本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種人類凍存單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)高效擴(kuò)增自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercell，nk)的方法。
背景技術(shù)：
自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercell，nk)，是機(jī)體內(nèi)天然免疫第一道防線。它具有高效抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)功能，在防御機(jī)體疾病中發(fā)揮著重要作用。自然殺傷細(xì)胞具有不受組織兼容性抗原限制，即殺傷活性無(wú)mhc限制。細(xì)胞具有廣譜殺毒性，且不需要抗原遞呈細(xì)胞啟動(dòng)即可直接進(jìn)攻癌細(xì)胞。自然殺傷細(xì)胞通過(guò)直接溶解、釋放穿孔素和分泌細(xì)胞因子兩個(gè)方面進(jìn)行殺瘤。細(xì)胞可以分泌tnf-ɑ、ifn-γ和il-1細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫功能起著重要作用?？茖W(xué)研究表明，自然殺傷細(xì)胞具有調(diào)節(jié)免疫功能和神經(jīng)系統(tǒng)相互作用能力。理論上這種細(xì)胞可以成為高效治療癌癥免疫療法。然而，自然殺傷細(xì)胞在外周血中含量?jī)H為5％-10％，隨著年齡增長(zhǎng)，免疫器官衰老，細(xì)胞活性和數(shù)量隨之降低。免疫功能降低，直接或間接導(dǎo)致疾病和惡性腫瘤發(fā)生。
過(guò)繼免疫細(xì)胞療法是抽取癌癥患者外周血，在體外增殖免疫細(xì)胞并回輸?shù)襟w內(nèi)。在此狀態(tài)下制備免疫細(xì)胞具有較小殺瘤能力，臨床上不能達(dá)到滿意療效，因此，研究中找到高活性免疫細(xì)胞，并建立質(zhì)量穩(wěn)定、足夠數(shù)量、高純度和殺瘤活性強(qiáng)培養(yǎng)方法成為亟待解決問(wèn)題。
通過(guò)對(duì)不同年齡段人群分析發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增高，免疫力逐漸下降。當(dāng)年齡25歲時(shí)，細(xì)胞活力和數(shù)量達(dá)到最大值。當(dāng)年齡25-55之間時(shí)，細(xì)胞活力和數(shù)量處于最優(yōu)，當(dāng)年齡超過(guò)55歲時(shí)，細(xì)胞活性和數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。為了提供健康保障，我們?cè)谀贻p健康時(shí)將免疫細(xì)胞即外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)存儲(chǔ)下來(lái)，未來(lái)待需要時(shí)通過(guò)免疫治療方法，可以及時(shí)為我們補(bǔ)充健康免疫細(xì)胞，抗衰保健，提高免疫力，預(yù)防疾病發(fā)生和腫瘤免疫治療。因此，體外建立凍存pbmc高效增殖自然殺傷細(xì)胞培養(yǎng)方法是細(xì)胞過(guò)繼免疫治療腫瘤關(guān)鍵。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種人類凍存單個(gè)核細(xì)胞高效擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供了一種人類凍存單個(gè)核細(xì)胞高效擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
(1)將凍存的單個(gè)核細(xì)胞融化，將融化后細(xì)胞懸液迅速轉(zhuǎn)移到nk-ex培養(yǎng)液中，離心，棄上清，將沉淀細(xì)胞打散，將細(xì)胞接種至包被cd3/cd28t細(xì)胞激活劑的培養(yǎng)瓶中，加入刺激液和ab血漿于培養(yǎng)瓶中，使培養(yǎng)體系中的細(xì)胞密度達(dá)到(1～1.5)×106個(gè)/ml、ab血漿的體積濃度達(dá)到5％，記為d0天；
(2)d3天解除刺激，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液離心，棄上清，將沉淀細(xì)胞打散，將細(xì)胞接種至新的培養(yǎng)瓶中，加入擴(kuò)增培養(yǎng)基和ab血漿于培養(yǎng)瓶中，使培養(yǎng)體系中的細(xì)胞密度達(dá)到(1～1.5)×106個(gè)/ml、ab血漿的體積濃度達(dá)到10％；
(3)在d5天和d7天向培養(yǎng)的細(xì)胞懸液中補(bǔ)加擴(kuò)增培養(yǎng)基和ab血漿，使體系中的細(xì)胞密度維持在(1～1.5)×106個(gè)/ml、ab血漿的體積濃度維持在15％；
(4)在d9天向培養(yǎng)的細(xì)胞懸液中補(bǔ)加擴(kuò)增培養(yǎng)基和ab血漿，使體系中的細(xì)胞密度維持在(1～1.5)×106個(gè)/ml、ab血漿的體積濃度維持在10％；
(5)在d11天及之后的每隔一天，向培養(yǎng)的細(xì)胞懸液中補(bǔ)加擴(kuò)增培養(yǎng)基和ab血漿，使體系中的細(xì)胞密度維持在(1～1.5)×106個(gè)/ml、ab血漿的體積濃度維持在2～3％；
(6)在d14天后對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行采樣細(xì)胞計(jì)數(shù)，當(dāng)連續(xù)兩天計(jì)數(shù)結(jié)果變化不大于10％時(shí)，可以進(jìn)行細(xì)胞收集。
期間，可依據(jù)補(bǔ)液量選擇更換更大規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)帶，可選地，例如t175細(xì)胞培養(yǎng)瓶或1000ml細(xì)胞培養(yǎng)袋。
進(jìn)一步地，本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，步驟(1)刺激細(xì)胞時(shí)的培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)存在影響。經(jīng)試驗(yàn)探究后，本發(fā)明提供一種優(yōu)選的細(xì)胞刺激培養(yǎng)條件，即步驟(1)配制好培養(yǎng)體系后，將培養(yǎng)瓶先置于39℃、5％co2的條件下培養(yǎng)20小時(shí)，再置于37℃、5％co2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
進(jìn)一步地，d1天及之后，培養(yǎng)條件均為37℃、5％co2。
進(jìn)一步地，步驟(1)中的融化具體為將凍存的單個(gè)核細(xì)胞于37℃水浴中1min內(nèi)融化。
其中，所述刺激液為含有26ml/lt細(xì)胞擴(kuò)增添加劑、20ml/ll-谷氨酰胺和500-1000u/ml白細(xì)胞介素2的t細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述t細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基為市售可得商品，例如，可購(gòu)自stl公司。
所述擴(kuò)增培養(yǎng)基為添加有500-1000u/ml白細(xì)胞介素2和10-30ng/ml白細(xì)胞介素18的nk-ex培養(yǎng)基。所述nk-ex培養(yǎng)基為市售可得商品，例如，可購(gòu)自stl公司。
所述包被cd3/cd28t細(xì)胞激活劑的培養(yǎng)瓶，用pbs稀釋cd3/cd28t細(xì)胞激活劑，包被t75培養(yǎng)瓶，cd3/cd28t細(xì)胞激活劑濃度為(5-20)μg/ml，37℃過(guò)夜，吸棄培養(yǎng)瓶中pbs，4℃冰箱放置3個(gè)月可用。所述培養(yǎng)瓶?jī)?yōu)選為t75培養(yǎng)瓶。
上述所敘述中cd3/cd28t細(xì)胞激活劑濃度為20μg/ml。
所述ab血漿為市售可得商品，例如，可購(gòu)自采血中心，經(jīng)檢驗(yàn)合格后可以使用。
進(jìn)一步地，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，還需對(duì)步驟(6)所得的細(xì)胞懸液進(jìn)行后續(xù)處理，具體為，將所述細(xì)胞懸液離心，棄上清，將沉淀細(xì)胞打散，用pbs定容后離心，重復(fù)操作一次；用生理鹽水定容后再次離心，對(duì)沉淀細(xì)胞進(jìn)行分散和生理鹽水重懸；過(guò)70um細(xì)胞篩，將過(guò)篩后的細(xì)胞懸液打入到生理鹽水中，即可用于實(shí)際應(yīng)用。
進(jìn)一步地，所述凍存的單個(gè)核細(xì)胞為利用密度梯度離心法從外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞，并采用10％dmso和90％自體血漿逐級(jí)降溫方式凍存單個(gè)核細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，提供了所述凍存的單個(gè)核細(xì)胞的制備方法，具體為：收集受試者50ml外周血樣，室溫下混勻，轉(zhuǎn)移至離心管中，留取2ml外周血做流式；3000rpm/10min，溫度20℃，上下加速度調(diào)成5/5；離心結(jié)束后取出離心管，將血漿轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50ml離心管，余下血漿56℃滅活30～40min，滅活結(jié)束，過(guò)70um膜，3000rpm/10min離心；用pbs將血液定容，混勻，將血慢慢打到淋巴細(xì)胞分離液中，溫度室溫，轉(zhuǎn)速1600rpm，離心30min，上下加速度分別調(diào)為5；
離心結(jié)束后，將離心管白細(xì)胞層上方8-12cm處液體棄掉，將白細(xì)胞層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新離心管，用pbs定容到45ml，溫度20℃，轉(zhuǎn)速1200rpm，離心5min，棄上清，將沉淀打散，再次用pbs定容，混勻，取出部分細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，余下細(xì)胞懸液以1200rpm，溫度20℃，離心5min，棄上清，將沉淀打散，配制含有10％二甲基亞砜和自體血漿混合液，按著1×107個(gè)/ml密度凍存細(xì)胞，將凍存終細(xì)胞懸液分裝到凍存管中，放入4℃平衡過(guò)的凍存盒中，放于-80℃冰箱內(nèi)24小時(shí)，后放入液氮罐中。將余下血漿直接凍于-20℃。
本發(fā)明涉及到的原料或試劑均為普通市售產(chǎn)品，涉及到的操作如無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。
在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實(shí)施方式。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明建立了人類凍存單個(gè)核細(xì)胞體外高效擴(kuò)增nk細(xì)胞的方法。并通過(guò)采用不同血漿類型和濃度對(duì)體外nk細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，篩選出了最佳的血漿種類和最佳的血漿濃度培養(yǎng)方案，使擴(kuò)增得到的nk細(xì)胞在細(xì)胞活性、細(xì)胞數(shù)量、純度和殺傷活性等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。
通過(guò)本發(fā)明提供的方法對(duì)凍存pbmc進(jìn)行體外誘導(dǎo)增殖nk細(xì)胞，與新鮮血液直接誘導(dǎo)擴(kuò)增nk細(xì)胞無(wú)顯著性差異。本發(fā)明培養(yǎng)得到的nk細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定、增殖率高、純度高、殺瘤活性強(qiáng)。所述方法具有易于操作、質(zhì)量可控、成本低特點(diǎn)。
應(yīng)用本發(fā)明提供的方法對(duì)nk細(xì)胞進(jìn)行體外大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量、純度、殺瘤性均可以滿足臨床需求，為老年人健康保健和腫瘤患者過(guò)繼免疫治療提供了一個(gè)切實(shí)可行方法。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1人類凍存單個(gè)核細(xì)胞體外高效擴(kuò)增nk細(xì)胞
采集150ml外周血樣，室溫下混勻，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，留取2ml外周血做流式。3000rpm/10min，溫度20℃，上下加速度調(diào)成5/5。離心結(jié)束后取出離心管，將血漿轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50ml離心管，余下血漿56℃滅活(30-40)min，滅活結(jié)束，過(guò)70um膜，3000rpm/10min離心。用pbs將血液定容到30ml混勻，將血慢慢打到15ml淋巴細(xì)胞分離液中，溫度室溫，轉(zhuǎn)速1600rpm，離心30min，上下加速度分別調(diào)為5。
離心結(jié)束后小心取出離心管，將離心管白細(xì)胞層上方約10cm處液體棄掉。將白細(xì)胞層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新離心管，用pbs定容到45ml，溫度20℃，轉(zhuǎn)速1200rpm，離心5min。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，再次用pbs定容到45ml，混勻，取出200ul進(jìn)行計(jì)數(shù)。余下細(xì)胞懸液以1200rpm，溫度20℃，離心5min。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散。配制含有10％二甲基亞砜和自體血漿混合液，按著1×107個(gè)/ml密度凍存等量細(xì)胞，將凍存終細(xì)胞懸液分裝到2ml凍存管(-20℃平衡過(guò))中，每管1ml，將凍存管立即放入4℃平衡過(guò)的凍存盒中，放于-80℃冰箱內(nèi)24小時(shí)，后放入液氮罐中。將余下血漿直接凍于-20℃。
一個(gè)月后，從液氮中取出凍存單個(gè)核細(xì)胞，于37℃水浴中1min內(nèi)融化，將融化后細(xì)胞懸液迅速轉(zhuǎn)移到40mlnk-ex培養(yǎng)液中，1200rpm/6min離心，離心畢，以1.5×106個(gè)/ml密度接種。加入40ml刺激液和5％ab血漿于包被好t75培養(yǎng)瓶中開(kāi)始刺激細(xì)胞，記為d0天。
d3天解除刺激，從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中取出細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，余下細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，按著1.5×106個(gè)/ml密度接種，加入適量擴(kuò)增培養(yǎng)基和10％ab血漿。轉(zhuǎn)移至新75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。每隔一天計(jì)數(shù)補(bǔ)液。
d5天補(bǔ)液。從37℃、5％co2培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，然后用移液管混勻，從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中取出細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按著(1-1.5)×106個(gè)/ml補(bǔ)加擴(kuò)增培養(yǎng)基和10％ab血漿。依據(jù)補(bǔ)液量更換175cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或1000ml細(xì)胞培養(yǎng)袋。
d7天細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)液。從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中取出200ul細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，按著計(jì)數(shù)補(bǔ)液。
d9天細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)液。
d11天抽取細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)。按著計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)其補(bǔ)液。
d13天抽取細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)補(bǔ)液。
d14～d20收取細(xì)胞。若連續(xù)兩天抽取細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果不大于10％，則可以收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸液分別加入到4個(gè)250ml離心管，然后用移液器混勻細(xì)胞懸液，抽取2ml細(xì)胞懸液于凍存管中進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)和k562殺瘤性檢測(cè)。再抽取細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。余下細(xì)胞懸液離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，次用pbs定容離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，再次用pbs定容離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，用生理鹽水定容到100ml，離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，用生理鹽水重懸細(xì)胞，過(guò)70um細(xì)胞篩，將細(xì)胞懸液打入到生理鹽水中。
實(shí)施例2不同血漿類型和濃度對(duì)體外nk細(xì)胞培養(yǎng)影響
采取周邊3名健康人士血液，獻(xiàn)血者經(jīng)臨床評(píng)估無(wú)血液系統(tǒng)疾病和嚴(yán)重自身免疫性疾病。
外周血中單個(gè)核細(xì)胞提取后液氮保存和復(fù)蘇后誘導(dǎo)增殖。實(shí)驗(yàn)中所有操作均在gmp實(shí)驗(yàn)室中完成。
采集150ml外周血樣，室溫下混勻，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，留取2ml外周血做流式。3000rpm/10min，溫度20℃，上下加速度調(diào)成5/5。離心結(jié)束后取出離心管，將血漿轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50ml離心管，余下血漿56℃滅活(30-40)min，滅活結(jié)束，過(guò)70um膜，3000rpm/10min離心。用pbs將血液定容到30ml混勻，將血慢慢打到15ml淋巴細(xì)胞分離液中，溫度室溫，轉(zhuǎn)速1600rpm，離心30min，上下加速度分別調(diào)為5。
離心結(jié)束后小心取出離心管，將離心管白細(xì)胞層上方約10cm處液體棄掉。將白細(xì)胞層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新離心管，用pbs定容到45ml，溫度20℃，轉(zhuǎn)速1200rpm，離心5min。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，再次用pbs定容到45ml，混勻，取出200ul進(jìn)行計(jì)數(shù)。余下細(xì)胞懸液以1200rpm，溫度20℃，離心5min。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散。配制含有10％二甲基亞砜和自體血漿混合液，按著1×107個(gè)/ml密度凍存等量細(xì)胞，將凍存終細(xì)胞懸液分裝到2ml凍存管(-20℃平衡過(guò))中，每管1ml，將凍存管立即放入4℃平衡過(guò)的凍存盒中，放于-80℃冰箱內(nèi)24小時(shí)，后放入液氮罐中。將余下血漿直接凍于-20℃。
一個(gè)月后，從液氮中取出3份等量?jī)龃鎲蝹€(gè)核細(xì)胞，于37℃水浴中1min內(nèi)融化，將融化后細(xì)胞懸液迅速轉(zhuǎn)移到40mlnk-ex培養(yǎng)液中，1200rpm/6min離心，離心畢，以1.5×106個(gè)/ml密度接種。a組加入40ml刺激液和5％自體血漿于包被好t75培養(yǎng)瓶中開(kāi)始刺激細(xì)胞；b組加入40ml刺激液和5％ab血漿于包被好t75培養(yǎng)瓶中開(kāi)始刺激細(xì)胞；c組加入40ml刺激液和5％人血白蛋白于包被好t75培養(yǎng)瓶中開(kāi)始刺激細(xì)胞；記為d0天。
d3天解除刺激，從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中取出細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，余下細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，按著1.5×106個(gè)/ml密度接種，a組加入適量擴(kuò)增培養(yǎng)基和10％自體血漿；b組加入適量擴(kuò)增培養(yǎng)基和10％ab血漿；c組加入適量擴(kuò)增培養(yǎng)基和10％人血白蛋白。轉(zhuǎn)移至新t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶。每隔一天計(jì)數(shù)補(bǔ)液。
d5天補(bǔ)液。從37℃、5％co2培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，然后用移液管混勻，從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中取出細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按著(1-1.5)×106個(gè)/ml補(bǔ)加擴(kuò)增培養(yǎng)基和10％血漿(a組：自體血漿；b組ab血漿；c組人血白蛋白)。依據(jù)補(bǔ)液量更換t175細(xì)胞培養(yǎng)瓶或1000ml細(xì)胞培養(yǎng)袋。
d7天細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)液
d9天細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)液。
d11天抽取細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)。按著計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)其補(bǔ)液。
d13天抽取細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)補(bǔ)液。
d14～d20收取細(xì)胞。若連續(xù)兩天抽取細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果不大于10％，則可以收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸液分別加入到4個(gè)250ml離心管，然后用移液器混勻細(xì)胞懸液，抽取2ml細(xì)胞懸液于凍存管中進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)和k562殺瘤性檢測(cè)。再抽取細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)。余下細(xì)胞懸液離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，次用pbs定容離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，再次用pbs定容離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，用生理鹽水定容到100ml，離心。離心結(jié)束后取出離心管，棄掉上清，將沉淀打散，用生理鹽水重懸細(xì)胞，過(guò)70um細(xì)胞篩，將細(xì)胞懸液打入到生理鹽水中。
經(jīng)3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同血漿類型對(duì)凍存單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)增殖成自然殺傷細(xì)胞存在影響。研究結(jié)果見(jiàn)表1，凍存單個(gè)核細(xì)胞在體外誘導(dǎo)增殖自然殺傷細(xì)胞時(shí)使用ab血漿，對(duì)細(xì)胞增殖率、活性、數(shù)量、純度、殺瘤性上遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它兩個(gè)血漿類型。其中細(xì)胞殺瘤性高達(dá)87％、細(xì)胞數(shù)達(dá)到65×108個(gè)、細(xì)胞比例高達(dá)88.18％。所以本發(fā)明體外誘導(dǎo)增殖nk細(xì)胞的最優(yōu)血漿類型選擇為ab血漿。為了探究ab血漿濃度對(duì)體外增殖nk細(xì)胞的影響，本發(fā)明又驗(yàn)證了不同濃度ab血漿對(duì)nk細(xì)胞狀態(tài)、活性、數(shù)量、純度和殺瘤性影響。
表1不同血漿類型對(duì)凍存單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)增殖成自然殺傷細(xì)胞的影響
實(shí)施例3不同濃度ab血漿對(duì)nk細(xì)胞狀態(tài)、活性、數(shù)量、純度和殺瘤性影響
采取周邊3名健康人士血液，獻(xiàn)血者經(jīng)臨床評(píng)估無(wú)血液系統(tǒng)疾病和嚴(yán)重自身免疫性疾病。
利用密度梯度法從外周血中提取出單個(gè)核細(xì)胞并凍存于液氮中。一個(gè)月后復(fù)蘇、體外誘導(dǎo)成nk細(xì)胞。本發(fā)明探究了3組對(duì)比實(shí)驗(yàn)，方法一，d0天ab血漿濃度為5％，d3解除刺激后，血漿濃度為10％，d5天和d7天血漿濃度為15％，d9天血漿濃度變?yōu)?0％，d11天后血漿濃度降到(2-3)％。方法二，d0天ab血漿濃度為5％，d3解除刺激后，血漿濃度為10％，d5天和d7天血漿濃度為10％，d9天后血漿濃度為5％，d11天后每次補(bǔ)液血漿加入5ml。方法三，d0天ab血漿濃度為5％，d3解除刺激后，血漿濃度為10％，此后血漿濃度均為10％。
經(jīng)3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度ab血漿對(duì)nk細(xì)胞狀態(tài)、活性、數(shù)量、純度和殺瘤性存在影響。研究結(jié)果見(jiàn)表2，由表2可以看出，方法一培養(yǎng)出nk細(xì)胞殺瘤性、增殖率、純度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它兩種方法。其中殺瘤性高達(dá)86％，細(xì)胞比例高達(dá)85.55％。本研究發(fā)現(xiàn)可能由于方法三使用血漿比例高，大大促進(jìn)了免疫細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)果得出實(shí)驗(yàn)中采用方法一進(jìn)行nk細(xì)胞培養(yǎng)不僅可以提高細(xì)胞殺瘤性和純度，還大大降低了實(shí)驗(yàn)中ab血漿濃度，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，為大規(guī)?；a(chǎn)nk細(xì)胞提供了依據(jù)。
表2不同濃度ab血漿對(duì)nk細(xì)胞狀態(tài)、活性、數(shù)量、純度和殺瘤性影響
前述nk細(xì)胞殺瘤活性的檢測(cè)方法為：
收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以k562細(xì)胞為靶細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，根據(jù)不同的效靶比分別調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105個(gè)/ml、1×106個(gè)/ml。按不同效靶比(1:1、5:1、10:1)將效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞混合，同時(shí)設(shè)相應(yīng)的靶細(xì)胞孔、效應(yīng)細(xì)胞孔和培養(yǎng)基空白對(duì)照孔。每組均設(shè)3個(gè)平行孔。置于37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)后，每孔加入10ulcellcountingkit8，混勻，于37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處值。細(xì)胞毒殺活性計(jì)算方法求出平行孔的平均值，按以下方法計(jì)算各組細(xì)胞毒殺活性，以殺瘤率％表示。
nk細(xì)胞殺瘤活性＝(1-靶細(xì)胞孔o(hù)d值-效應(yīng)細(xì)胞孔o(hù)d值)/靶細(xì)胞孔o(hù)d值×100％
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。