本發(fā)明公開了一組用于pcr的引物組合，屬于微生物和分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：腦膜炎敗血伊麗莎白菌1959年由elizabetho.king分離自新生兒腦膜炎患者，命名為flavobacteriummeningosepticum，1994年，被分類至chryseobacterium屬，命名為chryseobacteriummeningosepticum，2005年，經(jīng)16srrna聚類分析，被分出新的屬：elizabethkingia屬，命名為elizabethkingiameningoseptica。腦膜炎敗血伊麗莎白菌在早產(chǎn)兒及嬰幼兒中可引起新生兒腦膜炎暴發(fā)。腦膜炎敗血伊麗莎白菌為革蘭陰性桿菌，廣泛分布于自然環(huán)境(例如淡水、咸水及土壤)。自1959年發(fā)現(xiàn)腦膜炎敗血伊麗莎白菌可引起新生兒腦膜炎以來(lái)，由該菌引起的相關(guān)暴發(fā)及臨床病例時(shí)有報(bào)道。1997年，karenc.bloch等報(bào)道，自1991年12月至1994年9月期間，自免疫功能不全的成人中確認(rèn)6例腦膜炎敗血伊麗莎白菌感染病例，并且分析了之前的相關(guān)文獻(xiàn)，顯示出腦膜炎敗血伊麗莎白菌感染與早產(chǎn)兒、低體重兒等因素的相關(guān)性。2011年，issack等統(tǒng)計(jì)了2002年8月至2003年12月毛里求斯發(fā)生的腦膜炎暴發(fā)流行，8例6～20天的嬰兒從腦脊液分離到腦膜炎敗血伊麗莎白菌，其中7例體重低于2.5千克，菌株表現(xiàn)相同的耐藥情況，1例確診后死亡；治療3周后，2例發(fā)展為腦積水，其中1例死亡，1例有較嚴(yán)重腦損傷；同時(shí)國(guó)內(nèi)外多家醫(yī)院的耐藥監(jiān)測(cè)均顯示了腦膜炎敗血黃桿菌(曾用名)/腦膜炎敗血伊麗莎白菌在臨床及環(huán)境分離株中占有較高的比例，同時(shí)多重耐藥情況也非常普遍。盡管腦膜炎敗血伊麗莎白菌具有重要的臨床意義，其臨床檢測(cè)方法的研究卻存在較多問題：1、基于腦膜炎敗血伊麗莎白菌過氧化氫酶陽(yáng)性、氧化酶陽(yáng)性、吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性、of葡萄糖ox+/f-，尿素酶陰性(米爾考拉金氏桿菌陽(yáng)性)、甘露醇陽(yáng)性、不能還原硝酸鹽(部分非典型菌株可還原硝酸鹽)、明膠酶、七葉苷、onpg及dna酶陽(yáng)性，金黃桿菌一般吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，但是其他生化多為非發(fā)酵或反應(yīng)較弱的生化特征，可以利用現(xiàn)有的例如id32gn、vitek2、sensitire(先德)及bdphoenix等全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，此種鑒定方法的前提是具有分離純化的菌株，因此對(duì)于未能分離培養(yǎng)出疑似病原的臨床標(biāo)本無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)在既往研究中顯示，各種生化鑒定系統(tǒng)也存在一定的誤判幾率，該菌易與殺鮭氣單胞菌(id32gn)、鞘氨醇桿菌屬(vitek2)混淆。2、基于16srrna測(cè)序及序列比對(duì)技術(shù)：16srrna是腦膜炎敗血伊麗莎白菌較為常見的檢測(cè)手段，通過通用引物擴(kuò)增測(cè)序后，可以通過16srrna全部/部分基因序列分析完成菌株的鑒別及分析。2005年，將腦膜炎敗血黃桿菌從黃桿菌屬分離出來(lái)重新定義為腦膜炎敗血伊麗莎白菌，確定伊麗莎白菌屬就是基于此種分析。然而此種技術(shù)雖然擺脫了必須培養(yǎng)得到純菌的前提(盡管如此，大多數(shù)基于此種技術(shù)完成的臨床樣品檢測(cè)工作仍然以分離培養(yǎng)得到純菌為前提)，但是此種鑒定技術(shù)基于測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，同時(shí)需進(jìn)行相關(guān)序列比對(duì)工作，不適宜臨床即時(shí)獲取檢驗(yàn)結(jié)果的需求。3、脂肪酸分析(fattyacidanalysis)：通過對(duì)全菌的脂肪酸提取后進(jìn)行氣相色譜分析，根據(jù)氣相色譜圖給出的保留時(shí)間、響應(yīng)值、色譜峰等參數(shù)及色譜圖，與已有的菌種庫(kù)數(shù)據(jù)比對(duì)?，F(xiàn)用商品化產(chǎn)品為microbialidentificationsystem等。此種菌株鑒定方法一方面需要獲得分純培養(yǎng)的菌株，另一方面需要儀器及相關(guān)菌種庫(kù)數(shù)據(jù)作為支持，同樣難以滿足臨床即時(shí)獲取檢驗(yàn)結(jié)果的需求。4、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)：以biotypermaldi-tofmassspectroscopy(brukerdaltonikgmbh,bremen,germany)為代表的飛行質(zhì)譜技術(shù)基于電場(chǎng)下生物大分子的特征性分析，通過與特定菌種庫(kù)比較對(duì)待檢測(cè)樣品進(jìn)行鑒定，該技術(shù)目前在腦膜炎敗血伊麗莎白菌的鑒定中有所應(yīng)用。但是該方法同樣需要儀器和相關(guān)菌種庫(kù)作為數(shù)據(jù)支持，檢測(cè)成本較高，而且檢測(cè)結(jié)果也同樣存在難以及時(shí)反饋的缺陷。5、其他分子分型方法：有研究者采用隨機(jī)引物擴(kuò)增指紋圖譜分析(randomamplifiedpolymorphicdnafingerprinting，rapd)方法進(jìn)行菌株鑒定：通過選擇短序列單一引物5'-gtcgatgtcg-3'對(duì)待檢測(cè)樣品進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，擴(kuò)增后通過比較其隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)生的多種分子量產(chǎn)物的組合方式進(jìn)行分型分析，此種方法適宜在疑似暴發(fā)或聚集性病例中進(jìn)行病原鑒定及分型，然而對(duì)于單一臨床樣品，限于方法本身特點(diǎn)，需要同已有數(shù)據(jù)庫(kù)或同時(shí)進(jìn)行多質(zhì)控樣品電泳分析。綜上所述，現(xiàn)有各種腦膜炎敗血伊麗莎白菌鑒定方法中常規(guī)的生化檢測(cè)技術(shù)可能存在誤判，且依賴于已分離培養(yǎng)的菌株，脂肪酸分析及maldi-tof技術(shù)均需要較為昂貴的儀器和完善的菌種庫(kù)數(shù)據(jù)信息，16srrna基因序列分析需對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，rapd存在較大隨機(jī)性，且限于電泳條件的不同，缺乏完善的protocol和標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)庫(kù)，試驗(yàn)結(jié)果難以做到實(shí)驗(yàn)室間的比較。pcr方法是一種用于放大擴(kuò)增特定的dna片段的分子生物學(xué)技術(shù)，目前在遺傳病的產(chǎn)前診斷、致病病原體的檢測(cè)、癌基因的檢測(cè)和診斷、dna指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系鑒別及法醫(yī)物證、動(dòng)、植物檢疫及高科技生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中均有所應(yīng)用，以該方法為基礎(chǔ)的real-timepcr方法通過加入熒光基團(tuán)，利用儀器收集擴(kuò)增過程中熒光強(qiáng)度變化的方法簡(jiǎn)化了普通pcr需要電泳讀膠的過程，也減少了檢測(cè)中可能造成環(huán)境污染的環(huán)節(jié)，同時(shí)在臨床中得到了廣泛的應(yīng)用。無(wú)論pcr或real-timepcr方法，同樣以特異性的靶基因(或核酸片段)作為臨床診斷的基礎(chǔ)，對(duì)于疑似為腦膜炎敗血伊麗莎白菌感染的臨床病例，目前尚沒有靶基因(或核酸片段)可用于快速的pcr檢測(cè)?；诂F(xiàn)有技術(shù)存在著的諸多問題，本發(fā)明的目的就是尋找足以代表腦膜炎敗血伊麗莎白菌序列特異性的靶核酸片段，并由此建立較好特異性及敏感性的核酸擴(kuò)增或者非診斷目的的檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于上述發(fā)明目的，本發(fā)明通過分析比對(duì)已有腦膜炎敗血伊麗莎白菌序列，篩選出具有序列特異性的核酸片段ema，并建立相關(guān)pcr檢測(cè)，對(duì)其敏感性及特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并通過與已有同種屬菌株核酸序列進(jìn)行比較，證明該核酸片段具有較好的特異性及敏感性，建立的pcr/sybrgreenreal-timepcr檢測(cè)方法可以很好地對(duì)臨床疑似菌株或未分離到菌株的疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明首先提供了一種用于pcr擴(kuò)增的引物序列組合，所述組合分為上游引物和下游引物，(1)所述上游引物含有的核苷酸序列選自以下的序列集合：如seqidno.12所示核苷酸序列的第1-150bp之間范圍的長(zhǎng)度為15-25bp的核苷酸序列；以及(2)所述下游引物含有的核苷酸序列選自以下的序列集合：如seqidno.12所示核苷酸序列的第300-444bp之間范圍的長(zhǎng)度為15-25bp的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述上游引物含有的核苷酸序列選自seqidno.1、3、5、7、9或者11；所述下游引物含有的核苷酸序列選自seqidno.2、4、6、8或者10。優(yōu)選地，所述序列組合的上游引物和下游引物分別為(1)seqidno.1與seqidno.2；或者(2)seqidno.3與seqidno.4；或者(3)seqidno.5與seqidno.6；或者(4)seqidno.7與seqidno.8；或者(5)seqidno.9與seqidno.10；或者(6)seqidno.11與seqidno.2；或者(7)seqidno.9與seqidno.4；或者(8)seqidno.7與seqidno.6。更為優(yōu)選地，所述序列組合的上游引物和下游引物為seqidno.5與seqidno.6?；蛘?，所述序列組合的上游引物和下游引物為seqidno.7與seqidno.8。其次，本發(fā)明還提供了一種pcr擴(kuò)增的方法，所述方法包括以下步驟：(1)提取待擴(kuò)增樣本的dna；(2)將步驟(1)獲得的dna置于pcr擴(kuò)增系統(tǒng)，并加入擴(kuò)增引物、dntp、taq酶及擴(kuò)增緩沖液，所述擴(kuò)增引物選自上文任一所述的引物；(3)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增的退火溫度為58℃～64℃。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(2)的擴(kuò)增為普通pcr擴(kuò)增。在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(2)的擴(kuò)增為sybrgreenreal-timepcr擴(kuò)增。優(yōu)選地，在pcr擴(kuò)增完成后，將反應(yīng)溫度自退火溫度55℃升溫至95℃收集熒光，測(cè)定產(chǎn)物熔解曲線。本發(fā)明提供的序列組合及用于對(duì)腦膜炎敗血伊麗莎白菌基因組中片段ema的pcr擴(kuò)增，顯示了優(yōu)異的特異性和敏感性，對(duì)在細(xì)菌鑒定中容易與腦膜炎敗血伊麗莎白菌混淆的腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、李斯特菌、肺炎支原體、百日咳鮑特菌、肺炎克雷伯菌及結(jié)核分支桿菌等易引起腦膜炎及上呼吸道癥狀的常見病原菌均能夠一次性區(qū)別開來(lái)，而且檢測(cè)下限可達(dá)10-4ng/μl。本發(fā)明對(duì)腦膜炎及上呼吸道癥狀的常見病原菌的鑒定具有重要的意義和廣泛的應(yīng)用前景。附圖說明圖1.基于腦膜炎敗血伊麗莎白菌的序列比對(duì)及引物設(shè)計(jì)位置示意圖；圖2.特異性核酸片段ema位置示意圖；圖3.8組引物pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；圖4.a和b組引物pcr擴(kuò)增特異性電泳圖譜；圖5.c和d組引物pcr擴(kuò)增特異性電泳圖譜；圖6.e和f組引物pcr擴(kuò)增特異性電泳圖譜；圖7.g和h組引物pcr擴(kuò)增特異性電泳圖譜；圖8.sybrgreenreal-timepcr八組引物特異性擴(kuò)增曲線；圖9.a1-a3特異性擴(kuò)增熔解曲線差異比較圖；圖10.f1-f3-f8特異性擴(kuò)增熔解曲線差異比較圖；圖11.b1-b7特異性擴(kuò)增熔解曲線差異標(biāo)記圖；圖12.8組引物敏感性驗(yàn)證電泳圖譜；圖13.sybrgreenreal-timepcr敏感性驗(yàn)證擴(kuò)增圖譜具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。擴(kuò)增靶片段ema的比對(duì)和確定本發(fā)明利用已有腦膜炎敗血伊麗莎白菌及同屬其他種及亞種基因組信息，通過相似性比對(duì)，找到相對(duì)特異性核酸片段ema(參考序列的genbank信息為：asan01000002.1147333-147776>lcl|query_239012:147333-147776gi|507153071|gb|asan01000002.1|elizabethkingiameningosepticaatcc13253＝nbrc12535strainatcc13253contig00002)。該片段長(zhǎng)度為444bp，其序列如seqidno.12所示，其具體序列與其他已有基因組比較結(jié)果如圖1所示。圖1為所選特異性核酸序列ema在部分腦膜炎敗血伊麗莎白菌基因組中比對(duì)結(jié)果及所設(shè)計(jì)特異性引物seqidno.1～seqidno.11在該核酸序列中位置示意圖，圖1中參與比對(duì)的腦膜炎敗血伊麗莎白菌基因組對(duì)應(yīng)相關(guān)菌株編號(hào)分別為(從上至下：atcc13253、nbrc12535、ccug214、em1、em3、nv2016、kc1913、em2)。比對(duì)結(jié)果顯示，該444bp長(zhǎng)度的核酸片段已有的腦膜炎敗血伊麗莎白菌中均存在高度相似性片段，部分其他腦膜炎敗血伊麗莎白菌基因組中該片段存在部分snp位點(diǎn)或片段缺失。表1列出此研究中為比較ema序列在伊麗莎白菌屬中的特異性選用的存在于現(xiàn)有技術(shù)的伊麗莎白菌屬中相關(guān)基因組及相關(guān)索引編號(hào)。表1.交叉比對(duì)尋找腦膜炎敗血伊麗莎白菌特異性核酸片段所選用的基因組相關(guān)信息insdc：國(guó)際核苷序列聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)索引編碼；genbank：基因組數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)genbankassemblyaccession：基因組數(shù)據(jù)庫(kù)組裝序列號(hào)refseqassemblyaccession：參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)組裝序列號(hào)通過比對(duì)可知，該片段具有腦膜炎敗血伊麗莎白菌種特異性，其片段與其他已有基因組比較結(jié)果顯示，大部分區(qū)域可以作為特異引物設(shè)計(jì)區(qū)域，設(shè)計(jì)引物可以進(jìn)行腦膜炎敗血伊麗莎白菌pcr鑒定。所選擇特異性核酸片段被命名為ema，位置如圖2所示，ema片段位于duf4872與murnac-laa之間間隔區(qū)上。引物設(shè)計(jì)根據(jù)pcr擴(kuò)增的靶片段ema設(shè)計(jì)了6條上游引物(-f)，和5條下游引物(-r)，其位點(diǎn)和序列如表2所示。表2.引物序列及退火溫度引物名稱位點(diǎn)序列(5'-3')退火溫度ema9-f9seqidno.147.4ema443-r443seqidno.247.2ema27-f27seqidno.349.8ema439-r439seqidno.450.6ema58-f58seqidno.551.7ema417-r417seqidno.652.4ema85-f85seqidno.755.4ema330-r330seqidno.856ema132-f132seqidno.947ema391-r391seqidno.1048.5ema175-f175seqidno.1147.6引物組合如表3所示表3.pcr擴(kuò)增引物組合表參考菌株及dna制備：腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)腦膜炎奈瑟菌(cmcc29356)、流感嗜血桿菌(cdccontrolisolatem5216)、金黃色葡萄球菌(atcc25923)、肺炎鏈球菌(atcc49619)、大腸桿菌(atcc25922)、單增李斯特菌(slcc2372)、肺炎支原體(atcc29342)、百日咳鮑特菌(atcc9797)、肺炎克雷伯菌(cmcc46114)及結(jié)核分支桿菌(h37rv)，各參考菌株經(jīng)適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)后，均采用qiaampdnaminikit提取試劑盒制備dna。實(shí)施例1：pcr擴(kuò)增體系的建立普通pcr試劑及反應(yīng)體系和條件：premixtaqmix(takaralot：rr901a)；引物通過primer3.0軟件設(shè)計(jì)，由奧科鼎盛公司合成；瓊脂糖(biowestlot：11176)；goldview核酸染色劑(solarbiolot：g8140)；100bpdnamarker(全式金lot：bm301-02)；凝膠成像系統(tǒng)bio-redgeldocxr；sensquestpcr擴(kuò)增儀；eppendorf5415d離心機(jī)；dyy-8c(北京市六一儀器廠)。反應(yīng)體系：名稱體積(ul)終濃度2×taqmix25上游引物2400nm下游引物2400nm模板dna2h2o19總體積50ul反應(yīng)條件：sybrgreenreal-timepcr檢測(cè)試劑及反應(yīng)體系：ultrasybrmixture(lowrox)(康為世紀(jì)lot：cw2601m)；引物通過primer3.0軟件設(shè)計(jì)，由奧科鼎盛公司合成；stratagenemx3000p熒光定量pcr儀。反應(yīng)體系：名稱體積(ul)終濃度2×ultrasybrmix1050×roxdye0.4上游引物1400nm下游引物1400nm模板dna2h2o5.6總體積20ul反應(yīng)條件：a：a組引物退火溫度64℃，b、e、f、g組引物退火溫度58℃，c、d、h組引物退火溫度61℃；b：此步驟末期收集熒光；c：此步驟從55℃升溫至95℃全程收集熒光，測(cè)定產(chǎn)物熔解曲線。圖3為各引物組合陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜，其中，1.100bpdna分子量標(biāo)記，2.a引物組合陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，3.b引物組合陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，4.c引物組合陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，5.d引物組合陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，6.e引物組合陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，7.f引物組合陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，8.g引物組合陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，9.h引物組合陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4-圖7為分組顯示每組引物的特異性擴(kuò)增結(jié)果，圖4泳道1和14、圖5、圖6和圖7的泳道1皆為100bpdna分子量標(biāo)記。圖4泳道2-12為a組引物對(duì)各個(gè)菌株的擴(kuò)增結(jié)果，泳道15-25為b組引物對(duì)各個(gè)菌株的擴(kuò)增結(jié)果；圖5泳道2-12為c組引物對(duì)各個(gè)菌株的擴(kuò)增結(jié)果，泳道14-25為d組引物對(duì)各個(gè)菌株的擴(kuò)增結(jié)果；圖6泳道2-12為e組引物對(duì)各個(gè)菌株的擴(kuò)增結(jié)果，泳道14-25為f組引物對(duì)各個(gè)菌株的擴(kuò)增結(jié)果；圖7泳道2-12為g組引物對(duì)各個(gè)菌株的擴(kuò)增結(jié)果，泳道14-25為h組引物對(duì)各個(gè)菌株的擴(kuò)增結(jié)果。圖4的泳道13為a組與b組引物陰性質(zhì)控品擴(kuò)增結(jié)果，圖5-圖7的泳道13分別為c、e和g組引物陰性質(zhì)控品擴(kuò)增結(jié)果，圖5-圖7的泳道25分別為d、f和h組引物陰性質(zhì)控品擴(kuò)增結(jié)果。圖4、圖5、圖6和圖7中自泳道2至泳道12，以及圖4中自泳道15至泳道25，圖5、圖6和圖7中自泳道14至泳道24中的擴(kuò)增菌株依次為：腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)、腦膜炎奈瑟菌(cmcc29356)、流感嗜血桿菌(cdccontrolisolatem5216)、金黃色葡萄球菌(atcc25923)、肺炎鏈球菌(atcc49619)、大腸桿菌(atcc25922)、單增李斯特菌(slcc2372)、肺炎支原體(atcc29342)、百日咳鮑特菌(atcc9797)、肺炎克雷伯菌(cmcc46114)、結(jié)核分支桿菌(h37rv)。從圖4-到圖7中可以看出，所設(shè)置的陰性對(duì)照：圖4-圖7的泳道13，圖5-圖7的泳道25均為陰性擴(kuò)增結(jié)果，圖4-圖7的泳道2，圖4的泳道15，圖5-圖7的泳道14，8組引物的擴(kuò)增均為陽(yáng)性，這些泳道的擴(kuò)增菌株均為腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)，8組引物對(duì)其余菌株的擴(kuò)增均為陰性，顯示了本發(fā)明8組引物對(duì)腦膜炎敗血伊麗莎白菌擴(kuò)增的的高度特異性。實(shí)施例2：普通pcr及sybrgreenreal-timepcr特異性驗(yàn)證：特異性檢測(cè)：同時(shí)對(duì)腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)腦膜炎奈瑟菌(cmcc29356)、流感嗜血桿菌(cdccontrolisolatem5216)、金黃色葡萄球菌(atcc25923)、肺炎鏈球菌(atcc49619)、大腸桿菌(atcc25922)、單增李斯特菌(slcc2372)、肺炎支原體(atcc29342)、百日咳鮑特菌(atcc9797)、肺炎克雷伯菌(cmcc46114)及結(jié)核分支桿菌(h37rv)進(jìn)行檢測(cè)。分別使用a、b、c、d、e、f、g及h引物組合針對(duì)上述易引起腦膜炎及上呼吸道癥狀的常見病原菌進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，驗(yàn)證引物的特異性。特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，a組引物針對(duì)流感嗜血桿菌可出現(xiàn)非目的片段大小的擴(kuò)增產(chǎn)物(目的片段為400bp左右，流感嗜血桿菌擴(kuò)增產(chǎn)物約為200bp左右)，其他引物組合均呈現(xiàn)良好特異性，未出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。sybrgreenreal-timepcr特異性驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果大部分與普通pcr檢測(cè)結(jié)果一致，其中a3、f3、f8雖然有擴(kuò)增曲線，但是擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線與目的片段熔解曲線明顯不同可判定為非特異性擴(kuò)增。b組引物在擴(kuò)增單增李斯特菌dna中出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，且通過熔解曲線難以與腦膜炎敗血伊麗莎白菌進(jìn)行區(qū)分。圖8為各組引物的sybrgreenreal-timepcr特異性擴(kuò)增結(jié)果，其中，a1～h1分別為a、b、c、d、e、f、g和h引物組合對(duì)腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)的擴(kuò)增曲線；f3、a3分別為f及a引物組合對(duì)流感嗜血桿菌(cdccontrolisolatem5216)的擴(kuò)增曲線；b7為b引物組合對(duì)單增李斯特菌(slcc2372)的擴(kuò)增曲線；f8為f組引物對(duì)肺炎支原體(atcc29342)擴(kuò)增曲線；從圖8中可以看出，a、b、c、d、e、f、g和h引物組合對(duì)腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)的擴(kuò)增具有非常高的特異性。圖9為a組引物擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物熔解曲線結(jié)果；其中，a和a3分別為對(duì)腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)和流感嗜血桿菌(cdccontrolisolatem5216)的擴(kuò)增；圖10為f組引物擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物熔解曲線結(jié)果；其中f1、f3和f8分別為對(duì)腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)、流感嗜血桿菌(cdccontrolisolatem5216)和肺炎支原體(atcc29342)的擴(kuò)增。圖11為b組引物擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物熔解曲線結(jié)果；其中b1和b7分別為對(duì)腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)和單增李斯特菌(slcc2372)的擴(kuò)增；從圖9-11中可以看出，a、f和b組引物物組合對(duì)腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)的擴(kuò)增顯示了與其他對(duì)照菌株的完全不同的特異性熔解曲線。實(shí)施例3：普通pcr及sybrgreenreal-timepcr敏感性驗(yàn)證以腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)1ng/ul濃度核酸為原液，倍比(10倍)稀釋，稀釋后的樣品分別用普通pcr及熒光定量pcr方法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)新鮮制備腦膜炎敗血伊麗莎白菌atcc13253菌株的dna定量檢測(cè)后分別稀釋至10-1ng/μl(1ng/μl≈4.28*105copy/ul)、10-2ng/μl、10-3ng/μl、10-4ng/μl、10-5ng/μl、10-6ng/μl、10-7ng/μl、10-8ng/μl，進(jìn)行敏感性驗(yàn)證。圖12顯示了a、b、c、d、e、f、g和h引物組合普通pcr方法檢測(cè)腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)敏感性結(jié)果，在各組的電泳檢測(cè)中，泳道從左至右的排列順序均為：100bpdna分子量標(biāo)記、10-1ng/μl模板、10-2ng/μl模板、10-3ng/μl模板、10-4ng/μl模板、10-5ng/μl模板、10-6ng/μl模板、10-7ng/μl模板、10-8ng/μl模板。圖12顯示各組引物的檢測(cè)下限可達(dá)10-4ng/μl。圖13為分組顯示a、b、c、d、e、f、g和h引物組合sybrgreenreal-timepcr方法檢測(cè)腦膜炎敗血伊麗莎白菌(atcc13253)敏感性結(jié)果。圖13顯示各組引物的檢測(cè)下限可達(dá)10-4ng/μl。敏感性檢測(cè)結(jié)果匯總：各引物組無(wú)論普通pcr及sybrgreenreal-timepcr大多數(shù)敏感性均相似，檢測(cè)下限可達(dá)10-4ng/μl，其中普通pcr檢測(cè)中f組檢測(cè)敏感性略低，僅達(dá)10-3ng/μl。序列表<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所<120>一組用于腦膜炎敗血伊麗莎白菌pcr檢測(cè)的引物組合<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>1aggaagtattggatcagtct20<210>2<211>19<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>2atatttcggatcattctca19<210>3<211>17<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>3ctcatttcttggagggg17<210>4<211>19<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>4ttcggatcattctcaaaag19<210>5<211>23<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>5agcaaatctgatagataaacatg23<210>6<211>20<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>6ggggttaagcaaaaagttta20<210>7<211>24<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>7ctttcgactaattcttattcctga24<210>8<211>21<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>8ttggcattgaatgactgaaac21<210>9<211>20<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>9atgctgtgattcatttactt20<210>10<211>20<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>10ctgaagaggaaaaattttct20<210>11<211>17<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>11agcctcatgctaaacgt17<210>12<211>444<212>dna<213>elizabethkingiameningoseptica<400>12aattaaataggaagtattggatcagtctcatttcttggaggggaattaataatctatagc60aaatctgatagataaacatgagttctttcgactaattcttattcctgagggagtattcct120ccggaatacgtatgctgtgattcatttacttttacacagatctggctcctccggagcctc180atgctaaacgttctgatttttaatccgaagaagctcctaacggaactttatctctttagg240attataatgatgagtattcacagcgttccgtaggaacattatcttatatggaagattaac300aaatccaatgtttcagtcattcaatgccaaaattaaaaaacttcagattacaattgagag360gagtaacagatagaaaatttttcctcttcagattagctaaactttttgcttaacccccaa420cttttgagaatgatccgaaatatt444當(dāng)前第1頁(yè)12