本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

egf是繼神經(jīng)生長(zhǎng)因子之后發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)生長(zhǎng)因子，1959年由chone首先從小鼠領(lǐng)下腺中分離出來(lái)，因?yàn)槟軌虼龠M(jìn)小鼠門齒的萌出及眼瞼睜開(kāi)，最初被稱為“齒瞼因子”。隨后發(fā)現(xiàn)這種多肽能夠促進(jìn)表皮生長(zhǎng)，又將其命名為表皮生長(zhǎng)因子(即小鼠表皮生長(zhǎng)因子，megf)121。1975年gergoyr從人尿中提取出一種具有抑制胃酸分泌的物質(zhì)稱為尿抑胃素(urogastrone)，后來(lái)證實(shí)尿抑胃素即人egf(hegf)。

hegf含有53個(gè)氨基酸殘基，分子量為6200da，沉降系數(shù)1.255，等電點(diǎn)ph4.7，含3個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，是多膚生長(zhǎng)因子中最小的一個(gè)。相對(duì)于其它多膚類物質(zhì)，egf對(duì)酸和熱均較穩(wěn)定，是已知的最穩(wěn)定的蛋白多肽之一。hegf系一單鏈多膚，圓二色譜研究表明，hegf沒(méi)有α螺旋，β片層結(jié)構(gòu)占22％。在整個(gè)hegf分子中，主要折疊為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：1-32氨基酸殘基區(qū)域?yàn)閚-端結(jié)構(gòu)域，33-53氨基酸殘基區(qū)域?yàn)閏-端結(jié)構(gòu)域。其中22-32殘基區(qū)和33-53殘基區(qū)直接參與egf與其受體的結(jié)合，前者起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，后者起穩(wěn)定作用。

mj活性肽含有21個(gè)氨基酸，主要是非極性氨基酸，極性氨基酸比率不到20％。非極性活性區(qū)域能夠穩(wěn)定hegf的表達(dá)，以及提高表達(dá)后的穩(wěn)定性；加在n端，可以發(fā)揮信號(hào)肽的作用，迅速將hegf引導(dǎo)至細(xì)胞表面，與egfr受體結(jié)合。

hegf能促進(jìn)燒傷、創(chuàng)傷及外科傷的愈合，在燒傷、創(chuàng)傷、皮膚和角膜移植、外傷性皮膚潰瘍等治療中有重要作用。egf也是某些化妝品的添加劑，具有較大的市場(chǎng)價(jià)值。目前利用原核系統(tǒng)表達(dá)重組hegf(rhegf)的主要弊端是表達(dá)量較低，生物活性不高，真核表達(dá)周期長(zhǎng)，操作繁瑣，成本高等缺點(diǎn)很難規(guī)模化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有原核系統(tǒng)表達(dá)重組hegf(rhegf)表達(dá)量較低、生物活性不高、操作繁瑣、成本高的技術(shù)問(wèn)題，提供一種人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列及其制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)方案：人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列，如seqidno.1所示。

上述人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取人表皮生長(zhǎng)因子hegf基因；

步驟2，基因優(yōu)化：對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子hegf基因的編碼區(qū)進(jìn)行大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性的基因優(yōu)化得到優(yōu)化序列，如seqidno.2所示，優(yōu)化序列編碼的氨基酸與人表皮生長(zhǎng)因子hegf基因編碼形成的氨基酸序列一致；

步驟3，基因重組：將優(yōu)化序列與mj活性肽核苷酸序列，如seqidno.3所示，進(jìn)行重組，得到人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列；

步驟4，添加酶切位點(diǎn)：在人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列的5’端添加一種內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在重組序列的3’端添加另一種內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，得到合成序列；

步驟5，基因合成：對(duì)得到的合成序列進(jìn)行全基因合成。

進(jìn)一步地，在步驟3中，重組序列的5’端添加ndei酶切位點(diǎn)，重組序列的3’端添加xhoi酶切位點(diǎn)。

含有上述人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列的質(zhì)粒。

進(jìn)一步地，所述質(zhì)粒為pet-30a質(zhì)粒。

進(jìn)一步地，上述人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列插入到pet-30a質(zhì)粒的ndei酶切位點(diǎn)和xhoi酶切位點(diǎn)之間。

含有上述人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列的原核生物。

進(jìn)一步地，所述原核生物為大腸桿菌。

上述人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列表達(dá)得到的人表皮生長(zhǎng)因子hegf在制備護(hù)膚品中的應(yīng)用。

有益效果：利用本發(fā)明的人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列可實(shí)現(xiàn)原核細(xì)菌宿主工程菌egf蛋白的高表達(dá)，并且具有較高的生物學(xué)活性：1、其表達(dá)量約占總蛋白的30％左右，以包涵體的形式表達(dá)，復(fù)性成功的前體下包涵體處理相對(duì)較容易；2、通過(guò)純化后，得到純度在95％左右的egf小肽，并且依據(jù)中國(guó)藥典2010版中的重組人表皮生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性測(cè)定方法，檢測(cè)了生物學(xué)活性，活性大于藥典標(biāo)準(zhǔn)1×10⁵ui。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2中含人重組mj-hegf重組載體酶切鑒定瓊脂糖凝膠圖；

圖2為實(shí)施例2中人重組mj-hegf蛋白純化sds-page電泳圖；

圖3為實(shí)施例3中人重組mj-hegf蛋白的mtt細(xì)胞活性吸光度檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因制備方法

登錄genebank，查找人表皮生長(zhǎng)因子hegf活性肽的基因序列，其核酸長(zhǎng)度為159bp，hegf為真核生物多肽序列，考慮到后續(xù)研發(fā)在原核中進(jìn)行表達(dá)，因此將上述hegf真核多肽序列的編碼密碼子與大腸桿菌偏好性密碼子進(jìn)行比較分析。根據(jù)密碼子的兼并性和不改變hegf活性肽氨基酸排列順序不變的情況下，參照生物軟件vectorntisuitor7.0對(duì)hegf核酸序列進(jìn)行分析，對(duì)已知的hegf進(jìn)行基因改造優(yōu)化，主要是將hegf原基因序列中大腸桿菌稀有的密碼子改成偏好的密碼子，以提高目的基因在大腸桿菌的高水平表達(dá)。并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，最終得到hegf基因的優(yōu)化序列如seqidno.2所示。

根據(jù)密碼子的兼并性和不改變hegf活性肽氨基酸排列順序不變的情況下，參照生物軟件vectorntisuitor7.0對(duì)hegf基因的優(yōu)化序列進(jìn)行基因改造重組，主要是將mj的基因序列(seqidno.3所示)與人表皮生長(zhǎng)因子hegf基因的優(yōu)化序列重組，以提高目的基因在大腸桿菌的高水平表達(dá)及表達(dá)后的活性。并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，最終得到hegf基因的重組序列mj-hegf，如seqidno.1所示。

將人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列n端和c端分別加上ndeⅰ和xhoⅰ酶切位點(diǎn)。送上海生工公司進(jìn)行全基因合成，并連入原核表達(dá)載體pet-30a(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院饋贈(zèng))的ndeⅰ和xhoⅰ酶切位點(diǎn)之間，得到重組的原核表達(dá)質(zhì)粒pet-30a-mj-hegf。

實(shí)施例2

2.1表達(dá)菌株的獲得

將實(shí)施例1中的得到的原核表達(dá)載體pet-30a-mj-hegf通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)(購(gòu)自于天根生物公司)中，lb平板培養(yǎng)基中加入卡那霉素50ug/ml進(jìn)行篩選，挑選單克隆酶切鑒定后(如圖1所示)，進(jìn)行測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)鑒定。

2.2人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組陽(yáng)性單克隆菌落接種到含有濃度為50ug/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按照1％的比例將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液接種到含有50ug/ml卡那霉素的新鮮的液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm培養(yǎng)至菌液濃度od600約為0.9，立即加入誘導(dǎo)劑iptg至0.5mm,將誘導(dǎo)組和對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)3h，12000rpm，離心10min收集菌體。

2.3人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf提取與鑒定

將離心收集的菌體，按照每克菌體濕重加入10ml的pbs緩沖液重選菌體，充分混勻，用終濃度為1mg/ml的溶菌酶溶液4℃過(guò)夜消化菌體。處理后的菌體于冰上超聲破碎，超聲5s,間隔5s，總用15min，然后4℃，12000rpm離心30min。取包涵體沉淀，用1％的triton-x-100洗滌3遍，得到粗純后的包涵體進(jìn)一步純化。采用ni-nta瓊脂糖親和層析柱純化人表皮生長(zhǎng)因子hegf，先用5倍柱床體積平衡液緩沖液(8m尿素，100mmnah2po4，100mmtris-hclph＝8)平衡層析柱，將上述hegf樣品按照1ml/min的流速上柱。當(dāng)樣品全部過(guò)完介質(zhì)后，加入清洗緩沖液(8m尿素，100mmnah2po4，100mmtris-hclph＝6.3)，進(jìn)行非特異結(jié)合雜質(zhì)的清洗，最后加入洗脫緩沖液(8m尿素，100mmnah2po4，100mmtris-hclph＝4.5)進(jìn)行洗脫，收集洗脫目的蛋白，將洗脫后的目的蛋白以含0.1mol/l的gsh和0.1mol/l的gssg洗脫緩沖液(100mmnah2po4，100mmtris-hclph＝8.0)在4℃條件下以1：20的體積進(jìn)行透析，2h換一次透析液，5次后，用洗脫緩沖液(100mmnah2po4，100mmtris-hclph＝8.0)透析，全過(guò)程無(wú)沉淀產(chǎn)生。透析后樣品的sds-page鑒定蛋白純度在95％以上。對(duì)誘導(dǎo)后未處理的包涵體、誘導(dǎo)后粗純的包涵體和誘導(dǎo)后純化的包涵體進(jìn)行sda-page分析，結(jié)果如圖2所示：m為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子1、誘導(dǎo)后未處理的包涵體混合物，2、誘導(dǎo)后，包涵體洗滌粗純的結(jié)果，3、誘導(dǎo)后粗純完的樣品上柱純化后結(jié)果，由結(jié)果可知最終純化后其本上除出了所有雜蛋白。

實(shí)施例3人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf生物學(xué)活性驗(yàn)證

將購(gòu)買的balb/c3t3細(xì)胞(購(gòu)自atcc公司)傳至3-4代，計(jì)數(shù)后，然后鋪96孔板，每孔1×10⁵個(gè)細(xì)胞。在96孔板dmem完全培養(yǎng)基中(10％的血清)培養(yǎng)24小時(shí)后，加入維持培養(yǎng)基(0.4％的血清)中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。

mj-hegf(終濃度為20ng/ml)，分別加空白對(duì)照組nc、egf標(biāo)準(zhǔn)品(終濃度為20ng/ml)、hegf(終濃度為20ng/ml)小肽刺激小鼠胚胎成纖維細(xì)胞balb/c3t3細(xì)胞72小時(shí)后，通過(guò)mtt法檢測(cè)hegf促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，吸光度值與細(xì)胞增殖活性成正比。計(jì)算出比活性為7×10⁷iu。如下表與圖3所示，mj-hegf生物學(xué)活性有一定的提高。

*表示egf處理組與對(duì)照組比較，具有顯著性差異。

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<110>江蘇邁健生物科技發(fā)展股份有限公司

<120>人重組表皮生長(zhǎng)因子mj-hegf基因優(yōu)化序列及其制備方法和應(yīng)用

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