本發(fā)明涉及土壤中微生物基因與無機(jī)化學(xué)物質(zhì)提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于提取土壤中的微生物基因與無機(jī)化學(xué)物質(zhì)的試管及方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有的土壤分離技術(shù)需將土壤用水稀釋后取上清，通過涂平板、劃線的方法進(jìn)行單個微生物的培養(yǎng)分離鑒定。此技術(shù)只能分離鑒定出少部分常見微生物，并不能鑒定出所有微生物，因此很難反應(yīng)土壤的整體狀況。若要真實(shí)地反應(yīng)土壤中存在的微生物，我們需要用新的方法檢測到更加全面的微生物種類，這樣我們所得到的信息才能更好地說明土壤的狀態(tài)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對以上缺陷，本發(fā)明提供一種試管，能夠從土壤中分離出更加全面的微生物種類以及無機(jī)化學(xué)物質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種用于提取土壤中的微生物基因與無機(jī)化學(xué)物質(zhì)的試管，包括：位于底部的第二試管部和置于所述第二試管部上方的第一試管部，以及位于所述第一試管部和第二試管部之間的連接部；所述第一試管部內(nèi)設(shè)置有第一濾膜，其孔徑為80-120微米；所述第二試管部內(nèi)設(shè)置有第二濾膜裝置，其孔徑為0.20-0.60微米。一種利用所述試管來提取土壤中的微生物基因的方法，包括以下步驟：1)采集土壤樣品；2)將土壤樣品溶于水，然后使得所獲得的土壤水溶液通過所述試管進(jìn)行過濾；3)進(jìn)行土壤微生物的提取，基因提取的方法可以包括珠磨法(beadbeating)，化學(xué)裂解法等等。其中，所述珠磨法包括以下步驟：i)收集所述第二濾膜上的微生物，將微生物溶于5ml培養(yǎng)基，37℃過夜震蕩培養(yǎng)；ii)離心收集菌體，用0.5ml無菌水重懸，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中；iii)離心收集菌體，加入200ul裂解緩沖液重懸；iv)加入0.3g玻璃珠，200ul苯酚/氯仿/異戊醇，高速震蕩3分鐘；vi)加入200ulte緩沖液，快速震蕩30s，然后高速離心5分鐘；vii)將水相轉(zhuǎn)移至另一個干凈1.5ml離心管中，加入1ml無水乙醇顛倒混勻；vii)高速離心3分鐘，去上清，沉淀用0.4mlte緩沖液溶解；viii)加入30ul1mg/ml的rna酶a，37℃孵育5分鐘；ix)加入10ul4m乙酸銨及1ml無水乙醇，混勻后高速離心3分鐘；x)沉淀干燥后用100ulte緩沖液溶解即得土壤微生物dna。一種利用所述試管來提取土壤中無機(jī)化學(xué)物質(zhì)的方法，包括：1)采集土壤樣品；2)將土壤樣品溶于水，然后使得所獲得的土壤水溶液通過所述試管進(jìn)行過濾；3)收集所述第二試管部中的無機(jī)物溶液，進(jìn)行土壤中無機(jī)化學(xué)物質(zhì)的檢測，由此得到土壤中的無機(jī)化學(xué)物質(zhì)。經(jīng)由本發(fā)明，能夠從土壤中分離出更加全面的微生物種類以及無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，并且通過dna測序的方法來鑒定微生物的類別，以此來判斷土壤中微生物含量及種類的變化，所得到的信息也能夠更好地說明土壤的狀態(tài)。附圖說明下面根據(jù)附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1為本發(fā)明的用于提取土壤中的微生物基因與無機(jī)化學(xué)物質(zhì)的試管的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中：1、第一試管部；2、連接部；3、第二試管部；4、第一濾膜；5、第二濾膜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。如圖1所示的用于提取土壤中的微生物基因與無機(jī)化學(xué)物質(zhì)的試管，包括：位于底部的第二試管部3和置于第二試管部上方的第一試管部1，以及位于第一試管部1和第二試管部3之間的連接部2；第一試管部1內(nèi)設(shè)置有第一濾膜4，其孔徑為80-120微米；第二試管部3內(nèi)設(shè)置有第二濾膜5，其孔徑為0.20-0.60微米。第一試管部1、第二試管部3的直徑可以相同，亦可以不同，優(yōu)選為相同。第一試管部1、第二試管部3的形狀沒有特別的限制，但是優(yōu)選為圓柱形。連接部2的直徑小于第一試管部1的直徑以及第二試管部3的直徑。連接部2與第一試管部1和第二試管部3二者之間的連接可以通過一個直徑逐漸變大的部分來實(shí)現(xiàn)。第二試管部3的底部可以是平的，或者可以是u形或v形。第一濾膜4和第二濾膜5的邊緣可以通過加熱、超聲或高頻熱合等技術(shù)來固定在第一試管部1的內(nèi)壁上和第二試管部3的內(nèi)壁上。所述第一濾膜和第二濾膜可以是聚氨酯膜、聚碳酸酯膜等等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)、根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)來適當(dāng)?shù)倪x擇。使用時，首先將土壤樣品溶于水，然后使土壤水溶液通過試管。第一濾膜4的孔徑為80-120微米，優(yōu)選為100微米。由于絕大部分土壤微生物直徑都遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于100微米，并且土壤中的大塊固體物質(zhì)直徑都遠(yuǎn)大于100微米，因此，第一濾膜4可以將土壤中固體物質(zhì)攔截，使微生物的水溶液通過。流出第一濾膜4的微生物水溶液將經(jīng)由連接部2流入第二濾膜5。第二濾膜5的孔徑為0.20-0.60微米，優(yōu)選為0.45微米。由于微生物直徑一般大于0.2微米，再加上濾膜的阻擋作用和靜電吸附，0.45微米的濾膜足以攔截大多數(shù)微生物。從第二濾膜5中流出的則是直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.45微米的無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，例如硅鹽、鈣鹽、氧化鋁、氧化鎂等。這樣通過兩次過濾，土壤中的大塊固體物質(zhì)、微生物、無機(jī)化學(xué)物質(zhì)即被分開。提取土壤中的微生物基因時，首先采集土壤樣品，然后將土壤樣品溶于水，接著使得所獲得的土壤水溶液通過所述試管進(jìn)行過濾，之后收集第二濾膜5上的微生物，接下來則開始提取土壤中的微生物基因。基因檢測的方法可以采用珠磨法(beadbeating)，具體包括如下步驟：(1)將收集到的微生物溶于5ml培養(yǎng)基，37℃過夜震蕩培養(yǎng)；(2)離心收集菌體，用0.5ml無菌水重懸，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中；(3)離心收集菌體，加入200ul裂解緩沖液重懸；(4)加入0.3g玻璃珠，200ul苯酚/氯仿/異戊醇，高速震蕩3分鐘；(5)加入200ulte緩沖液，快速震蕩30s，然后高速離心5分鐘；(6)將水相轉(zhuǎn)移至另一個干凈1.5ml離心管中，加入1ml無水乙醇顛倒混勻；(7)高速離心3分鐘，去上清，沉淀用0.4mlte緩沖液溶解；(8)加入30ul1mg/ml的rna酶a，37℃孵育5分鐘；(9)加入10ul4m乙酸銨及1ml無水乙醇，混勻后高速離心3分鐘；(10)沉淀干燥后用100ulte緩沖液溶解即得土壤微生物dna。將得到的微生物dna中加入dna穩(wěn)定劑。dna穩(wěn)定劑可用于運(yùn)輸或保存的dna包括基因組dna、質(zhì)粒dna、寡合苷酸等。廣泛運(yùn)用于室溫生物樣品庫建設(shè)、司法實(shí)踐、臨床診斷研究、學(xué)術(shù)研究、普通實(shí)驗(yàn)室dna保存等等。需要使用dna時，只需加水或緩沖液到基質(zhì)中，即可在數(shù)分鐘內(nèi)復(fù)效樣品。將加有dna穩(wěn)定劑的微生物dna送入生物公司測序，即可獲得土壤微生物的種類及數(shù)量，因此我們可以通過微生物來得知土壤的狀態(tài)。提取土壤中無機(jī)化學(xué)物質(zhì)時，收集第二試管部3中的無機(jī)物溶液，進(jìn)行土壤中無機(jī)化學(xué)物質(zhì)的檢測，由此可以更加全面的反映土壤狀態(tài)。相比普通的平板劃線培養(yǎng)，本發(fā)明通過具有兩個濾膜的二聯(lián)管式的試管，可以簡單快速分離微生物與無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，獲得種類更加全面的微生物種類。平板劃線分離法是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，然后將單菌落作為微生物的純種進(jìn)行研究。但很多時候這種單菌落并非都由單個細(xì)胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種，十分費(fèi)事費(fèi)力。此外，自然界中很多微生物是無法在人工條件下進(jìn)行培養(yǎng)的，因此用平板劃線法鑒定出的微生物種類是很不準(zhǔn)確的。本發(fā)明通過具有兩個濾膜的二聯(lián)管式的試管，不僅可以簡單快速分離微生物與無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，并且鑒定獲得種類更加全面的微生物種類。本專利與平板劃線法的實(shí)驗(yàn)對比首先按照傳統(tǒng)平板劃線法配置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，配方如下：表1牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方表(ph7.4-7.6)試劑牛肉膏蛋白胨nacl瓊脂水用量3.0g10.0g5.0g1.2％1000ml分別取北京市海淀區(qū)的農(nóng)業(yè)用地土壤、林業(yè)用地土壤與城市街道旁綠化帶土壤。每個地區(qū)取三個地點(diǎn)采樣，用本專利的方法和平板劃線法分別處理，檢測其中微生物的種類，結(jié)果如下表2：表2其中，在平板劃線法中，農(nóng)業(yè)用地土壤中檢測出：葡萄球菌，大腸桿菌、普通變形桿菌以及產(chǎn)氣莢膜桿菌；林業(yè)用地土壤檢測出：葡萄球菌，大腸桿菌、普通變形桿菌以及枯草芽孢桿菌；城市街道旁綠化帶土壤檢測出：葡萄球菌，銅綠假單胞菌、普通變形桿菌以及產(chǎn)氣莢膜桿菌。在本發(fā)明的方法中，各種土壤樣品中均檢測出十多種的微生物種類，包括細(xì)菌、放線菌和真菌等，例如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、痢疾桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、綠彎菌、酸桿菌、沙門菌、志賀菌、鏈霉菌屬、若卡菌屬、小單孢菌屬、曲霉屬等等。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本新型試管法能夠鑒定出的微生物種類遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)的平板劃線法，可見該專利有巨大的優(yōu)越性。上述具體實(shí)施方式為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不能對本發(fā)明進(jìn)行限定，其他的任何未背離本發(fā)明的技術(shù)方案而所做的改變或其它等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12