本發(fā)明涉及一種分子信標探針，具體涉及一種快速檢測呼吸道流感病毒病原體的分子信標探針及試劑盒。
背景技術：
：常見的呼吸道流感病毒病原體有流感病毒a，流感病毒b，冠狀病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)和呼吸道腺病毒(adv)、博卡病毒、鼻病毒、腸道病毒等，其中流感病毒a，流感病毒b，呼吸道合胞病毒和呼吸道腺病毒最為常見，約占呼吸道疾病的病毒性病原體的50％。為了更加快速和靈敏檢測呼吸道病毒，合理使用各種抗生素和治療流感的新抗病毒藥物的使用，早期檢測和辨別感染病毒意義重大。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種快速檢測呼吸道流感病毒病原體的分子信標探針及試劑盒。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是：一種快速檢測呼吸道流感病毒病原體的分子信標探針，所述分子信標探針的堿基序列為：probeln：5'-ccctaccctcctgcacttgatattgtggatcctgggtaggg-3'，所述分子信標探針的5'端標記有熒光基團，3'端標記有淬滅基團。優(yōu)選的，所述熒光基團選自fam、fluorescein、joe、tet、hex、cyanine3、rox、texasred、cyanine5或cyanine5.5，所述淬滅基團選自bhq-1、bhq-2、bhq-2或dabcyl。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括上述的分子信標探針。優(yōu)選的，上述試劑盒還包括雜交液，每100ml所述雜交液包括以下組分：25ml的50*denhardtt's液，10ml的50*ssc，5ml的50*ssc，100ug/ml的變性鮭精dna，10g的硫酸葡聚糖。優(yōu)選的，所述分子信標探針的濃度為5pmol/ul。本發(fā)明還提供了一種檢測呼吸道流感病毒病原體的方法，該方法包括以下步驟：(1)按照b型流感病毒基因序列設計分子信標探針，該分子信標探針的堿基序列為5'-ccctaccctcctgcacttgatattgtggatcctgggtaggg-3'；(2)取口腔或鼻腔分泌物為檢測樣本，涂片并用固定液固定；(3)用雜交液將所述分子信標探針進行稀釋，然后與檢測樣本進行雜交；(4)在熒光顯微鏡下觀察結果。本發(fā)明檢測的原理為：具有獨特“發(fā)夾”空間結構的分子信標探針在未與靶序列結合時，分子信標呈“發(fā)夾”結構，有一環(huán)序列和一莖序列，其中環(huán)序列是與靶位點互補的堿基序列，而莖序列是與靶位點無關的互補序列；在探針的兩端分別標記有熒光基團和熒光猝滅基團，當探針處于發(fā)卡結構時，熒光基團和猝滅基團相鄰，產生能量共振轉移效應，使得熒光基團被猝滅，不能產生熒光信號，而當探針與靶位點結合時，發(fā)夾結構被打開，熒光基團和猝滅基團分開，產生熒光信號，通過熒光顯微鏡可以檢測到該熒光信號。本發(fā)明的分子信標探針能夠對呼吸道流感病毒病原體進行快速檢測，且檢測準確度高，靈敏度高。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。分子信標探針的合成：按照b型流感病毒基因序列設計分子信標探針，其中b型流感病毒基因序列為：tatcattgggatcctgcacttgatattgtggatccttgatcgtcttttcttcaaatgcatttatcgtcgccttaaatacggtttgaaaatagggccttctacggaaggggtacctgagtctatgagggaagagtaccggcaggaacagcagagtgctgtggatgttgacgatggtcattt由此合成的分子信標探針堿基序列為：probeln：5'fam-ccctaccctcctgcacttgatattgtggatcctgggtaggg-bhq13'。該分子信標是由堿基組成的頸環(huán)結構的特異序列，其中5'端標記的是fam，3'端標記的是bhq1，熒光基團的激發(fā)波長為494nm，發(fā)射波長為515nm。根據b型流感病毒基因序設計合成熒光標記寡核苷酸探針probelnc：5'-fam-tcctgcacttgatattgtggatcct-3'；利用上述分子信標探針probeln進行檢測：以已知的40例b型流感病毒感染者、50例健康人的鼻腔分泌物樣本作為檢測目標。分別收集他們的鼻腔分泌物為樣本，將樣本以1xpbs稀釋，5000rpm離心，收集沉淀物，加入10％福爾馬林(即1份甲醛溶液加9份水配制而成)250ul固定液固定5分鐘，以1xpbs500ul洗2次，最后3000rpm離心5分鐘，棄掉上清，將經熱變性的分子信標探針probeln以1xdna雜交液稀釋到5pmol/ul，加200ul使沉淀懸浮，42℃孵育15分鐘。滴加在載玻片，直接在熒光顯微鏡下觀察并照相，計算熒光顯色細胞。利用上述普通型熒光標記寡核苷酸探針probelnc進行檢測：以已知的40例b型流感病毒感染者、50例健康人的鼻腔分泌物樣本作為檢測目標。分別收集他們的鼻腔分泌物為樣本，將樣本以1xpbs稀釋，5000rpm離心，收集沉淀物，沉淀物中加入適量pbs，調節(jié)細胞濃度到含纖毛柱狀上皮細胞1.0×106/ml。微量加樣器吸取上述纖毛柱狀上皮細胞懸液20ul，點于預先用4℃丙酮浸泡過的載玻片上。室溫下空氣干燥后4℃丙酮浸泡固定10分鐘。將熒光標記寡核苷酸探針probelnc以1xdna雜交液稀釋到5pmol/ul，75℃變性5分鐘，滴加于玻片，加蓋玻片并封閉，然后在50℃下孵育45～60分鐘；將玻片依次用洗液a(2xssc、50％甲酰胺)、洗液b(10mmpbsph8.0、0.1％nonidetp-40)各清洗2次。在熒光顯微鏡下觀察結果。分子信標和普通熒光標記寡核苷酸探針實驗結果的判斷標準相同均為：在60倍油浸物鏡下對標本進行多視野觀察并對每視野中發(fā)出熒光的細胞進行計數(shù)并累加，按如下判斷標準：標本陰性(-)：連續(xù)觀察100個不同視野，未發(fā)現(xiàn)有發(fā)出熒光的細胞；標本陽性(+)：連續(xù)觀察100個不同視野，發(fā)出熒光的細胞數(shù)大于1個/100視野，進行實驗結果判定。按上述判定標準進行判斷，實驗結果如下表：已知標本(金標準)分子信標探針熒光寡核苷酸探針樣品數(shù)+++37++-3---45--+5注：上述列表中，已知標本(金標準)：已知50例健康人樣本作為陰性金標準，已知40例b型流感病毒感染者樣本作為陽性金標準；“-”：表示陰性即未檢出有b型流感病毒；“+”：表示陽性即檢出有b型流感病毒。以已知50例健康人、40例b型流感病毒樣本作為金標準，分子信標的陽性檢出率為(37+3)/(37+3)x100％＝100％，熒光標記寡核苷酸探針的陽性檢出率為37/(37+3)x100％＝92.5％；分子信標的假陽性檢出率為0/(45+5)x100％＝0％，熒光標記寡核苷酸探針的假陽性檢出率為5/(45+5)x100％＝10％。由實驗結果可見，分子信標探針優(yōu)于熒光寡核苷酸探針。每100ml上述dna雜交液包括以下組分：25ml的50*denhardtt's液，10ml的50*ssc，5ml的50*ssc，100ug/ml的變性鮭精dna，10g的硫酸葡聚糖。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變形，這些改進和變形也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12