一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種雙光子熒光探針及其制備方法和用途，具體地說是一種基于咔唑的雙光子熒光探針及其制備方法和用途，以實現(xiàn)雙光子成像定性檢測細(xì)胞線粒體內(nèi)的hso3^-，具有選擇性專一、靈敏度高、檢測濃度低的優(yōu)點。

二、

背景技術(shù)：

so2是重要的大氣污染來源之一，還會在生理濃度下產(chǎn)生生物效應(yīng)。氣態(tài)so2能轉(zhuǎn)化成其在中性水溶液中的亞硫酸鹽/亞硫酸氫鹽(so3^2-/hso3^-＝1:3)衍生物。內(nèi)源性so2及其衍生物幾乎參與各種生理過程，包括血管舒張，降壓作用，血管平滑肌的抑制和心臟通道功能的調(diào)節(jié)。然而亞硫酸鹽的生物學(xué)作用知之甚少，因為so2及其衍生物不能在體內(nèi)直接檢測到。用于測定生物樣品中亞硫酸鹽/亞硫酸氫鹽的最常用方法，即高效液相色譜(hplc)，需要復(fù)雜的樣品處理，不適合實時和長期檢測生物亞硫酸鹽/亞硫酸氫鹽。因此，需要開發(fā)一種快速，便捷且可靠的生物體中亞硫酸鹽/亞硫酸氫鹽水平的實時檢測方法。

線粒體是哺乳動物細(xì)胞中至關(guān)重要的一個細(xì)胞器，它在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中(細(xì)胞程序性死亡)和某些疾病如癌癥細(xì)胞凋亡異常反應(yīng)特征中起重要作用。線粒體是細(xì)胞內(nèi)rss(活性硫物質(zhì))和ros(活性氧)的主要來源。此外，so2作為活性硫物質(zhì)之一，具有重要的生理作用，因此監(jiān)測線粒體中的so2衍生物是特別有意義和有價值的。

熒光化學(xué)探針由于具有靈敏度高、選擇性好、易合成、廉價以及良好的生物應(yīng)用等特點，已成為生命科學(xué)和環(huán)境科學(xué)中主要的檢測工具。目前，大部分檢測細(xì)胞中hso3^-的熒光探針均為單光子熒光探針，單光子熒光探針一般具有自熒光干擾大，激發(fā)波長小導(dǎo)致對細(xì)胞的光毒性大，容易發(fā)生熒光自淬滅等缺點。與單光子熒光探針相比，雙光子熒光探針具有很多明顯的優(yōu)點，如：細(xì)胞光毒性小，不會引起熒光自淬滅，時間空間分辨率高，組織滲透深度大。因而雙光子熒光探針已經(jīng)作為科學(xué)家們研究的一個重要課題。咔唑基團(tuán)不僅具有大的共軛體系和共平面性能，而且具有良好的光穩(wěn)定性、低毒性，因此，咔唑可以成為一個優(yōu)秀的雙光子熒光團(tuán)，通過結(jié)構(gòu)修飾應(yīng)用于雙光子成像定性檢測細(xì)胞線粒體內(nèi)的hso3^-。

三、

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種基于咔唑的雙光子熒光探針及其制備方法和用途，所要解決的技術(shù)問題是通過分子設(shè)計得到一種合適的熒光探針結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)雙光子成像定性檢測細(xì)胞線粒體內(nèi)的hso3^-。本發(fā)明熒光探針具有選擇性專一、靈敏度高、檢測濃度低的優(yōu)點，細(xì)胞毒性測試表明本發(fā)明熒光探針對細(xì)胞幾乎沒有毒性作用。

本發(fā)明基于咔唑的雙光子熒光探針，簡記為mbcb，是以咔唑為母體，其結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明基于咔唑的雙光子熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

將3-苯并噻唑-6-甲?；?n-乙基咔唑(0.53g，1.5mmol)和15ml甲醇加入100ml圓底燒瓶中，加熱攪拌至原料溶解，隨后加入2,3-二甲基苯并噻唑-3-鎓碘化物(0.44g，1.5mmol)，并滴加2-3滴哌啶，70℃下回流反應(yīng)4h；反應(yīng)結(jié)束后靜置冷卻，分層后過濾得到紅色粗產(chǎn)物，用二氯甲烷：甲醇＝4:1(v/v)的混合溶劑重結(jié)晶得到目標(biāo)產(chǎn)物0.63g，產(chǎn)率67％。

本發(fā)明雙光子熒光探針mbcb的合成過程如下：

本發(fā)明雙光子熒光探針的用途，是在檢測細(xì)胞中線粒體內(nèi)的hso3^-時作為檢測試劑的應(yīng)用，檢測方法如下：

將本發(fā)明雙光子熒光探針溶于dmso中制得1mm的母液，取100μl的該母液于10ml容量瓶中，再用甘油:pbs＝2:8的溶劑定容，配制成10μm的檢測試劑。檢測試劑分別在316nm和480nm有吸收峰；加入20倍當(dāng)量的hso3^-后，mbcb位于316nm和480nm的吸收峰逐漸降低，且在306nm和351nm出現(xiàn)兩個新的吸收峰(圖1)。10μm檢測試劑加入20倍當(dāng)量的各種陰離子、活性氧物種和氨基酸后(圖2a)，檢測375-675nm范圍內(nèi)的熒光光譜變化，可以看出mbcb僅對hso3^-和so3^2-有明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，具有專一性響應(yīng)；當(dāng)隨著hso3^-(0-500μm)的不斷加入，可以觀察到600nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸減弱，且434nm處的熒光逐漸增強(qiáng)。在加入20倍當(dāng)量的hso3^-后，熒光強(qiáng)度趨于飽和(圖2b)。10μm檢測試劑在加入hso3^-的濃度范圍為0-6μm時，其熒光強(qiáng)度與hso3^-的濃度之間有很好的線性關(guān)系，檢測濃度低至2.67×10^-10m(圖3)。

本發(fā)明雙光子熒光探針的結(jié)構(gòu)簡單，易于合成，利用schiffbase反應(yīng)將作用位點和熒光基團(tuán)通過c＝n鍵連接為一整體。本發(fā)明雙光子熒光探針以熒光顏色的變化來檢測hso3^-，與hso3^-作用后，在紫外燈下，肉眼就可以看出其熒光變化，熒光顏色從紅色變成藍(lán)光，操作簡單，快速靈敏。本發(fā)明雙光子熒光探針對hso3^-具有專一性熒光響應(yīng)，靈敏度高，檢測濃度低。

四、附圖說明

圖1是10μm熒光探針加入20倍當(dāng)量的hso3^-前后的紫外吸收光譜圖。

圖2是10μm熒光探針加入20倍當(dāng)量的各種金屬離子、陰離子、活性氧物種和氨基酸前后的熒光光譜圖(2a)。10μm熒光探針加入hso3^-(0-500μm)的熒光滴定光譜圖(2b)，2b插圖是熒光最大發(fā)射峰強(qiáng)度i434與hso3^-濃度之間的散點圖。

圖3是10μm熒光探針在加入hso3^-(0-6μm)后的熒光強(qiáng)度與濃度的線性關(guān)系圖。

圖4是10μm熒光探針的雙光子吸收截面數(shù)值。

圖5是在不同含量(0μm、5μm、10μm、15μm)的熒光探針分子的作用下的mcf-7細(xì)胞存活率圖。

圖6是10μm熒光探針分子在mcf-7細(xì)胞中加入100μmhso3^-前后的雙光子熒光成像照片。在740nm激發(fā)下，藍(lán)色通道中熒光發(fā)射收集范圍420-460nm，紅色通道中熒光發(fā)射收集范圍是570-610nm。圖a、b是只加10μm熒光探針mbcb的雙通道成像，圖e、f是加熒光探針10μmmbcb和100μmhso3^-的雙通道成像，圖d、h是mcf-7細(xì)胞的明場，圖c是a、b的疊加，圖g是e、f的疊加。)

圖7是10μm熒光探針分子在mcf-7細(xì)胞中加入100μmhso3^-后的線粒體定位成像照片。其中圖a，b分別為綠色通道和紅色通道下的熒光共聚焦成像。圖c是mcf-7細(xì)胞的明場，圖d是a、b、c的疊加，圖e是圖d中單個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度剖面圖，圖f是mbcb和mitochondria@trackerredfm強(qiáng)度的相關(guān)性分布圖，重疊系數(shù)為0.93。

圖8是10μm熒光探針分子在活體斑馬魚中加入100μmhso3^-前后的雙光子熒光成像照片。在740nm激發(fā)下，藍(lán)色通道中熒光發(fā)射收集范圍420-460nm，紅色通道中熒光發(fā)射收集范圍是570-610nm。圖a、b是只加10μm探針mbcb的雙通道成像，圖d、e是加探針10μmmbcb和100μmhso3^-的雙通道成像，圖c是a、b與明場的疊加，圖f是c、d與明場的疊加。)

五、具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實施例1：熒光探針分子mbcb的合成

將3-苯并噻唑-6-甲?；?n-甲基咔唑(0.53g，1.5mmol)加入100ml圓底燒瓶中，加入15ml甲醇，加熱攪拌至原料溶解后，再加入2,3-二甲基苯并噻唑-3-鎓碘化物(0.44g，1.5mmol)，并滴加2-3滴哌啶，70℃下回流反應(yīng)4h；反應(yīng)結(jié)束后靜置冷卻，分層后過濾得到紅色粗產(chǎn)物，用二氯甲烷：甲醇＝4:1(v/v)的混合溶劑重結(jié)晶兩次得到目標(biāo)產(chǎn)物0.63g，產(chǎn)率67％。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.22(s,1h),9.04(s,1h),8.42(m,2h),8.30–8.19(m,3h),8.15(t,j＝12.6hz,2h),8.07(d,j＝8.1hz,1h),7.89(m,3h),7.79(t,j＝7.6hz,1h),7.57(t,j＝7.4hz,1h),7.47(t,j＝7.4hz,1h),4.60(q,j＝6.6hz,2h),4.41(s,3h),1.42(t,j＝7.0hz,3h).δ171.87,167.93,150.04,142.82,142.02,141.94,134.29,129.18,128.06,127.41,126.58,126.21,125.96,125.19,125.09,124.07,123.28,122.96,122.78,122.50,122.36,122.23,119.60,116.49,110.81,110.64,110.45,37.76,36.16,13.87.

實施例2：熒光探針分子的光譜測試

將本發(fā)明雙光子熒光探針溶于dmso中制得1mm的母液，取100μl的該母液于10ml容量瓶中，再用甘油:pbs＝2:8的溶劑定容，配制成10μm的檢測試劑。檢測試劑分別在316nm和480nm有吸收峰；加入20倍當(dāng)量的hso3^-后，mbcb位于316nm和480nm的吸收峰逐漸降低，且在306nm和351nm出現(xiàn)兩個新的吸收峰(圖1)。10μm檢測試劑加入20倍當(dāng)量的各種陰離子、活性氧物種和氨基酸后(圖2a)，檢測375-675nm范圍內(nèi)的熒光光譜變化，可以看出mbcb僅對hso3^-和so3^2-有明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象，具有專一性響應(yīng)；當(dāng)隨著hso3^-(0-500μm)的不斷加入，可以觀察到600nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸減弱，且434nm處的熒光逐漸增強(qiáng)。在加入20倍當(dāng)量的hso3^-后，熒光強(qiáng)度趨于飽和(圖2b)。10μm檢測試劑在加入hso3^-的濃度范圍為0-6μm時，其熒光強(qiáng)度與hso3^-的濃度之間有很好的線性關(guān)系，檢測濃度低至2.67×10^-10m(圖3)。

實施例3：熒光探針分子的雙光子性能測試

利用雙光子誘導(dǎo)熒光測量技術(shù)，測試熒光探針分子(mbcb)的雙光子吸收截面，從圖4可以看出，雙光子激發(fā)波長在740nm時，熒光探針分子的最大吸收截面是138gm。說明探針可以應(yīng)用于雙光子生物成像。

實施例4：細(xì)胞毒性測試

mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)實驗是根據(jù)已報道的文章操作進(jìn)行細(xì)胞毒性測試。分別在同一批細(xì)胞中加入0，5，10，15的熒光探針分子，條件是在37℃、含5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時，根據(jù)細(xì)胞存活度的公式：細(xì)胞存活率％＝od570(樣品)/od570(對照組)×100，可算得細(xì)胞存活率(圖5)。從圖6中我們可以看出，濃度為10μm時，細(xì)胞存活率還有93％左右，當(dāng)探針濃度達(dá)到15μm時，細(xì)胞存活率仍然有約88％，說明了本發(fā)明熒光探針分子對細(xì)胞無明顯毒性作用，因此可以用來檢測細(xì)胞中線粒體內(nèi)的hso3^-。

實施例5：細(xì)胞成像測試

mcf-7細(xì)胞由deme(invitrogen)培養(yǎng)液培養(yǎng)，成像前一天，mcf-7細(xì)胞放于玻底培養(yǎng)皿中，成像時mcf-7細(xì)胞和10μm的熒光探針mbcb的dmso溶液于37℃、含5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育0.5小時，用中性的pbs緩沖溶液或培養(yǎng)液充分洗滌后，用雙光子熒光共聚焦成像，420-460nm通道熒光微弱(圖6a)，570-610nm通道有明顯熒光(圖6b)。向上述含熒光探針的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入(100μm)hso3^-，在37℃、含5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育0.5小時，用中性的pbs緩沖溶液或培養(yǎng)液充分洗滌后，再進(jìn)行雙光子熒光共聚焦成像，420-460nm通道內(nèi)熒光明顯增強(qiáng)(圖6d)，570-610nm通道內(nèi)熒光減弱(圖6e)。圖d、h是mcf-7細(xì)胞的明場，圖c是a、b的疊加，圖g是e、f的疊加。從圖6中可以看出，探針可用于細(xì)胞內(nèi)hso3^-的雙光子熒光成像。

實施例6：細(xì)胞定位測試

mcf-7細(xì)胞由deme(invitrogen)培養(yǎng)液培養(yǎng)，成像前一天，mcf-7細(xì)胞放于激光共聚焦皿中，成像時mcf-7細(xì)胞和10μm的熒光探針mbcb的dmso溶液于37℃、含5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育0.5小時，用中性的pbs緩沖溶液洗滌3次后，再往培養(yǎng)皿中加入0.5μm商品化線粒體染色劑mitochondria@trackerredfm溶液繼續(xù)孵育0.5小時，用中性的pbs緩沖溶液洗滌3次后，再往培養(yǎng)皿中加入100μmhso3^-溶液繼續(xù)孵育0.5小時，用中性的pbs緩沖溶液洗滌3次后，用雙光子熒光共聚焦成像，設(shè)置綠色通道tracker1，激發(fā)波長為740nm，發(fā)射波段為420-460nm，這個通道用來接受探針分子mbcb加入hso3^-后發(fā)射的熒光。設(shè)置紅色通道tracker2，激發(fā)波長為579nm，發(fā)射波長為580-620nm，這個通道用來接收商品化線粒體染色劑mitochondria@trackerredfm發(fā)射的熒光。其中圖a，b分別為綠色通道和紅色通道下的熒光共聚焦成像。圖c是mcf-7細(xì)胞的明場，圖d是a、b、c的疊加，圖e是圖d中單個細(xì)胞的熒光強(qiáng)度剖面圖，圖f是mbcb和mitochondria@trackerredfm強(qiáng)度的相關(guān)性分布圖，重疊系數(shù)為0.93。從圖7可以看出，mbcb絕大多數(shù)定位在線粒體內(nèi)，可用于細(xì)胞線粒體內(nèi)hso3^-的雙光子熒光成像和定性檢測。

實施例7：斑馬魚成像測試

25℃條件下，將兩條5天的斑馬魚分別置于滅菌的ph為7.4的10mmpbs緩沖溶液中培養(yǎng)。向其中一條斑馬魚中加入10μm探針培養(yǎng)0.5小時，用滅菌的ph為7.4的10mmpbs緩沖溶液清洗3遍，最后將斑馬魚置于蓋玻片上并用麻醉劑ms-222固定好。向另一條斑馬魚中加入100μmhso3^-培養(yǎng)0.5小時，用滅菌的ph為7.4的10mmpbs緩沖溶液清洗3遍，再加入10μm探針培養(yǎng)0.5小時，用滅菌的ph為7.4的10mmpbs緩沖溶液清洗3遍，最后將斑馬魚置于蓋玻片上并用麻醉劑ms-222固定好。將它們分別進(jìn)行雙光子熒光共聚焦成像實驗。在740nm激發(fā)下，藍(lán)色通道中熒光發(fā)射收集范圍420-460nm，紅色通道中熒光發(fā)射收集范圍是570-610nm。圖a、b是只加10μm探針mbcb的雙通道成像，藍(lán)色通道中熒光微弱，紅色通道有明顯熒光。圖d、e是加探針10μmmbcb和100μmhso3^-的雙通道成像，藍(lán)色通道中熒光明顯增強(qiáng)，紅色通道中熒光減弱。圖c是a、b與明場的疊加，圖f是d、e與明場的疊加。)從圖8可以看出，mbcb可用于活體斑馬魚中hso3^-的雙光子熒光成像和定性檢測。