本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用細(xì)菌轉(zhuǎn)化和提取白藜蘆醇的方法。

背景技術(shù)：

白藜蘆醇(resveratrol)是一種具有天然活性的非黃酮類多酚物質(zhì)，化學(xué)名稱為芪三酚(3，5，4-三羥基二苯乙烯)，分子式為c14h12o3，為無(wú)色針狀結(jié)晶，較難溶于水，易溶于丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，光穩(wěn)定和熱穩(wěn)定性差，需于低溫、避光條件下保藏。

白藜蘆醇被喻為繼紫杉醇之后的又一新的綠色抗癌藥物。為一種植物抗毒素,是在植物受到病原性進(jìn)攻和環(huán)境惡化時(shí)產(chǎn)生的。具有抗癌、保護(hù)心血管系統(tǒng)、降低血糖、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的存活和增殖、特異性或非特異性免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)胃粘膜、抗抑郁及神經(jīng)保護(hù)、抑制腫瘤惡性增殖、美白、清除自由基、消炎潤(rùn)膚等功效。在醫(yī)藥、食品、保健品和化妝品等行業(yè)中有極廣泛的應(yīng)用。

植物提取白藜蘆醇效率低，溶劑使用量大；白藜蘆醇的光熱不穩(wěn)定性又限制了化學(xué)合成法在工業(yè)化生產(chǎn)白藜蘆醇上的應(yīng)用；酶法轉(zhuǎn)化白藜蘆醇，生產(chǎn)成本較高且不可再生，故工藝方法需不斷改進(jìn)提高；微生物細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化法因轉(zhuǎn)化率高，環(huán)境友好，便于分離純化而日漸興起，目前已有霉菌轉(zhuǎn)化白藜蘆醇的報(bào)道但細(xì)菌轉(zhuǎn)化法鮮有報(bào)道，而細(xì)菌發(fā)酵較霉菌發(fā)酵具有生產(chǎn)周期短、成本低、菌體濃度大、轉(zhuǎn)化效率高、反應(yīng)條件容易控制等優(yōu)點(diǎn)，更適于生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要目的是提供一種基于細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化和提取白藜蘆醇的方法，利用沙福芽孢桿菌細(xì)胞對(duì)虎杖粗藥材的作用轉(zhuǎn)化白藜蘆醇，且能以菌體為晶核結(jié)晶析出產(chǎn)物，無(wú)需外加物質(zhì)促進(jìn)產(chǎn)物結(jié)晶，工藝簡(jiǎn)單，便于分離提取，使后期的提取工藝更加簡(jiǎn)便、降低對(duì)環(huán)境的危害。

本發(fā)明技術(shù)方案概述如下：直接利用細(xì)菌——沙福芽孢桿菌(菌種保藏號(hào)：cgmccno.13129)細(xì)胞轉(zhuǎn)化虎杖粗藥材，白藜蘆醇在轉(zhuǎn)化過程中會(huì)自然析出。在該過程中，當(dāng)有白藜蘆醇逐漸生成時(shí)，由于產(chǎn)物與菌體相互作用，結(jié)晶析出，發(fā)酵液較菌體濃度最高時(shí)澄清，即發(fā)酵液整體呈現(xiàn)出由澄清到渾濁再到較澄清的狀態(tài)。菌體與產(chǎn)物相互作用，產(chǎn)物以菌體為晶核不斷析出。在此基礎(chǔ)上只需單步萃取，干燥即得白藜蘆醇，產(chǎn)品純度可高達(dá)99.3％。該方法操作簡(jiǎn)單，條件溫和，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，產(chǎn)物收率高。

添加有底物虎杖粗藥材的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種沙福芽孢桿菌種子液，28-37℃發(fā)酵6-15h，菌體濃度od600nm＝0.8-1.6時(shí)，開始有產(chǎn)物析出，菌體與底物、產(chǎn)物相互作用，在微生物的作用下產(chǎn)物以菌體為晶核結(jié)晶析出，發(fā)酵液離心、蒸餾水洗滌沉淀，向沉淀中加入有機(jī)溶劑單次提取、干燥即可得到產(chǎn)品白藜蘆醇。hplc-ms結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品出峰一致，分子量均為229.1，確為白藜蘆醇，檢測(cè)純度≥99％。

所述底物虎杖粗藥材(粉末狀)的添加量?jī)?yōu)選為0.05％-0.5％。

所述底物虎杖粗藥材中虎杖苷的純度優(yōu)選為30～100％。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化鈉0.5％，余量水。

所述沙福芽孢桿菌種子液的接種量?jī)?yōu)選為0.5-5％。

所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為乙醇。

所述乙醇純度優(yōu)選為60-100％。

所述有機(jī)溶劑的提取溫度優(yōu)選為4-28℃。

本發(fā)明提供的一株白藜蘆醇發(fā)酵菌，菌株的分類命名為沙福芽孢桿菌(bacillussafensis)，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmccno.13129，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期：2016年10月21日。該菌株生長(zhǎng)速度快，抗逆性強(qiáng)，作用廣譜，酶系豐富，可產(chǎn)生葡萄糖苷酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶，可降解虎杖粗藥材中的纖維素、木質(zhì)素、淀粉、蛋白等成分。

有益效果：

本發(fā)明技術(shù)所得的白藜蘆醇產(chǎn)品純度可高達(dá)99.3％(99.0％以上)，分離提取便捷，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備適應(yīng)性強(qiáng)、易操作，工藝簡(jiǎn)便可行。提取操作步驟簡(jiǎn)單，只需蒸餾水洗滌，單一溶劑單次萃取，干燥，即可使純度高達(dá)99.3％。有機(jī)溶劑使用量少，并可循環(huán)利用。轉(zhuǎn)化過程無(wú)需外加物質(zhì)，結(jié)晶后期發(fā)酵液整體呈現(xiàn)較澄清的狀態(tài)，簡(jiǎn)單處理可實(shí)現(xiàn)回收再利用。

附圖說明：

圖1：白藜蘆醇形成時(shí)與菌體的相互作用；

圖2：生物轉(zhuǎn)化后的發(fā)酵液；

圖3：白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品hplc-ms圖；

圖4：轉(zhuǎn)化產(chǎn)物hplc-ms圖；

圖5：轉(zhuǎn)化產(chǎn)物¹h-nmr圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例中涉及到的百分號(hào)“％”，若未特別說明，指質(zhì)量百分比，溶液的百分比指100ml中含有溶質(zhì)的克數(shù)，液體之間的百分比，是指在25℃時(shí)溶液的體積比例。

下述實(shí)施例中制備沙福芽孢桿菌種子液的種子培養(yǎng)基優(yōu)選：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，氯化鈉1％，余量水。所述沙福芽孢桿菌的保藏編號(hào)為cgmccno.13129。

實(shí)施例1：

將0.1％底物虎杖粗藥材加入到培養(yǎng)基(ph＝7.0)中，接入1％沙福芽孢桿菌種子液(od600nm＝1.0)，于37℃，200r/min，搖瓶發(fā)酵10h，已有產(chǎn)物析出。在5000r/min，4℃的條件下離心，棄去上清液；用水洗滌沉淀，離心去上清；向沉淀中加入純度為100％乙醇，再次在5000r/min，4℃的條件下離心，棄去沉淀；蒸發(fā)上清液中的有機(jī)溶劑，即可得到白藜蘆醇產(chǎn)品，純度為99.3％。

實(shí)施例2：

將0.3％底物虎杖粗藥材加入到培養(yǎng)基(ph＝7.0)中，接入3％沙福芽孢桿菌種子液(od600nm＝0.8)，于28℃，180r/min搖瓶發(fā)酵12h，有產(chǎn)物析出。在2000r/min，25℃的條件下離心，棄去上清液；用水洗滌沉淀，離心去上清；向沉淀中加入純度為80％的乙醇，再次在2000r/min，25℃的條件下離心，棄去沉淀；蒸發(fā)上清液中的有機(jī)溶劑，即可得到白藜蘆醇產(chǎn)品，純度為99.3％。

實(shí)施例3：

將0.1％底物虎杖粗藥材加入到培養(yǎng)基(ph＝5.0)中，接入3％沙福芽孢桿菌種子液(od600nm＝0.8)，于37℃，200r/min搖瓶發(fā)酵6h，有產(chǎn)物析出。在3000r/min，25℃的條件下離心，棄去上清液；用水洗滌沉淀，離心去上清；向沉淀中加入純度為90％的甲醇，再次在3000r/min，25℃的條件下離心，棄去沉淀；蒸發(fā)上清液中的有機(jī)溶劑，即可得到白藜蘆醇產(chǎn)品，純度為99.0％。

實(shí)施例4：

將0.5％底物虎杖粗藥材加入到培養(yǎng)基(ph＝7.0)中，接入5％沙福芽孢桿菌種子液(od600nm＝0.8)，于30℃，180r/min搖瓶發(fā)酵15h，有產(chǎn)物析出。在3000r/min，20℃的條件下離心，棄去上清液；用水洗滌沉淀，離心去上清；向沉淀中加入純度為70％的乙醇，再次在3000r/min，20℃的條件下離心，棄去沉淀；蒸發(fā)上清液中的有機(jī)溶劑，即可得到白藜蘆醇產(chǎn)品，純度為99.0％。