本發(fā)明涉及一種季銨化柱5芳烴的合成方法，本發(fā)明同時(shí)還涉及該季銨化柱5芳烴在熒光識(shí)別l-色氨酸的應(yīng)用，屬于化合物的合成技術(shù)領(lǐng)域及氨基酸的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

二十種天然氨基酸，作為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元和重要的代謝物，在維持生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如特異性免疫，調(diào)節(jié)代謝，神經(jīng)調(diào)節(jié)，器官功能等。每個(gè)氨基酸缺失都會(huì)引起相應(yīng)的疾病。由于氨基酸在化學(xué)和生物學(xué)中起著重要作用，他們的識(shí)別和檢測(cè)已經(jīng)引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。在氨基酸中，l-色氨酸（l-trp）是體內(nèi)重要的氨基酸，它可以有效預(yù)防眼瞼和抑郁癥，改善睡眠和情緒調(diào)節(jié)。因此，很有必要大力研究和開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)l-trp的傳感器。

測(cè)定氨基酸的方法有已報(bào)道，如高效液相色譜，分光光度法，電化學(xué)，質(zhì)譜法和電泳法。然而，這些方法高成本、低靈敏度、以及樣品的復(fù)雜預(yù)處理。熒光檢測(cè)一直受到許多學(xué)者的關(guān)注，因?yàn)槠涑杀镜?，靈敏度高。因此，合成檢測(cè)l-trp的熒光傳感器用具有十分重要的意義。

柱芳烴作為一類(lèi)新的超分子主體化合物，在主客體化學(xué)方面已經(jīng)展示出非常出色的效果。通過(guò)對(duì)柱芳烴結(jié)構(gòu)的修飾，許多主客體化學(xué)體系得到很好的發(fā)展。眾所周知，柱5芳烴提供一個(gè)很好的大π電子空腔，所以具有一定的組裝能力。l-trp由于自身獨(dú)特的吲哚基團(tuán)，可以與柱5芳烴的π電子空腔發(fā)生主客體絡(luò)合。因此，利用柱芳烴的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，可作為新的識(shí)別體系用于l-trp的識(shí)別。cn201610200496.6（我們課題組前期的研究成果）公開(kāi)了對(duì)稱(chēng)性柱5芳烴作為受體比色熒光識(shí)別l-色氨酸的應(yīng)用，即在對(duì)稱(chēng)性柱5芳烴的dmso/ch3ch2oh/h2o體系中，加入l型氨基酸gly，asp，met，pro，thr，leu，val，glu，cys，tys，ala，gln，asn，ser，phe，ile，lys，arg、his的溶液，只有l(wèi)-色氨酸的加入，能使對(duì)稱(chēng)性柱5芳烴的溶液熒光打開(kāi)。雖然對(duì)稱(chēng)性柱5芳烴可在20中l(wèi)型必需氨基酸中單一性檢測(cè)l-色氨酸，但是，由于其識(shí)別是在dmso/ch3ch2oh/h2o體系中進(jìn)行，溶液體系相對(duì)復(fù)雜，而且含水量相對(duì)較少；同時(shí)，主體難溶于水，而且對(duì)于l-色氨酸的響應(yīng)速度比較慢（響應(yīng)時(shí)間為20分鐘左右）。這些因素極大地影響了識(shí)別的操作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種季銨化柱5芳烴的合成方法；

本發(fā)明的另一目的是提供季銨化柱5芳烴在熒光檢測(cè)l-trp的應(yīng)用。

一、季銨化柱5芳烴的合成

以乙醇為溶劑，對(duì)稱(chēng)性共聚柱5芳烴與三甲胺以1:5~1:8的摩爾比于78℃回流反應(yīng)20~24h，冷卻至室溫，減壓旋蒸干溶劑，得到白色固體，用乙醇洗滌，得到季銨化柱5芳烴，標(biāo)記為：btap5。其結(jié)構(gòu)式為：

。

二、季銨化柱5芳烴的氨基酸識(shí)別性能

1、對(duì)氨基酸的熒光識(shí)別性能

分別移取0.5mlbtap5的二甲基亞砜溶液（2×10^-3mol·l^-1）于一系列10ml比色管中，然后分別在btap5的溶液中加入l-trp，β-ala，l-arg，l-cys，l-gly，l-lys，l-pro，l-met，l-thr，l-ser，l-his，l-val，l-tyr，l-asn，l-glu，l-gln，l-ile，l-phe，dl-asp和l-leu的水溶液（0.002mol·l^-1）2.5ml，加蒸餾水1.0ml，再用二甲基亞砜稀釋至5ml，此時(shí)btap5的濃度為2×10^-4mol·l^-1，氨基酸濃度為btap5濃度的5倍。混合均勻后放置，觀察受體對(duì)氨基酸的響應(yīng)。

發(fā)現(xiàn)，在btap5的溶液中，分別加入上述氨基酸溶液后，在相應(yīng)的紫外光譜中，在255nm處均有吸收峰。在其相應(yīng)的熒光發(fā)射譜中，只有l(wèi)-trp的加入使btap5在330nm處的發(fā)射峰消失（圖1），而其余陽(yáng)離子的加入對(duì)btap5溶液的熒光光譜無(wú)明顯影響。相應(yīng)的，l-trp的加入使btap5溶液的熒光很快猝滅，而其余陽(yáng)離子的加入對(duì)btap5溶液的熒光沒(méi)有影響。需要強(qiáng)調(diào)的是，btap5對(duì)于l-trp的響應(yīng)時(shí)間只有35s。

2、季銨化柱5芳烴與l-trp的滴定實(shí)驗(yàn)

移取2.0mlbtap5的dmso(含水70%)溶液（2.0×10^-4mol·l^-1）于石英池中，用累積加樣法逐漸加入l-trp的水溶液，于25℃測(cè)其熒光發(fā)射光譜（圖2）。滴定實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，btap5的熒光強(qiáng)度受到l-trp濃度的影響，伴隨著l-trp濃度的增加而減弱。并且根據(jù)滴定實(shí)驗(yàn)得到了btap5對(duì)l-trp的熒光光譜的檢測(cè)限為2.83×10^?7mol/l。由此說(shuō)明，btap5能單一選擇性熒光識(shí)別l-trp，而且對(duì)l-trp的檢測(cè)靈敏度很高，因此，btap5在l-trp檢測(cè)方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖3為不同濃度的l-trp（0~3.0倍）存在下btap5的擬合直線圖。擬合直線圖能夠清晰明了的反映btap5的熒光強(qiáng)度在0~3.0倍l-trp濃度范圍內(nèi)的變化趨勢(shì)。通過(guò)擬合直線圖可以發(fā)現(xiàn)，l-trp在0~3.0倍當(dāng)量時(shí)與btap5的熒光強(qiáng)度呈較好的線性關(guān)系如下：

y=-187.7435x+759.19789；r²=0.9975

其中，y——btap5的熒光強(qiáng)度，x——l-trp的相對(duì)濃度。

3、季銨化柱5芳烴的氨基酸抗干擾性能檢測(cè)

為了測(cè)定btap5對(duì)l-trp的檢測(cè)效果，我們又進(jìn)行了如下測(cè)試：取兩組10ml比色管分別加入0.5ml該btap5溶液，再分別加入2.5ml各種氨基酸的水溶液（2×10^-3mol·l^?1），加蒸餾水1.0ml，然后用二甲基亞砜稀釋至5ml刻度。另外一組中再分別加2.5mll-trp，在每一個(gè)比色管中分別加入1.0mlβ-al，l-arg，l-cys，l-gly，l-lys，l-pro，l-met，l-thr，l-ser，l-his，l-val，l-tyr，l-asn，l-glu，l-gln，l-ile，l-phe，dl-asp，l-leu的水溶液（0.005mol·l^-1），然后用二甲基亞砜稀釋至5ml刻度。將上述溶液混合均勻后進(jìn)行觀察。

上述溶液靜置后于25℃測(cè)其熒光發(fā)射光譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入上述十九種氨基酸后，只有btap5在330nm處熒光很快猝滅，這與l-trp對(duì)btap5的影響是一致的。從而說(shuō)明該類(lèi)btap5化合物檢測(cè)l-trp不受其它氨基酸的干擾（見(jiàn)圖4）。

實(shí)驗(yàn)表明，在btap5的含水二甲基亞砜溶液中，水的體積百分?jǐn)?shù)為60~80%，季銨化柱5芳烴的濃度為2×10^-5~4×10^-5mol·l^-1，btap5能高靈敏度的單一選擇性熒光識(shí)別l-trp，而且l-trp的濃度與btap5的熒光強(qiáng)度呈上述線性關(guān)系。

4、季銨化柱5芳烴檢測(cè)l-trp的機(jī)理

季銨化柱5芳烴提供一個(gè)很好的空腔結(jié)構(gòu)，所以具有合適結(jié)構(gòu)大小的客體可以穿入到它的空腔中達(dá)到主客體包結(jié)的結(jié)果；季銨化后的柱芳烴具有很好的水溶性，這極大地解決了主體在水體系中識(shí)別氨基酸的困擾。另外，季銨化后的柱芳烴的熒光相對(duì)較強(qiáng)，因而在短時(shí)間內(nèi)對(duì)l-trp達(dá)到識(shí)別效果。因此，可作為新的識(shí)別體系用于l-trp的識(shí)別。

附圖說(shuō)明

圖1為btap5以及加入20種的氨基酸時(shí)的熒光光譜（激發(fā)波長(zhǎng)：255nm，發(fā)射波長(zhǎng)330nm）。

圖2為不同濃度的l-trp（0~7.75倍）存在下btap5的熒光光譜。

圖3為不同濃度的l-trp（0~3.0倍）存在下btap5的擬合直線圖。

圖4為btap5對(duì)l-trp識(shí)別的抗干擾性能；1~20分別代表btap5，β-ala，l-arg，l-cys，l-gly，l-lys，l-pro，l-met，l-thr，l-ser，l-his，l-val，l-tyr，l-asn，l-glu，l-gln，l-ile，l-phe，dl-asp和l-leu。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明btap5的合成以及熒光檢測(cè)l-trp的應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1、季銨化柱5芳烴的合成

（1）對(duì)稱(chēng)性柱5芳烴的合成

中間體1的合成：將對(duì)苯二酚（2.2g，20.0mmol）、k2co3（13.8g，100mmol）、ki（0.83g，5mmol）、peg-400（4ml，10mmol）、1,4二溴丁烷（17.28g，80mmol）和丙酮（300~400ml）加入到500ml圓底燒瓶中，攪拌反應(yīng)（36h），冷卻至室溫，抽濾去除無(wú)機(jī)鹽后，減壓旋蒸干溶劑，柱色譜分離，得白色固體即為中間體化合物1。產(chǎn)率為80%；m.p:83~85^°c;¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):δ6.81(s,4h),3.94(dd,j=10.0,5.8hz,4h),3.48(t,j=6.6hz,2h),3.26(t,j=6.8hz,2h),2.09-1.85(m,8h)。

對(duì)稱(chēng)性柱5芳烴2的合成：將1,2-二氯乙烷（300ml）加入到500ml圓低燒瓶中，在其中加入中間體化合物1（1.9g，5mmol）、對(duì)苯二甲醚（2.76g，20mmol）、多聚甲醛（0.75g，25mmol）三氟化硼乙醚（6.75ml（47%），25mmol），室溫下反應(yīng)3~4h，然后用甲醇沉淀，氯仿萃取，蒸餾水萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，有機(jī)相用柱色譜分離，得白色固體即為對(duì)稱(chēng)性柱5芳烴2。產(chǎn)率:34%；m.p:187-189^°c;¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ6.84–6.74(m,10h),3.87(t,j=5.9hz,4h),3.83–3.78(m,10h),3.72(t,j=19.9hz,24h),3.33(s,4h),1.94(s,4h),1.84(s,4h);esi-msm/z:(m+nh4)⁺calcdforc51h64o10br2n1010.2871;found1010.2878。

（2）季銨化柱5芳烴的合成：將80ml乙醇加入到500ml圓低燒瓶中，在其中加入對(duì)稱(chēng)性柱5芳烴2（0.5g，0.5mmol）、三甲胺（33%體積的乙醇溶液，1.0ml，3.7mmol），78℃回流反應(yīng)24h，冷卻至室溫，減壓旋蒸干溶劑，得到白色固體，再用乙醇洗滌2~3次，得白色固體即為季銨化柱5芳烴btap5。產(chǎn)率:93%。m.p:176?178°c.¹hnmr(600mhz,d2o/dmso-d6(4:1,v/v))δ6.84–6.54(m,10h),3.65(s,4h),3.51(dd,j=23.6,16.5hz,18h),3.23(t,j=24.3hz,10h),3.07–2.94(m,24h),1.76(d,j=84.5hz,12h);esi?msm/z:(m-2br)²⁺calcdforc57h78o10n2475.2823;found475.2828。

其合成路線如下：

實(shí)施例2、用btap5熒光識(shí)別l-trp

在btap5的二甲基亞砜溶液中（2×10^-4mol·l^-1），分別加入l-trp，β-ala，l-arg，l-cys，l-gly，l-lys，l-pro，l-met，l-thr，l-ser，l-his，l-val，l-tyr，l-asn，l-glu，l-gln，l-ile，l-phe，dl-asp和l-leu的水溶液（1×10^-3mol·l^-1），若btap5溶液的熒光猝滅，則說(shuō)明加入的是l-trp，若btap5溶液的熒光沒(méi)有發(fā)生變化，則說(shuō)明加入的不是l-trp。

實(shí)施例3、用btap5檢測(cè)l-trp濃度

在4mlbtap5的二甲基亞砜溶液中（2×10^-4mol·l^-1），加入1mll-trp水溶液，于25℃測(cè)其熒光發(fā)射光譜，溶液的熒光強(qiáng)度為635.4。根據(jù)btap5溶液的熒光強(qiáng)度與l-trp的濃度的線性關(guān)系，計(jì)算出l-trp濃度。

btap5溶液的熒光強(qiáng)度與l-trp的濃度的線性關(guān)系如下：

y=-187.7435x+759.19789；r²=0.9975

其中，y——btap5溶液的熒光強(qiáng)度，x——l-trp的相對(duì)濃度。

計(jì)算出l-trp溶液的濃度為1.3×10^-4mol·l^-1。