本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種活化菌株發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸的方法。

背景技術(shù)：

l-丙氨酸是組成蛋白質(zhì)的氨基酸之一，雖然為人體非必須氨基酸，但卻是人體血液中含量最高的氨基酸，在醫(yī)藥、高分子材料、食品等領(lǐng)域具有廣泛的用途。在醫(yī)藥領(lǐng)域：l-丙氨酸作為醫(yī)藥中間體，是生產(chǎn)維生素b6及l(fā)-氨基丙醇的主要原料；與糖代謝密切相關(guān)，在轉(zhuǎn)氨反應中是主要的氨基供體，具有重要的生理功能，在臨床上常添加到輸液中；另外，l-丙氨酸還是一種很好的利尿藥。在高分子材料領(lǐng)域：近年來發(fā)現(xiàn)聚乳酸中添加l-丙氨酸可有效提高聚乳酸的性能。在食品領(lǐng)域：l-丙氨酸具有獨特的改善風味的效果，與其他氨基酸配合能加強食品和飲料的風味；添加l-丙氨酸可以明顯提高食品和飲料中蛋白質(zhì)的利用率；還可以改善有機酸的酸味，越來越受到人們的歡迎和重視。目前，l-丙氨酸的主要工業(yè)化生產(chǎn)方法就是酶法轉(zhuǎn)化，即通過富有l(wèi)-天冬氨酸-β-脫羧酶活力的微生物細胞催化l-天冬氨酸而得到。酶法轉(zhuǎn)化工藝的特點是酶活力高，設備投資小，提取工藝簡單，但其主要原材料l-天冬氨酸價格較貴，造成其生產(chǎn)成本較高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提出一種活化菌株發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸的方法，通過誘變活化菌株生產(chǎn)l-丙氨酸。

為達到上述目的，本發(fā)明提出一種活化菌株發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸的方法包括菌體活化、溫料雙控發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)物提取。

上述活化菌株發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸的方法，包括以下步驟：

(1)菌體活化

選用黃色短桿菌，置于斜面培養(yǎng)基中，25～32℃的溫度條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，冷卻至20～25℃，加入等離子體，在紫外燈照射下進行菌體誘變，得到活化黃色短桿菌；

(2)溫料雙控發(fā)酵培養(yǎng)

將步驟(1)得到的活化黃色短桿菌，置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為35～40℃，培養(yǎng)ph值為6.85～7.10，培養(yǎng)至發(fā)酵培養(yǎng)基中糖分≤0.01％，停止發(fā)酵培養(yǎng)；

(3)產(chǎn)物提取

將步驟(2)所得混合液經(jīng)過改性陶瓷?；虼罂字鶢罟枘z進行分離提純，清洗，干燥，即得l-丙氨酸。

上述菌體活化，是采用添加0.1～0.2％的等離子氮，在轉(zhuǎn)動攪拌的條件下紫外線照射25～45s，進行黃色短桿菌的活化。

上述溫料雙控發(fā)酵培養(yǎng)，是采用1～10％的尿素與氨水作為氮源，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加尿素作為底物氮源，發(fā)酵過程中通過滴加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵的ph值作為滴加氮源。

上述溫料雙控發(fā)酵培養(yǎng)，在35℃條件下培養(yǎng)5h，升溫至38～40℃，培養(yǎng)至發(fā)酵培養(yǎng)基中糖分≤0.01％。

上述產(chǎn)物提取，待發(fā)酵結(jié)束，取出發(fā)酵液經(jīng)過改性陶瓷?；虼罂字鶢罟枘z進行分離，得到濾液，為提高產(chǎn)物純度，再通過納濾膜進一步過濾濾液，取的濾液，在低溫真空下，干燥，結(jié)晶，離心，即得產(chǎn)品。

本發(fā)明有益效果是:本發(fā)明黃色短桿菌為菌源，采用等離子氮注入和紫外線照射協(xié)同作用法誘變處理菌體，用該突變株以葡萄糖等糖類物質(zhì)為底物，在35～40℃，ph6.85～7.10厭氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸。選擇黃色短桿菌作為出發(fā)菌株，因為該菌種兼性厭氧，會大大提高正突變和發(fā)酵培養(yǎng)目標物的效率；所用的原材料葡萄糖屬于可再生純天然資源，來源廣泛，價格低廉，且厭氧發(fā)酵減少了動力消耗，降低了生產(chǎn)成本；提純過程中使用改性陶瓷?；虼罂字鶢罟枘z進行分離過濾去除雜質(zhì)，并經(jīng)過納濾膜進一步過濾濾液，保證了產(chǎn)品質(zhì)量，適合規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；采用的等離子紫外誘變法具有突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩(wěn)定等優(yōu)點。

具體實施方式

通過對實施例的進一步詳細的說明，以幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思、技術(shù)方案有更完整、準確和深入的理解。

本發(fā)明提出一種活化菌株發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸的方法包括菌體活化、溫料雙控發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)物提取。

上述活化菌株發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸的方法，包括以下步驟：

(1)菌體活化

選用黃色短桿菌，置于斜面培養(yǎng)基中，25～32℃的溫度條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，冷卻至20～25℃，加入0.1～0.2％的等離子氮，在轉(zhuǎn)動攪拌的條件下紫外線照射25～45s，進行黃色短桿菌的活化，得到活化黃色短桿菌；

(2)溫料雙控發(fā)酵培養(yǎng)

將步驟(1)得到的活化黃色短桿菌，置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為35～40℃，培養(yǎng)ph值為6.85～7.10，培養(yǎng)至發(fā)酵培養(yǎng)基中糖分≤0.01％，停止發(fā)酵培養(yǎng)；

(3)產(chǎn)物提取

待發(fā)酵結(jié)束，取出發(fā)酵液經(jīng)過改性陶瓷粒或大孔柱狀硅膠進行分離，得到濾液，為提高產(chǎn)物純度，再通過納濾膜進一步過濾濾液，取的濾液，在低溫真空下，干燥，結(jié)晶，離心，即得產(chǎn)品。

上述溫料雙控發(fā)酵培養(yǎng)，是采用1～10％的尿素與氨水作為氮源，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加尿素作為底物氮源，發(fā)酵過程中通過滴加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵的ph值作為滴加氮源。

上述溫料雙控發(fā)酵培養(yǎng)，在35℃條件下培養(yǎng)5h，升溫至38～40℃，培養(yǎng)至發(fā)酵培養(yǎng)基中糖分≤0.01％。

實施例一

在具體實施方式的基礎上，本實施的活化菌株發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸的方法包括以下步驟：

(1)菌體活化

選用黃色短桿菌，置于斜面培養(yǎng)基中，28℃的溫度條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，冷卻至20℃，加入0.2％的等離子氮，在200rad/s轉(zhuǎn)動攪拌的條件下紫外線照射35s，進行黃色短桿菌的活化，得到活化黃色短桿菌；

(2)溫料雙控發(fā)酵培養(yǎng)

將步驟(1)得到的活化黃色短桿菌，以0.5％的接菌量置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)5h后，升溫至40℃，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵培養(yǎng)基中糖分≤0.01％，停止發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程滴加氨水保持發(fā)酵培養(yǎng)的ph值為7.0±0.5；

(3)產(chǎn)物提取

待發(fā)酵結(jié)束，取出發(fā)酵液經(jīng)過改性陶瓷?；虼罂字鶢罟枘z進行分離，得到濾液，為提高產(chǎn)物純度，再通過納濾膜進一步過濾濾液，取的濾液，在0℃,100pa的條件下干燥，結(jié)晶，離心，即得產(chǎn)品。

本實施例采用的斜面培養(yǎng)基包括以下組成成分：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，乙酸鈉0.5％，吐溫800.1％，七水硫酸鎂0.02％，碳酸鈣2％，牛肉膏1％，葡萄糖1％，檸檬酸二胺0.2％，磷酸氫二鉀0.2％，七水硫酸錳0.005％，瓊脂2％，氨水1.075％，碳酸鈉0.4％，無菌水90％。

本實施例采用發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組成成分：葡萄糖6％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二鉀1.2％，無水硫酸鎂0.02％，尿素2.85％，無菌水90％。

本實施例得到的l-丙氨酸的產(chǎn)量為85g/l，產(chǎn)品為白色粉末狀。

實施例二

在具體實施方式的基礎上，本實施的活化菌株發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸的方法包括以下步驟：

(1)菌體活化

選用黃色短桿菌，置于斜面培養(yǎng)基中，32℃的溫度條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，冷卻至25℃，加入0.1％的等離子氮，在200rad/s轉(zhuǎn)動攪拌的條件下紫外線照射40s，進行黃色短桿菌的活化，得到活化黃色短桿菌；

(2)溫料雙控發(fā)酵培養(yǎng)

將步驟(1)得到的活化黃色短桿菌，以0.5％的接菌量置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)5h后，升溫至38℃，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵培養(yǎng)基中糖分≤0.01％，停止發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程滴加氨水保持發(fā)酵培養(yǎng)的ph值為7.0±0.5；

(3)產(chǎn)物提取

待發(fā)酵結(jié)束，取出發(fā)酵液經(jīng)過改性陶瓷?；虼罂字鶢罟枘z進行分離，得到濾液，為提高產(chǎn)物純度，再通過納濾膜進一步過濾濾液，取的濾液，在0℃,100pa的條件下干燥，結(jié)晶，離心，即得產(chǎn)品。

本實施例采用的斜面培養(yǎng)基包括以下組成成分：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，乙酸鈉0.5％，吐溫800.1％，七水硫酸鎂0.02％，碳酸鈣2％，牛肉膏1％，葡萄糖1％，檸檬酸二胺0.2％，磷酸氫二鉀0.2％，七水硫酸錳0.005％，瓊脂2％，氨水1.075％，碳酸鈉0.4％，無菌水90％。

本實施例采用發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組成成分：葡萄糖6％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二鉀1.2％，無水硫酸鎂0.02％，尿素2.85％，無菌水90％。

本實施例得到的l-丙氨酸的產(chǎn)量為60g/l，產(chǎn)品為白色粉末狀。

上面對本發(fā)明進行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進行的各種非實質(zhì)性的改進，或未經(jīng)改進將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所限定的保護范圍為準。