本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種細胞培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

細胞免疫治療是一種新興的腫瘤治療模式，是依靠自身免疫抗癌的新型治療方法。它從病人體內(nèi)采集免疫細胞，然后進行體外培養(yǎng)和擴增，再回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，來激發(fā)以及增強機體的自身免疫功能，從而達到治療腫瘤的目的。與手術(shù)、放療及化療對免疫損傷不同，細胞治療能大大提高患者的抗癌免疫力，清除手術(shù)治療不能觸及的血液、淋巴或轉(zhuǎn)移到其它組織中的癌細胞、甚至是休眠的癌細胞，相比之下治療更加徹底。

nk細胞即自然殺傷細胞(naturalkillercell，nk)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗風濕、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發(fā)生。其它幾個具有抗癌功能的細胞包括殺傷性t細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(dc)。由于巨噬細胞內(nèi)含有很多炎癥因子，目前還無法用于細胞治療。dc是一類免疫調(diào)節(jié)細胞，主要作用是抗原加工并呈遞給t細胞，再靠t細胞發(fā)揮抗癌作用。t細胞的抗癌作用需要再次激發(fā)才有效，只有經(jīng)dc活化后才能起作用t細胞初次遇到抗原時并無殺傷作用，而只是形成免疫記憶，只有再次遇到抗原后，才能激發(fā)出強有力的殺傷功能?，F(xiàn)在很多人用的cik中主要是經(jīng)細胞因子活化的t細胞。其實，未經(jīng)dc抗原呈遞、單獨靠細胞因子活化的殺傷t細胞的療效是非常有限的。與cik和dc相比，nk除了釋放細胞因子殺傷腫瘤細胞外，還可以通過抗體介導的細胞毒效應(adcc)和釋放穿孔素來殺傷細胞，具有更強的腫瘤殺傷能力。然而，與cik相比，目前用nk細胞治療的相對較少，其主要原因是nk細胞的制備較難。

目前，制備人nk細胞的方法主要有兩種。一是采用磁珠分離法，直接從pbmc中分離nk細胞。但由于nk細胞在pbmc中的比例很少，所得nk細胞的數(shù)目不多，只適用于小規(guī)模制備nk細胞及分析性研究。二是體外擴增法，用pbmc或者已經(jīng)分離的nk細胞，通過一些特殊細胞因子的刺激，使nk細胞在體外擴增。但是，至今大多體外擴增技術(shù)只能使nk細胞擴增幾十倍，且純度低、活性差、成本高，難以滿足臨床使用需求。

因此，研發(fā)一種能促進nk細胞大量增殖的培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明公開的一種細胞培養(yǎng)方法能有效解決體外擴增nk細胞時存在的擴增細胞量少的技術(shù)缺陷。

本發(fā)明公開了一種細胞培養(yǎng)方法。包括如下步驟：

1)分離外周血單個核細胞；

2)將步驟1)的分離外周血單個核細胞添加到含有血漿的活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第10天，含有血漿的活化培養(yǎng)基激活外周血單個核細胞活化；所述活化培養(yǎng)基包括：抗cd16單克隆抗體、il-2、抗壞血酸、tgf-β1、胸腺肽和無血清基礎培養(yǎng)基；

3)將增殖培養(yǎng)基添加到步驟2)中培養(yǎng)至第10天的外周血單個核細胞和含有血漿的活化培養(yǎng)基中繼續(xù)對所述外周血單個核細胞培養(yǎng)直至回收細胞，所述增殖培養(yǎng)基包括：il-1α、il-2、抗壞血酸、il-21、il-7、41-bbl和無血清基礎培養(yǎng)基。

其中，所述活化培養(yǎng)基對外周血單個核細胞的nk細胞進行活化。

其中，所述增殖培養(yǎng)基促進外周血單個核細胞的nk細胞快速增值。

其中，上述步驟2)將步驟1)的外周血單個核細胞在含有血漿的活化培養(yǎng)基培養(yǎng)時開始，第3、6、8天對所述外周血單個核細胞補充活化培養(yǎng)基，補充活化培養(yǎng)基時維持細胞密度為1×10⁶個/ml～2×10⁶個/ml，并維持自體血漿在活化培養(yǎng)基培養(yǎng)中的體積百分比為4％。

其中，上述步驟2)將步驟1)的外周血單個核細胞在含有血漿的活化培養(yǎng)基培養(yǎng)至第10天后進行步驟3)的操作，外周血單個核細胞在含有血漿的活化培養(yǎng)基培養(yǎng)至第8天能使外周血單個核細胞的nk細胞充分活化，有利于步驟3)所述增殖培養(yǎng)基使外周血單個核細胞的nk細胞時快速增值。

其中，所述血漿為自體血漿，所述自體血漿為步驟1)分離外周血單個核細胞的血液中的血漿。

其中，所述血漿為滅活血漿。

其中，所述步驟3)將增殖培養(yǎng)基添加到步驟2)中培養(yǎng)至第10天的外周血單個核細胞和含有血漿的活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至回收細胞，以步驟2)將步驟1)的外周血單個核細胞在含有血漿的活化培養(yǎng)基培養(yǎng)時開始計算，在培養(yǎng)的第12、14天補充增殖培養(yǎng)基，補充增殖培養(yǎng)基時維持細胞密度為1×10⁷個/ml～2×10⁷個/ml。

其中，所述的增值培養(yǎng)基能促進外周血單個核細胞的nk細胞快速增值。

作為優(yōu)選，所述血漿在活化培養(yǎng)基培養(yǎng)中的體積百分比為4％。

作為優(yōu)選，所述無血清基礎培養(yǎng)基為無血清rpmi1640培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選，所述活化培養(yǎng)基包括：

更為優(yōu)選，所述活化培養(yǎng)基包括：

本發(fā)明還提供了一種活化培養(yǎng)基制備方法，所述活化培養(yǎng)基由抗cd16單克隆抗體、il-2、抗壞血酸、tgf-β1和胸腺肽溶解于無血清基礎培養(yǎng)基后經(jīng)0.1μm濾膜過濾制得。

作為優(yōu)選，所述增殖培養(yǎng)基包括：

更為優(yōu)選，所述增殖培養(yǎng)基包括：

本發(fā)明還提供了一種增殖培養(yǎng)基制備方法，所述增殖培養(yǎng)基由il-1α、il-2、抗壞血酸、il-21、il-7和41-bbl溶解于無血清基礎培養(yǎng)基后經(jīng)0.1μm濾膜過濾制得。

本發(fā)明還公開了所述的細胞培養(yǎng)方法在促進外周血單個核細胞的nk細胞增殖中的應用。

本發(fā)明的目的針對現(xiàn)有技術(shù)中體外擴增nk細胞時存在的擴增細胞量少，且體外培養(yǎng)得到的nk細胞活性差的技術(shù)缺陷。因此，本發(fā)明采用全新的細胞因子組合，其中，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)方法中的活化培養(yǎng)基的il-2、tgf-β1能刺激nk細胞增殖；抗cd16單克隆抗體與nk細胞表面分子cd16結(jié)合，激活nk細胞，促進細胞因子合成；抗壞血酸抑制調(diào)節(jié)性t細胞增殖；胸腺肽促進il-2受體表達，增強il-2的作用；本發(fā)明的細胞培養(yǎng)方法中的增值培養(yǎng)基的il-21能增加nk細胞表面活性受體nkg2d的表達；41-bbl增加nk細胞表面活化受體互nkp46的表達，增強nk細胞的殺傷功能，與il-21協(xié)同作用，刺激nk細胞高倍擴增；il-7活化nk細胞，增強nk細胞對腫瘤細胞的殺傷能力。本發(fā)明開發(fā)了一種新的細胞培養(yǎng)方法，本發(fā)明公開的細胞培養(yǎng)方法在nk細胞增殖速率、nk細胞純度和nk細胞對腫瘤細胞的體外殺傷活性方面都有很大的提高，pbmc在體外培養(yǎng)培養(yǎng)至第16天時，nk細胞擴增數(shù)量比接種時的數(shù)量增加了600倍，體外培養(yǎng)的nk細胞純度達70％以上，而且還可增強nk細胞的對腫瘤細胞的體外殺傷活性，當nk細胞與腫瘤細胞在效靶比為10:1時，使其對腫瘤細胞的體外殺傷率達90％以上；此外，本發(fā)明公開的一種細胞培養(yǎng)方法，無需使用滅活的腫瘤細胞作為nk細胞的飼養(yǎng)層細胞，而且無需采用磁珠分離的方法從pbmc中分離出nk細胞，這能大大簡化了培養(yǎng)操作，減少培養(yǎng)成本。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示nk細胞增殖曲線；

圖2示第16天nk細胞流式表型；

圖3示第16天nk細胞對k562細胞的抑制率。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種細胞培養(yǎng)方法，用于解決現(xiàn)有體外擴增nk細胞時存在的擴增細胞量少的技術(shù)缺陷。

下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

其中，以下實施例所使用的試劑均為市售。

實施例1

配制活化培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基，步驟如下：

一、配制活化培養(yǎng)基

以無血清rpmi1640培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，往基礎培養(yǎng)基中加入抗cd16單克隆抗體、il-2、抗壞血酸、tgf-β1和胸腺肽，混勻，使抗cd16單克隆抗體、il-2、抗壞血酸、tgf-β1和胸腺肽在活化培養(yǎng)基中的終濃度分別為60ng/ml、250u/ml、2ng/ml、60ng/ml和2ng/ml。0.1μm濾膜過濾除菌，分裝后4-8攝氏度避光保存。

二、配制增殖培養(yǎng)基

以無血清rpmi1640培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，往基礎培養(yǎng)基中加入il-1α、il-2、抗壞血酸、il-21、il-7和41-bbl。混勻，使il-1α、il-2、抗壞血酸、il-21、il-7和41-bbl在無血清rpmi1640培養(yǎng)基的終濃度分別為50ng/ml、500u/ml、2ng/ml、60ng/ml、2ng/ml和10ng/ml。0.1μm濾膜過濾除菌，分裝后4-8攝氏度避光保存。

上述基礎培養(yǎng)基和細胞因子均為市售，其中基礎培養(yǎng)基為gibco無血清rpmi1640，其它細胞因子均購自sigma公司。

實施例2

細胞培養(yǎng)，步驟如下：

步驟一、分離外周血單個核細胞(pbmc)，步驟如下：

采集健康人外周血50ml，按照文獻報道的方法，使用淋巴細胞分離液(購自天津灝洋)分離外周血pbmc，收集分離液上層血漿(即自體血漿)并56℃滅火30min。小心吸取中間云霧層細胞即分離外周血單個核細胞pbmc，用生理鹽水洗滌2次。加入活化培養(yǎng)基重懸pbmc，并進行細胞計數(shù)。

步驟二、nk細胞的培養(yǎng)，步驟如下：

用實施例1制備的活化培養(yǎng)基調(diào)整pbmc密度為2×10⁶個/ml，并加入56℃滅活的自體血漿(實施例2中步驟一收集的血漿)，使自體血漿在活化培養(yǎng)基的體積百分比為4％。將pbmc的nk細胞和其培養(yǎng)基一并轉(zhuǎn)移到t175培養(yǎng)瓶中后置于37℃、5％co2濃度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

以外周血單個核細胞的nk細胞在含有血漿的活化培養(yǎng)基培養(yǎng)時開始計算，分別在細胞培養(yǎng)的第3、6、8天補充活化培養(yǎng)基，補充活化培養(yǎng)基時維持細胞密度為1×10⁶個/ml～2×10⁶個/ml，并維持自體血漿在活化培養(yǎng)基培養(yǎng)中的體積百分比為4％。

以外周血單個核細胞的nk細胞在含有血漿的活化培養(yǎng)基培養(yǎng)時開始計算，在第8天補充完活化培養(yǎng)基后，將nk細胞與活化培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)移到新的細胞培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的第10、12、14天對新的細胞培養(yǎng)袋中的nk細胞與活化培養(yǎng)基補充增殖培養(yǎng)基，快速增殖階段細胞密度增大，補充增殖培養(yǎng)基時維持細胞密度為1×10⁷個/ml～2×10⁷個/ml。在37℃、5％co2濃度的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至第16天，收集細胞。如圖1所示，培養(yǎng)至第16天時，nk細胞擴增數(shù)量比接種時的數(shù)量增加了600倍。

實施例3

收集培養(yǎng)至第16天的外周血單個核細胞，采用流式細胞儀檢測細胞的cd3-cd56+cd16+的比例情況。圖2為采用本發(fā)明方法培養(yǎng)獲得的第16天的nk細胞流式檢測結(jié)果。如結(jié)果所示，本發(fā)明所獲得的外周血單個核細胞的cd3-cd56+cd16+的比例達75％，說明經(jīng)過16天的培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的nk細胞純度(nk細胞占總細胞的百分比)高達75％。

實施例4

取對數(shù)生長期k562細胞，鋪至96孔細胞培養(yǎng)板，每個孔為5000個細胞。第二天每個孔分別加入nk細胞(實施例2培養(yǎng)獲得)，nk細胞與k562細胞以效靶比1:1、5:1和10:1的濃度共同培養(yǎng)4h,每個濃度3個平行孔。加入wst1細胞計數(shù)試劑盒中應用液繼續(xù)培養(yǎng)2小時，96孔細胞培養(yǎng)板放入酶聯(lián)儀檢測在450nm處吸光度od值，按公式計算細胞殺傷率：殺傷率(％)＝[1-(實驗組od值-nk對照od值)/靶細胞對照od值]×100％。如圖3所示，采用本發(fā)明方法培養(yǎng)獲得的第16天的nk細胞，nk細胞與k562細胞在效靶比為10:1時，對k562細胞的殺傷達90％。

綜上所述，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中體外擴增nk細胞時存在的擴增細胞量少的技術(shù)缺陷。本發(fā)明的目的在于研發(fā)一種能促進nk細胞大量增殖且不影響nk細胞活性的細胞培養(yǎng)方法。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。