本發(fā)明涉及新型化合物及其用途，具體涉及一種異鳥嘌呤類型化合物(i)的制備方法及其抗病毒的用途，屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)已經(jīng)成為全球性的危害。由其引發(fā)的慢性乙型肝炎(chronichepatitisb，chb)是肝臟疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素，可導(dǎo)致肝硬化、肝癌及肝功能衰竭等多種并發(fā)癥的發(fā)生，給人類生命和健康帶來嚴(yán)重威脅。盡管乙肝疫苗接種已實施多年，但全球每年因乙肝相關(guān)疾病死亡的人數(shù)仍高達(dá)60多萬。而我國是世界上hbv感染率最高的國家之一，hbv攜帶者占總?cè)丝诒壤哌_(dá)10％，其中慢性乙肝患者約3000萬例，每年約有30萬人死于慢性乙肝相關(guān)疾病。乙肝的治療已經(jīng)成為我國亟代解決的社會公共衛(wèi)生難題。

我國具有幾千年利用天然藥物治療疾病的悠久歷史，中草藥資源豐富，中醫(yī)中藥理論博大精深。中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)為天然產(chǎn)物，具有結(jié)構(gòu)豐富、活性獨(dú)特、毒副性低、作用靶點(diǎn)多樣等特點(diǎn)，是創(chuàng)新藥物的重要來源。從中草藥中尋找新的高效低毒的抗hbv單體藥物是目前抗hbv藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一，實踐表明許多天然藥物治療乙型肝炎不僅具有明確的療效，而且毒副作用相對較小，這些實踐為人類從天然藥物中篩選新的抗hbv藥物奠定了基礎(chǔ)。

葉下珠屬(phyllanthus)是大戟科(euphorbiaceae)植物，我國約有30余種，主產(chǎn)于長江以南各省，資源豐富。近現(xiàn)代文獻(xiàn)資料表明，該屬植物具有利水解毒、平肝清熱的功效，在痢疾、腸炎、尿路感染和傳染性肝炎的臨床治療中經(jīng)常應(yīng)用，效果顯著。尤其是抗乙肝病毒活性，代表性植物葉下珠用于慢性肝炎的治療，其膠囊和分散片劑型，以及以葉下珠為主藥的復(fù)方藥肝康、肝丹等已被廣泛應(yīng)用于臨床。落萼葉下珠(phyllanthusflexuosus(sieb.etzucc.)muell.arg)是大戟科葉下珠屬植物，葉下珠親緣關(guān)系較近，味微澀，性平，具有清火解毒，除風(fēng)止癢，澀腸止瀉的功效。根可入藥，治小兒疳積，幼葉可治蛇咬傷，全草煎水外用，治過敏性皮炎，居住于云南省的傣族，通常以落萼葉下珠的全草(傣藥名：嘿桿巴)用來治療腹痛腹瀉，赤白下痢、疔瘡癰癤膿腫、皮膚瘙癢，麻疹等疾病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是在對上述植物進(jìn)行系統(tǒng)化學(xué)成分研究和藥效學(xué)研究的基礎(chǔ)上提出的，公開了一種新的具有抗乙型肝炎病毒(hbv)活性的異鳥類型嘌呤化合物，同時公開了一種異鳥嘌呤類型化合物的制備方法，以及該化合物在抗乙型病毒性肝炎(hbv)的用途。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種異鳥嘌呤類型化合物，結(jié)構(gòu)符合下述通式(i)

其中：r1是氨基、脂肪氨基、環(huán)烷氨基、吡咯烷基或r2是h、

進(jìn)一步的，上述異鳥嘌呤類型化合物為結(jié)構(gòu)式ii,

經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定命名為1-甲基-3-異戊烯基異鳥嘌呤[1-methyl-3-(3-methylbut-2-en-1-yl)isoguanine]。

一種異鳥嘌呤類型化合物的制備方法，提取工藝為：

1)落萼葉下珠phyllanthusflexuosus藥材粗粉，采用高濃度低級醇類提?。?/p>

2)提取液回收醇類溶劑后得浸膏，經(jīng)乙醇溶解后，經(jīng)大孔樹脂、反復(fù)硅膠柱層析、ods等操作制得；

其中：所述低級醇類的濃度為70％到100％；所述提取方法可為回流、浸漬、滲流、超聲、或微波提取的方法。

一種異鳥嘌呤類型化合物的用途，用于制備治療乙型病毒性肝炎(hbv)的藥物。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)比較，其優(yōu)點(diǎn)是：

本發(fā)明結(jié)構(gòu)式ii是從大戟科落萼葉下珠植物中提取分離得到的新化合物，提供了異鳥嘌呤類型化合物制備抗乙型病毒性肝炎的應(yīng)用。藥理試驗結(jié)果表明，化合物ii在體外對hbsag和hbeag的分泌都具有較顯著的抑制作用，且明顯強(qiáng)于對照組的拉米夫定(3tc)，而且在試驗范圍內(nèi)對細(xì)胞沒有毒害作用。

附圖說明

圖1為新化合物ii的分子結(jié)構(gòu)式；

圖2為新化合物ii的hr-esi-ms譜；

圖3為新化合物ii的¹h-nmr譜；

圖4為新化合物ii的¹³c-nmr譜；

圖5為新化合物ii的hsqc譜；

圖6為新化合物ii的hmbc譜；

圖7為新化合物ii的x單晶衍射結(jié)構(gòu)圖。

具體實施方式

實施例1：化合物ii的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定

落萼葉下珠的根(6.2kg)進(jìn)行粉碎后，用5倍量80％乙醇回流提取3次，每次3h，合并濾液，減壓濃縮得浸膏996g，乙醇溶解后過濾，過d101大孔樹脂，分別用純水、30％乙醇-水、70％乙醇-水、90％乙醇、100％乙醇洗脫得5個部位(a-e)，c部位進(jìn)行硅膠柱色譜層析，依次用體積比為50:1到1:4的二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，得到10個部位(c1-c10)。部位c5通過ods柱層析，依次用30％、50％、70％、90％、100％甲醇-水溶液洗脫得到9個部位(c5a-c5i)。組分c5d通過硅膠柱色譜用體積比為50:1到1:1的二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，最后經(jīng)ods柱層析，用質(zhì)量濃度為30％到40％的甲醇梯度洗脫得到化合物ii(11.9mg)。經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)構(gòu)式ii命名為1-甲基-3-異戊烯基異鳥嘌呤[1-methyl-3-(3-methylbut-2-en-1-yl)isoguanine]。

1-甲基-3-異戊烯基異鳥嘌呤[1-methyl-3-(3-methylbut-2-en-1-yl)isoguanine]，白色針狀結(jié)晶(甲醇)，分子式為c11h15n5o。化合物ii的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示；其hr-esi-ms譜如圖2所示；其hsqc譜如圖5所示；其hmbc譜如圖6所示；其x單晶衍射結(jié)構(gòu)圖如圖7所示。

化合物ii的¹h-和¹³c-nmr數(shù)據(jù)

白色針狀結(jié)晶；微溶于甲醇，易溶于dmso，不溶于氯仿、二氯甲烷等有機(jī)溶劑。tlc檢測，香草醛-濃硫酸顯色，加熱后呈紫色斑點(diǎn)；mp：267.5-271.9℃；84.2(c0.19,meoh)；irvmax(cm^–1)：3420，2939，1692，1612，1567，1412，1228，1127，1057，683，633；uv(meoh)λmax(logε)204(4.28)nm；hresims顯示分子離子峰m/z：232.1204[m-h]^-(calcd.c11h14n5o,232.1198)，256.1182[m+na]⁺(calcd.c11h15n5ona,256.1174)；分子式為c11h15n5o；¹hnmr(methanol-d4,400mhz)：δη1.82(3h,s,h-13)，1.68(3h,s,h-14)，3.52(3h,s,n1-me)，5.30(1h,t,j＝6.8hz,h-11)，4.69(2h,d,j＝6.8hz,h-10)，7.56(1h,s,h-8)；¹³cnmr(methanol-d4,100mhz)：δc151.1(c-2)，152.4(c-4)，111.4(c-5)，150.5(c-6)，151.8(c-8)，44.1(c-10)，119.5(c-11)，138.5(c-12)，18.4(c-13)，26.0(c-14)，31.2(n1-me)?；衔飅i的¹h-nmr譜參見附圖3，化合物ii的¹³c-nmr譜參見附圖4。

本發(fā)明異鳥嘌呤類型化合物，用于制備治療乙型病毒性肝炎(hbv)的藥物。

藥理試驗證明，1-甲基-3-異戊烯基異鳥嘌呤[1-methyl-3-(3-methylbut-2-en-1-yl)isoguanine]對hepg2.2.15細(xì)胞分泌hbsag和hbeag表達(dá)有明顯抑制作用，表現(xiàn)出良好的抗乙型肝炎病毒(hbv)活性，且在試驗范圍內(nèi)對細(xì)胞沒有毒害作用。

下面是藥理學(xué)試驗：

對hepg2.2.15細(xì)胞分泌hbsag和hbeag表達(dá)抑制活性測定：

在含有10％胎牛血清，300mg/mlg418，100mg/l青鏈霉素及4mmol/l谷氨酰胺的dmem高糖配培養(yǎng)液培養(yǎng)hepg2.2.15細(xì)胞株，取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細(xì)胞，用2.5g/l胰蛋白酶消化，加入新鮮培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液。血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度1×10⁸/l的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100μl，置co2培養(yǎng)箱(37℃，5％co2，飽和濕度)條件下培養(yǎng)24h后，換用含藥培養(yǎng)液，每種藥物以2.5％二甲基亞砜溶解，以培養(yǎng)基配成母液；每個藥物設(shè)4個質(zhì)量濃度，每個質(zhì)量濃度設(shè)3個復(fù)孔，以拉米夫定為陽性對照藥；每板設(shè)不加藥物的正常細(xì)胞和試劑空白作對照。每2日換同濃度藥液1次，藥物干預(yù)第6日時收集上清液置于-20℃保存待用。

取細(xì)胞上清液，采用酶聯(lián)免疫法，用乙肝表面抗原及e抗原檢測試劑盒使用elisa(酶聯(lián)免疫吸附試驗)法檢測培養(yǎng)液上清中的hbsag和hbeag，在酶標(biāo)儀上以450nm為檢測波長，630nm為參考波長進(jìn)行檢測，讀取各孔o(hù)d值。藥物對抗原的抑制百分率＝(細(xì)胞對照組平均a值–實驗組平均a值)/(細(xì)胞對照組平均a值–空白組平均a值)×100，ic50為hbsag或hbeag抑制率為50％時的藥物濃度。以上實驗均重復(fù)三次。

對細(xì)胞的毒性測定：

細(xì)胞毒通過mtt法來測定，棄去上清液的細(xì)胞孔，每孔加入5g/lmtt工作液50μl，置co2培養(yǎng)箱(37℃，5％co2，飽和濕度)孵育4h后吸棄孔內(nèi)溶液并加入dmso100μl/孔，平板搖床上振搖5min。酶標(biāo)儀測定各孔的od值，測定波長490nm，檢測藥物對細(xì)胞毒性作用。按公式計算細(xì)胞抑制率及半數(shù)毒性劑量(cc50)。藥物對細(xì)胞的破壞率＝(細(xì)胞對照組平均a值–實驗組平均a值)/(細(xì)胞對照組平均a值–空白組平均a值)×100，tc50為實驗孔存活細(xì)胞為對照孔50％時的藥物濃度。結(jié)果見表1：

表1

從表1可以看出，新化合物1-methyl-3-(3-methylbut-2-en-1-yl)isoguanine(結(jié)構(gòu)式ii)對hepg2.2.15細(xì)胞分泌hbsag和hbeag表達(dá)有明顯抑制作用，表現(xiàn)出良好的抗乙型肝炎病毒(hbv)活性，且在試驗范圍內(nèi)對細(xì)胞沒有毒害作用。

本發(fā)明還包括通式i藥學(xué)上可接受的鹽，這些鹽可以是無機(jī)酸鹽(如鹽酸鹽、硫酸鹽等)，也可以是有機(jī)酸(如醋酸鹽、草酸鹽、酒石酸鹽等)。這些化合物i的藥學(xué)可接受鹽具有與化合物同樣的藥理功效。

本發(fā)明所述的化合物可以添加藥學(xué)上可接受的載體制成常見的藥用制劑，如片劑、膠囊、粉劑、糖漿、液劑、懸浮劑、針劑，可添加藥劑學(xué)上常用的矯味劑、助溶劑、崩解劑、緩沖劑等藥用輔料。

本發(fā)明所述的化合物在臨床上的給藥方式可以采用口服、注射等給藥方式。

以上實施方式只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人了解本發(fā)明內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變化或修飾等的改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。