜菜堿中的一種或多種。

優(yōu)選的，如上所述的用于鑒別mev野毒株的lamp試劑盒，所述dna聚合酶為具有鏈置換作用的bstdna聚合酶，活性單位為6～10u/μl，更優(yōu)選為8u/μl。

bstdna聚合酶來源于bacillusstearothermophilus。它有5'→3'的聚合酶活性和雙鏈特異的5'→3'外切酶活性，但沒有3'→5'外切酶活性。具有熱穩(wěn)定性、鏈置換活性及聚合酶活性，在體外dna等溫擴增反應(yīng)中起重要作用。

優(yōu)選的，如上所述的用于鑒別mev野毒株的lamp試劑盒，所述試劑盒中還含有指示劑；所述指示劑選自sybrgreeni、evagreen、picogreen、pekogreen、碘化丙啶、鈣黃綠素或羥基萘酚藍中的一種。

因為產(chǎn)物是雙鏈dna，也可以通過顏色變化直接觀察，即在反應(yīng)產(chǎn)物中加入sybrgreeni、evagreen、picogreen、pekogreen、碘化丙啶(pi)等雙鏈dna熒光顯色試劑或者黃連素(berberine)，在熒光燈下觀察顏色變化，如sybr-green、evagreen、picogreen、pekogreen、陽性為綠色熒光，陰性無綠色熒光。而pi陽性為紅色熒光，陰性無紅色熒光。黃連素在熒光下陽性為黃色熒光，而陰性無黃色熒光；

或者在反應(yīng)體系中加入20～30mm鈣黃綠素(calcein)和0.3～0.7mmmncl2，在反應(yīng)過程中和反應(yīng)后觀察顏色或熒光變化，可見光下陰性為橙色，陽性為綠色，在熒光燈下陰性無綠色熒光，陽性為綠色熒光。鈣黃綠素和mncl2也可在反應(yīng)結(jié)束后加入產(chǎn)物中觀察顏色或熒光變化。

所述試劑盒也可以不使用指示劑，由于最終產(chǎn)物是由不同長度dna分子組成的混合物，故用2％-3％瓊脂糖凝膠電泳，可以看到類似梯狀條帶，也可以判斷陽性擴增。

優(yōu)選的，如上所述的用于鑒別mev野毒株的lamp試劑盒，所述試劑盒還包括mev野毒株dna的陽性對照。

如上所述的引物組或如上所述的試劑盒在鑒別mev野毒株與mevb毒株中的應(yīng)用；

由于該引物組和試劑盒能特異性地對mev野毒株進行檢測，但不對疫苗株mevb進行擴增，因此可用于臨床和科研中mev野毒株與mevb毒株的鑒別；

優(yōu)選的，所述mev野毒株包括：mevsd07/09、mevzj1，mev-ln10、mev-sdnh、mev-l、mev-abashiri、mev-lhv、mev-sd12/01、mev-jlin/2010。

本發(fā)明還涉及一種鑒別mev野毒株與mevb毒株的方法，包括：

提取含有mev野毒株或mevb毒株的待檢測樣本的dna，添加如上所述的試劑盒中的試劑組成反應(yīng)體系進行恒溫反應(yīng)；若反應(yīng)過程中或反應(yīng)后觀察到反應(yīng)液中指示劑出現(xiàn)顏色變化或熒光強度變化，或電泳檢測到反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)彌散狀梯狀條帶，則所述待檢樣本中含有mev野毒株，反之所述待檢樣本中僅含有mevb毒株。

優(yōu)選的，如上所述的檢測方法，所述反應(yīng)體系中，f3、b3、fip以及bip的濃度比為(3～5):(3～5):(23～27):(23～27)；

更優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系中，f3、b3、fip以及bip的濃度比為4:4:25:25；

優(yōu)選的，如上所述的檢測方法，所述恒溫反應(yīng)的條件為：

63℃～68℃恒溫反應(yīng)50min～80min；

更優(yōu)選的，所述恒溫反應(yīng)的條件為：

65℃恒溫反應(yīng)60min；

更優(yōu)選的，在所述恒溫反應(yīng)之后還包括：

80℃滅活10min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)、本發(fā)明提供的lamp引物組能夠特異性地用于mev野毒株的檢測，且基于該特點，可將所述lamp引物組及包含所述引物組的試劑盒用于mev野毒株與mevb疫苗毒株的鑒別。

2)、本發(fā)明檢測對象是水貂腸炎病毒dna，水貂腸炎病毒dna具有保守、穩(wěn)定的特點，加上我們設(shè)計了針對該保守序列的6個位點的4條引物，擴增產(chǎn)物也是具有特異和穩(wěn)定的特點；從而不依賴于病毒基因組的序列測定，只需要學(xué)會簡單的dna操作即可掌握。

3)、本發(fā)明采用bstdna聚合酶代替常規(guī)pcr的dna聚合酶，該酶耐高溫，有鏈置換功能和dna5’→3’聚合活性，在60℃～65℃等溫條件下對靶dna實現(xiàn)特異擴增；由于不需要高溫變性、低溫退火和延伸的循環(huán)，省去了常規(guī)pcr變溫所需要的時間，從而實現(xiàn)快速高效的dna擴增。

4)、本發(fā)明所使用的儀器都是常規(guī)儀器，離心機和恒溫水浴鍋或者其他恒溫設(shè)備，不需要昂貴的pcr儀設(shè)備，成本大大降低。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為使用本發(fā)明提供的lamp-snp技術(shù)檢測鑒別mev毒株(mevsd、mevzj1，mev-ln10和mevb)和非mev毒株(cdv3毒株，amdv-g毒株和cav-2c毒株)的dna(或cdna)的電泳檢測結(jié)果；1泳道為mevb，2～4為mevsd、mevzj1，mev-ln10；5～7為cdv3毒株，amdv-g毒株和cav-2c毒株；

圖2為用不同稀釋度的pt-mev-ns1作為模板，分別按照已經(jīng)建立lamp-snp反應(yīng)條件和pcr條件進行擴增的電泳檢測結(jié)果；圖2a:lamp-snp；圖2b:pcr；1～8泳道的pt-mev-ns1質(zhì)粒的稀釋倍數(shù)分別為10-¹～10^-8；

圖3為對陽性臨床樣品進行l(wèi)amp-snp技術(shù)檢測時的部分檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例

實驗方法：

根據(jù)文獻報道引物診斷樣品中陽性mev【wang,j.,cheng,s.,yi,l.,cheng,y.,yang,s.,xu,h.,li,z.,shi,x.,wu,h.,andyan,x.(2013).detectionofminkenteritisvirusbyloop-mediatedisothermalamplification(lamp).journalofvirologicalmethods187,401-405.】。參考genbank上的所有mevns1基因序列，進行比對發(fā)現(xiàn)mevb毒株第1846位為a，而其他mev毒株為g。因此利用該位點差異在lamp在線設(shè)計引物軟件(http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計一組引物，鑒別mevb毒株與mev野毒株。

引物序列為：

f3：tagagacacaagcggcaa；

b3：cctctatttcggaccacg；

fip(f1c+f2)：ctggagtactccacggttcctcctcagagtcaagacca；

bip(b1c+b2)：gatacgcctattgcagaaactttgcacgtctttgtgagt。

收集吉林省104份臨床糞便樣品，利用dna提取試劑盒提取dna，根據(jù)文獻中的引物檢測mev陽性樣品。再分別用pcr技術(shù)和lamp-snp技術(shù)分別檢測陽性mev臨床樣品。

病毒dna提?。?/p>

含有mevsd毒株的無菌采取糞拭子樣品浸泡于含有400μl的tris-edta溶液的1.5ml離心管里，存于-20℃?zhèn)溆?。mevb同步接毒f81細胞96h出現(xiàn)細胞病變后收毒作為陽性對照。按照試劑盒的說明書應(yīng)用dna提取試劑盒分別提取糞便樣品、mevb毒株感染細胞及陰性對照細胞的總dna。提取的dna作為lamp和pcr實驗的模板。

根據(jù)genbank上的mevsd毒株ns1基因設(shè)計一對引物，應(yīng)用primerpreimer5.0軟件設(shè)計一對特異性引物。引物序列如下：

mevns1f：cgcggatccatgtctggcaaccagtata

mevns1r：cggctgcagttaatccaagtcgtctcgaa

以mevns1f、mevns1r為引物，以mevsd毒株的dna為模板進行pcr擴增，反應(yīng)條件為95℃5min，94℃30s，55℃60s，72℃120s，35個循環(huán)，72℃后延伸10min。純化后的ns1片段與pmd-18t載體連接，獲得陽性pt-mev-ns1。

根據(jù)文獻中的引物檢測mev陽性樣品。再利用lamp-snp技術(shù)鑒別診斷mevb疫苗毒和野毒株，反應(yīng)體系：f3、b3各0.4μl(10pm)，fip、bip各2.5μl(10pm)，dntp3.5μl(10mm)，10×bstdna聚合酶緩沖液2.5μl，bstdna聚合酶0.5μl(8u)，mgso44μl(100mm)，甜菜堿6μl(20μm)，樣品dna2μl。反應(yīng)條件為：在金屬浴65℃反應(yīng)60min，80℃滅活10min。2％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

檢測lamp-snp技術(shù)的特異性和敏感性。本實驗室已經(jīng)分離的mevsd毒株、mevzj1毒株，mev-ln10毒株和mevb毒株；非mev毒株cdv3毒株，amdv-d毒株和cav-2c毒株，對以上毒株進行l(wèi)amp-snp技術(shù)檢測。對陽性的pt-mev-ns1質(zhì)粒十倍稀釋(2×10⁶-2×10^-2copies/ml)檢測lamp-snp技術(shù)最低檢測量，并與pcr進行對比。

實驗結(jié)果：

提取mev毒株(mevsd、mevzj1，mev-ln10和mevb)和非mev毒株(cdv3毒株，amdv-g毒株和cav-2c毒株)的dna(或cdna)，應(yīng)用lamp-snp技術(shù)檢測陽性樣品。其電泳檢測結(jié)果見圖1。所設(shè)計的lamp-snp引物只能將mev野毒株進行擴增，而mevb毒株和非mev毒株沒有擴增。表明本試驗設(shè)計的lamp-snp引物具有良好的特異性。用不同稀釋度的pt-mev-ns1作為模板，分別按照已經(jīng)建立lamp-snp反應(yīng)條件和pcr條件進行擴增，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，擴增的結(jié)果見圖2。由圖可見lamp-snp最低檢測量為10¹copies/ml，而pcr技術(shù)的最低檢測量為10²copies/ml。

從吉林省部分地區(qū)收集104份臨床糞便樣品并提取dna，采用lamp技術(shù)檢測出43份陽性臨床樣品。對43份陽性臨床樣品分別用pcr和lamp-snp技術(shù)進行檢測，部分檢測結(jié)果見圖3，符合率為100％。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所

<120>鑒別mev野毒株與mevb毒株的lamp引物組、試劑盒及方法

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>18

<212>dna

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