本發(fā)明申請(qǐng)是基于申請(qǐng)日為2010年9月29日、申請(qǐng)?zhí)枮?01080053990.5(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮閜ct/us2010/050709)、名稱為“具有木聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。關(guān)于對(duì)在聯(lián)邦資助的研究和開發(fā)下完成的發(fā)明的權(quán)利的聲明本發(fā)明部分是在能源部授予的合作協(xié)議de-fc36-08go18080下以政府支持完成的。政府對(duì)本發(fā)明具有一定權(quán)利。涉及序列表本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，所述計(jì)算機(jī)可讀形式通過提述并入本文。涉及生物材料的保藏本申請(qǐng)包含對(duì)于生物材料保藏的引用，所述保藏通過提述并入本文。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及用于產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。相關(guān)領(lǐng)域描述纖維素是單糖葡萄糖通過β-1,4-鍵連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機(jī)位置消化纖維素聚合物，將其打開(openingit)以受到纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶繼而從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的β-1,4-連接的葡萄糖二聚體。β-葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將含木素纖維素原料(lignocellulosicfeedstock)轉(zhuǎn)化為乙醇具有以下優(yōu)勢(shì)：大量原料現(xiàn)成可用，避免燃燒或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認(rèn)為是用于乙醇生產(chǎn)的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，葡萄糖將容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。在本領(lǐng)域中，存在通過補(bǔ)充其他酶來(lái)改善纖維素分解蛋白組合物以增加效率和提供劃算的酶溶液以供降解木素纖維素的需要。本發(fā)明提供了具有木聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的分離的多肽，所述多肽選自下組：(a)多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與seqidno:2的成熟多肽具有至少90％同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于seqidno:1的成熟多肽編碼序列的cdna序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少90％同一性；和(d)seqidno:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及編碼具有木聚糖酶活性的多肽的分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自下組：(a)多核苷酸，其編碼包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與seqidno:2的成熟多肽具有至少90％同一性；(b)多核苷酸，其在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于seqidno:1的成熟多肽編碼序列的cdna序列或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多核苷酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少90％同一性；和(d)多核苷酸，其編碼seqidno:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體、重組宿主細(xì)胞，和產(chǎn)生具有木聚糖酶活性的多肽的方法。本發(fā)明還涉及抑制具有木聚糖酶活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，所述方法包括：對(duì)細(xì)胞施用或在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈rna(dsrna)分子，其中所述dsrna包含本發(fā)明的多核苷酸的亞序列。本發(fā)明還涉及這種雙鏈抑制性rna(dsrna)分子，其中任選地dsrna是sirna或mirna分子。本發(fā)明還涉及使用具有木聚糖酶活性的多肽降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料或含木聚糖材料的方法。本發(fā)明還涉及包含分離的多核苷酸的植物，所述多核苷酸編碼具有木聚糖活性的多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，其包括：(a)在有助于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述多核苷酸編碼具有木聚糖酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼信號(hào)肽的分離的多核苷酸，所述信號(hào)肽包含seqidno:2的氨基酸1至19，或由seqidno:2的氨基酸1至19組成；涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞；并涉及產(chǎn)生蛋白的方法。具體地，本發(fā)明涉及如下各項(xiàng)：1.具有木聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組：(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與seqidno:2的成熟多肽具有至少90％同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于seqidno:1的成熟多肽編碼序列的cdna序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼的多肽，所述核苷酸序列與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少90％同一性；和(d)seqidno:2的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。2.項(xiàng)1的多肽，其包含seqidno:2或seqidno:2的成熟多肽或其具有β-葡糖苷酶活性的片段的氨基酸序列，或由seqidno:2或seqidno:2的成熟多肽或其具有β-葡糖苷酶活性的片段的氨基酸序列組成。3.項(xiàng)1的多肽，所述多肽由下述質(zhì)粒中所含的多核苷酸編碼：包含在大腸桿菌dsm22922中的質(zhì)粒pgem-t-ppin3。4.分離的多核苷酸，其包含編碼項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。5.用于產(chǎn)生項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。6.用于產(chǎn)生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含項(xiàng)4的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。7.用于產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，所述方法包括破壞或缺失編碼項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的多肽或其部分的多核苷酸，其導(dǎo)致突變體與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽。8.用于產(chǎn)生項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。9.轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其已經(jīng)用編碼項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。10.包含項(xiàng)4的多核苷酸的亞序列的雙鏈抑制rna(dsrna)分子，其中任選地所述dsrna是sirna或mirna分子。11.用于抑制具有木聚糖酶活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對(duì)所述細(xì)胞施用項(xiàng)10的雙鏈rna(dsrna)分子，或者在所述細(xì)胞中表達(dá)項(xiàng)10的雙鏈rna(dsrna)分子。12.分離的多核苷酸，其編碼信號(hào)肽，所述信號(hào)肽包含seqidno:2的氨基酸1至19或由seqidno:2的氨基酸1至19組成。13.用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括：(a)在有助于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因可操作地連接于項(xiàng)12的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ诰幋a信號(hào)肽的多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。14.用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括：在項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽存在下，用酶組合物處理纖維素材料。15.項(xiàng)14的方法，進(jìn)一步包括回收已降解的纖維素材料。16.產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括：(a)在項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽存在下，用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從所述發(fā)酵中回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。17.發(fā)酵纖維素材料的方法，其包括：用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中所述纖維素材料是在項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下用酶組合物糖化的。18.項(xiàng)17的方法，其中纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。19.項(xiàng)18的方法，進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。20.一種用于降解或轉(zhuǎn)化含木聚糖材料的方法，其包括：在項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下用酶組合物處理所述半纖維素材料。21.項(xiàng)20的方法，進(jìn)一步包括回收降解的半纖維素材料。22.產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括：(a)在項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽存在下，用酶組合物糖化含木聚糖材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的含木聚糖材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從所述發(fā)酵中回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。23.一種發(fā)酵含木聚糖材料的方法，其包括：用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵所述含木聚糖材料，其中所述半纖維素材料是在項(xiàng)1-3中任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽存在下用酶組合物糖化的。24.項(xiàng)23的方法，其中含木聚糖材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。25.項(xiàng)23的方法，進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示pppin3的限制圖譜。圖2a和2b顯示嗜松青霉(penicilliumpinophilum)nn046877gh10木聚糖酶基因的基因組dna序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為seqidno:1和2)。定義木聚糖酶：術(shù)語(yǔ)“木聚糖酶”在本文中定義為1,4-β-d-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-d-xylan-xylohydrolase)(e.c.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-d-木糖苷鍵的內(nèi)水解。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是使用樺木木聚糖作為底物確定的。一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在50℃，ph5從每升2g樺木木聚糖作為底物在含有0.01％20的50mm乙酸鈉ph5中水解的起始時(shí)間過程中每分鐘產(chǎn)生1.0μmol還原糖(以葡萄糖當(dāng)量(glucoseequivalents)測(cè)定，如lever,1972,anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,anal.biochem47:273-279所述)。木聚糖降解活性：術(shù)語(yǔ)“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”在本文中定義為水解含木聚糖材料的生物學(xué)活性。兩種測(cè)定木聚糖分解活性的基礎(chǔ)方法包括：(1)測(cè)定總木聚糖分解活性，和(2)測(cè)定單獨(dú)的木聚糖分解活性(內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronylesterase))。最近在木聚糖分解酶測(cè)定法的進(jìn)展總結(jié)于幾個(gè)公開文獻(xiàn)中，包括biely和puchard,recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,journalofthescienceoffoodandagriculture86(11):1636-1647；spanikova和biely,2006,glucuronoylesterase-novelcarbohydrateesteraseproducedbyschizophyllumcommune,febsletters580(19):4597-4601；以及herrmann,vrsanska,jurickova,hirsch,biely和kubicek,1997,thebeta-d-xylosidaseoftrichodermareeseiisamultifunctionalbeta-d-xylanxylohydrolase,biochemicaljournal321:375-381?？偰揪厶墙到饣钚钥赏ㄟ^確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來(lái)測(cè)量，所述木聚糖包括燕麥小麥(oatspelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(larchwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價(jià)染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來(lái)測(cè)量。最常見的總木聚糖分解活性測(cè)定法基于從多聚的4-o-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖，如bailey,biely,poutanen,1992,interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,journalofbiotechnology23(3):257-270中所述。就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測(cè)量由木聚糖降解酶在下述通常條件下造成的樺木木聚糖(sigmachemicalco.,inc.,st.louis,mo,usa)水解的增加來(lái)確定的：1ml反應(yīng)液，5mg/ml底物(總固形物)，5mg木聚糖分解蛋白質(zhì)/g底物，50mm乙酸鈉，ph5，50℃，24小時(shí)，如lever,1972,anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,anal.biochem47:273-279所述使用對(duì)羥基苯甲酸酰肼(phbah)測(cè)定法進(jìn)行糖分析。β-木糖苷酶：術(shù)語(yǔ)“β-木糖苷酶”在本文中定義為β-d木糖苷木糖水解酶(β-d-xylosidexylohydrolase)(e.c.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的d-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個(gè)單位的β-木糖苷酶活性定義為在40℃，ph5從1mm對(duì)硝基苯基-β-d-木糖苷作為底物在含有0.01％20的100mm檸檬酸鈉ph5中每分鐘產(chǎn)生1.0μmol對(duì)硝基苯酚。乙酰木聚糖酯酶：術(shù)語(yǔ)“乙酰木聚糖酯酶”在本文中定義為羧基酯酶(ec3.1.1.72)，其催化乙?；鶑木酆夏揪厶恰⒁阴；咎?、乙?；咸烟?、乙酸α-萘酯(alpha-napthylacetate)和乙酸對(duì)硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01％tweentm20的50mm乙酸鈉ph5.0中的0.5mm乙酸對(duì)硝基苯酯作為底物確定的。一個(gè)單位的乙酰木聚糖酯酶活性定義為能夠在ph5,25℃每分鐘釋放1微摩爾對(duì)硝基苯酚陰離子(p-nitrophenolateanion)的酶量。阿魏酸酯酶：術(shù)語(yǔ)“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)”在本文中定義為4-羥基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶酶(ec3.1.1.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團(tuán)從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、fae-iii、肉桂酸酯水解酶、faea、cinnae、fae-i或fae-ii。就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mm乙酸鈉ph5.0中的0.5mm阿魏酸對(duì)硝基苯酯作為底物確定的。一個(gè)單位的阿魏酸酯酶活性等于能夠在ph5，25℃每分鐘釋放出1μmol對(duì)硝基苯酚陰離子的酶量。α-葡糖醛酸糖苷酶：術(shù)語(yǔ)“α-葡糖醛酸糖苷酶”在本文中定義為α-d-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-d-glucosiduronateglucuronohydrolase)(ec3.2.1.139)，其催化α-d-葡糖醛酸糖苷水解為d-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)devries,1998,j.bacteriol.180:243-249確定的。一個(gè)單位的α-葡糖醛酸糖苷酶活性等于能夠在ph5，40℃每分鐘釋放出1μmol葡糖醛酸或4-o-甲基葡糖醛酸的酶量。α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶：術(shù)語(yǔ)“α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶”在本文中定義為α-l-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(ec3.2.1.55)，其催化對(duì)α-l-阿拉伯糖苷中的末端非還原性α-l-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶活性對(duì)α-l-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-鍵的α-l-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-l-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、l-阿拉伯糖苷酶或α-l-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200μl中的每ml的100mm乙酸鈉ph5中5mg的中等粘度小麥阿拉伯木聚糖(megazymeinternationalireland,ltd.,bray,co.wicklow,ireland)在40℃進(jìn)行30分鐘，接著通過hpx-87h柱層析(bio-radlaboratories,inc.,hercules,ca,usa)的阿拉伯糖分析來(lái)確定的。纖維素分解酶或纖維素酶：術(shù)語(yǔ)“纖維素分解酶”或“纖維素酶”意指一種或多種(幾種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其組合。測(cè)量纖維素分解活性的兩種基本方法包括：(1)測(cè)量總纖維素分解活性，和(2)測(cè)量單獨(dú)的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如zhang等,outlookforcellulaseimprovement:screeningandselectionstrategies,2006,biotechnologyadvances24:452-481所綜述的?？偫w維素分解活性通常是使用不溶性底物來(lái)測(cè)定的，所述底物包括whatmanno.1濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測(cè)定法是使用whatmanno.1濾紙作為底物的濾紙測(cè)定法。該測(cè)定法是由internationalunionofpureandappliedchemistry(iupac)(ghose,1987,measurementofcellulaseactivities,pureappl.chem.59:257-68)確立的。就本發(fā)明而言，纖維素分解酶活性通過測(cè)量在下述條件下由纖維素分解酶進(jìn)行的纖維素材料水解的增加來(lái)確定：1-20mg的纖維素分解酶蛋白/g的pcs中纖維素在50℃進(jìn)行3-7日，與未添加纖維素分解酶蛋白的對(duì)照水解相比較。通常條件為：1ml反應(yīng)液，經(jīng)洗滌或未洗滌的pcs，5％不溶性固形物，50mm乙酸鈉ph5，1mmmnso4，50℃，72小時(shí)，通過hpx-87h柱(bio-radlaboratories,inc.,hercules,ca,usa)進(jìn)行糖分析。內(nèi)切葡聚糖酶：術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切葡聚糖酶”在本文中定義為內(nèi)切-1,4-(1,3；1,4)-β-d-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-d-glucan4-glucanohydrolase)(e.c.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-d-糖苷鍵、混合的β-1,3葡聚糖例如谷類β-d-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的β-1,4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可基于底物粘度的減少或由還原糖測(cè)定法(zhang等,2006,biotechnologyadvances24:452-481)確定的還原端增加來(lái)確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)ghose,1987,pureandappl.chem.59:257-268的方法，使用羧甲基纖維素(cmc)水解來(lái)確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。纖維二糖水解酶：術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶”在本文中定義為1,4-β-d-葡聚糖纖維二糖水解酶(1,4-beta-d-glucancellobiohydrolase)(e.c.no.3.2.1.91)，其催化纖維素、纖維素寡糖，或任何包含β-1,4-連接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-d-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(teeri,1997,crystallinecellulosedegradation:newinsightintothefunctionofcellobiohydrolases,trendsinbiotechnology15:160-167；teeri等,1998,trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose？,biochem.soc.trans.26:173-178)。就本發(fā)明而言，根據(jù)vantilbeurgh等,1982,febsletters149:152-156和vantilbeurgh和claeyssens,1985,febsletters187:283-288描述的方法對(duì)熒光性二糖衍生物4-甲基傘形基-β-d-乳糖苷測(cè)定纖維二糖水解酶活性。β-葡糖苷酶：術(shù)語(yǔ)“β-葡糖苷酶”在本文中定義為β-d-葡糖苷葡糖水解酶(beta-d-glucosideglucohydrolase)(e.c.no.3.2.1.21)，其催化末端非還原β-d-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-d-葡萄糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)venturi等,2002,extracellularbeta-d-glucosidasefromchaetomiumthermophilumvar.coprophilum:production,purificationandsomebiochemicalproperties,j.basicmicrobiol.42:55-66描述的基本方法，只是采用如本文所述的不同條件確定β-葡糖苷酶活性。一個(gè)單位的β-葡糖苷酶活性定義為在40℃,ph5，在含有0.01％20的100mm檸檬酸鈉ph5中從作為底物的1mm對(duì)硝基苯基-β-d-葡糖吡喃糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對(duì)硝基苯酚。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽：術(shù)語(yǔ)“具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽”意指使具有纖維素分解活性的酶對(duì)纖維素材料的水解增強(qiáng)的gh61多肽。就本發(fā)明而言，通過測(cè)量由纖維素分解蛋白在下述條件下水解纖維素材料所導(dǎo)致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來(lái)確定纖維素分解增強(qiáng)活性：1-50mg總蛋白/gpcs中纖維素，其中總蛋白包含50-99.5％w/w的纖維素分解蛋白，及0.5-50％w/w的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的蛋白質(zhì)，在50-65℃歷時(shí)1-7天，與用等量的總蛋白加載量而無(wú)纖維素分解增強(qiáng)活性(1-50mg纖維素分解蛋白/gpcs中纖維素)所進(jìn)行的對(duì)照水解相比。在一個(gè)優(yōu)選的方面，使用在總蛋白重量的3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)wo02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白質(zhì)量的3％的煙曲霉β-葡糖苷酶(如wo2002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的1.5l(novozymesa/s,denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來(lái)源。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽通過降低達(dá)到相同水解水平所需的纖維素分解酶的量而增強(qiáng)由具有纖維素分解活性的蛋白質(zhì)催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少1.01倍，更優(yōu)選至少1.05倍，更優(yōu)選至少1.10倍，更優(yōu)選至少1.25倍，更優(yōu)選至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10倍，并且最優(yōu)選至少20倍。家族61糖苷水解酶：術(shù)語(yǔ)“家族61糖苷水解酶”或“家族gh61”在本文中定義為根據(jù)henrissatb.,1991,aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,biochem.j.280:309-316,及henrissatb.,和bairocha.,1996,updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,biochem.j.316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。纖維素材料：纖維素材料可以是包含纖維素的任何材料。生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。次生細(xì)胞壁(secondarycellwall)在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后產(chǎn)生，其同樣含有多糖并通過共價(jià)交聯(lián)至半纖維素的聚合木質(zhì)素而加強(qiáng)。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈β-(1-4)-d-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿與造紙廠殘余物(參見，例如，wiselogel等,1995,于handbookonbioethanol(charlese.wyman編),pp.105-118,taylor&francis,washingtond.c.；wyman,1994,bioresourcetechnology50:3-16；lynd,1990,appliedbiochemistryandbiotechnology24/25:695-719；mosier等,,1999,recentprogressinbioconversionoflignocellulosics,于advancesinbiochemicalengineering/biotechnology,t.scheper主編,volume65,pp.23-40,springer-verlag,newyork)。在本文中應(yīng)理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料。在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是木素纖維素。在一個(gè)方面，纖維素材料是草本材料。在另一個(gè)方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是林業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是廢紙。在另一個(gè)方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米秸稈。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個(gè)方面，纖維素材料是橙皮。在另一個(gè)方面，纖維素材料是稻桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是麥桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是芒草屬。在另一個(gè)方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個(gè)方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是細(xì)菌纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是棉線頭(cottonlinter)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是無(wú)定形的磷酸處理的纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是濾紙。纖維素材料可以直接使用或進(jìn)行預(yù)處理，使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，如本文所述。在一個(gè)優(yōu)選的方面，預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理的玉米秸稈：術(shù)語(yǔ)“pcs”或“預(yù)處理的玉米秸稈“在本文中定義為通過用熱和稀硫酸處理的源自玉米秸稈的纖維素材料。含木聚糖材料：術(shù)語(yǔ)“含木聚糖材料”在本文中定義為任何包含含有β-(1-4)連接木糖殘基骨架的植物細(xì)胞壁多糖的材料。陸生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-d-吡喃木糖骨架(其由短糖鏈分支)的雜聚物。其鏈包含d-葡糖醛酸或其4-o-甲基醚、l-阿拉伯糖和/或多種寡糖，所述寡糖包括d-木糖、l-阿拉伯糖，d-或l-半乳糖和d-葡萄糖。木聚糖類型的多糖可分為同木聚糖(homoxylan)和雜木聚糖(heteroxylan)，其包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和復(fù)合雜木聚糖(complexheteroxylan)。參見例如ebringerova等,2005,adv.polym.sci.186:1-67。在本發(fā)明的方法中，可使用任何含木聚糖材料。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述含木聚糖材料是木素纖維素。分離的多肽：術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”用于本文中指從來(lái)源分離的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽如通過sds-page測(cè)定的，為至少1％純，優(yōu)選至少5％純，更優(yōu)選至少10％純，更優(yōu)選至少20％純，更優(yōu)選至少40％純，更優(yōu)選至少60％純，甚至更優(yōu)選至少80％純，并且最優(yōu)選至少90％純。基本上純的多肽：術(shù)語(yǔ)“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計(jì)至多10％，優(yōu)選至多8％，更優(yōu)選至多6％，更優(yōu)選至多5％，更優(yōu)選至多4％，更優(yōu)選至多3％，甚至更優(yōu)選至多2％，最優(yōu)選至多1％，并且甚至最優(yōu)選至多0.5％的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計(jì)至少92％純，優(yōu)選至少94％純，更優(yōu)選至少95％純，更優(yōu)選至少96％純，更優(yōu)選至少97％純，更優(yōu)選至少98％純，甚至更優(yōu)選至少99％純，最優(yōu)選至少99.5％純，并且甚至最優(yōu)選100％純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如，這能夠通過以下實(shí)現(xiàn)：通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽：術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”在本文中定義為以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如n-末端加工、c-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個(gè)方面，根據(jù)預(yù)測(cè)seqidno:2的氨基酸1至19是信號(hào)肽的signalp軟件(nielsen等,1997,proteinengineering10:1-6)，成熟多肽是seqidno:2的氨基酸20至407。成熟多肽編碼序列：術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有木聚糖酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個(gè)方面，根據(jù)預(yù)測(cè)seqidno:1的核苷酸1至57編碼信號(hào)肽的signalp軟件(nielsen等,1997)，成熟多肽編碼序列是seqidno:1的核苷酸58至1439。同一性：參數(shù)“同一性”描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度使用如emboss軟件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,rice等,2000,trendsingenetics16:276-277)，優(yōu)選3.0.0版或更高版本的needle程序中所執(zhí)行的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)來(lái)測(cè)定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gappenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和eblosum62(blosum62的emboss版)取代矩陣。使用needle標(biāo)記為“最高同一性(longestidentity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為同一性百分比，并計(jì)算如下：(同樣的殘基×100)/(比對(duì)長(zhǎng)度－比對(duì)中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性程度使用如emboss軟件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,rice等,2000,見上文)，優(yōu)選3.0.0版或更高版本的needle程序中所執(zhí)行的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,見上文)來(lái)測(cè)定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版)取代矩陣。使用needle標(biāo)記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為同一性百分比，并計(jì)算如下：(同樣的脫氧核糖核苷酸×100)/(比對(duì)長(zhǎng)度－比對(duì)中缺口的總數(shù))同源序列：術(shù)語(yǔ)“同源序列”在本文中定義為在用seqidno:2的嗜松青霉木聚糖酶或其成熟多肽進(jìn)行的tfasty搜索(pearson,w.r.,1999,于bioinformaticsmethodsandprotocols中,s.misener和s.a.krawetz編,pp.185-219)中e值(或期望分?jǐn)?shù))小于0.001的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)。多肽片段：術(shù)語(yǔ)“多肽片段”在本文中定義為從seqidno:2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的多肽；其中所述片段具有木聚糖酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述片段含有seqidno:2，seqidno:2的成熟多肽或其同源序列的至少320個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少340個(gè)氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少360個(gè)氨基酸殘基。亞序列：術(shù)語(yǔ)“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從seqidno:1或其同源序列的5’和/或3’端缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有木聚糖酶活性的多肽片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述亞序列含有seqidno:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少960個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少1020個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選至少1080個(gè)核苷酸。等位變體(allelicvariant)：術(shù)語(yǔ)“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無(wú)變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸：術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”用于本文中指從來(lái)源分離的多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的方面，多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測(cè)定的，為至少1％純，優(yōu)選至少5％純，更優(yōu)選至少10％純，更優(yōu)選至少20％純，更優(yōu)選至少40％純，更優(yōu)選至少60％純，甚至更優(yōu)選至少80％純，并且最優(yōu)選至少90％純?；旧霞兊亩嗪塑账幔盒g(shù)語(yǔ)“基本上純的多核苷酸”用于本文指不含其它外來(lái)的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計(jì)至多10％，優(yōu)選至多8％，更優(yōu)選至多6％，更優(yōu)選至多5％，更優(yōu)選至多4％，更優(yōu)選至多3％，甚至更優(yōu)選至多2％，最優(yōu)選至多1％，并且甚至最優(yōu)選至多0.5％的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計(jì)至少90％純，優(yōu)選至少92％純，更優(yōu)選至少94％純，更優(yōu)選至少95％純，更優(yōu)選至少96％純，更優(yōu)選至少97％純，甚至更優(yōu)選至少98％純，最優(yōu)選至少99％，并且甚至最優(yōu)選至少99.5％純的。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cdna、rna、半合成、合成來(lái)源的，或它們的任何組合。編碼序列：當(dāng)用于本文時(shí)術(shù)語(yǔ)“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以atg起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如gtg和ttg開始，并且以終止密碼子例如taa、tag和tga結(jié)束。編碼序列可以是dna、cdna、合成的或重組的核苷酸序列。cdna：術(shù)語(yǔ)“cdna”在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mrna分子制備的dna分子。cdna缺少通常存在于相應(yīng)基因組dna中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級(jí)的rna轉(zhuǎn)錄物是mrna的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mrna出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自mrna的cdna沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體：術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因或其受修飾以本來(lái)不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段，或其為合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)：術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”在本文定義為包括對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的所有成分。各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接：術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對(duì)于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。表達(dá)：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的dna分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞：如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對(duì)于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。修飾：術(shù)語(yǔ)“修飾”在本文的意思是，對(duì)包含seqidno:2的成熟多肽的多肽，或由seqidno:2的成熟多肽組成的多肽或其同源序列的任何化學(xué)修飾，以及對(duì)編碼所述多肽的dna的遺傳操作。所述修飾可以是一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體：當(dāng)用在本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“人工變體”的意思是具有木聚糖酶活性的多肽，所述多肽由表達(dá)seqidno:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的核苷酸序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(yù)(humanintervention)，通過修飾公開于seqidno:1或其同源序列的核苷酸序列來(lái)獲得。發(fā)明詳述具有木聚糖酶活性的多肽在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與seqidno:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，并且最優(yōu)選至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多肽具有木聚糖酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述同源多肽包含氨基酸序列，其與seqidno:2的成熟多肽相差十個(gè)氨基酸，優(yōu)選相差五個(gè)氨基酸，更優(yōu)選相差四個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個(gè)氨基酸，最優(yōu)選相差兩個(gè)氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個(gè)氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含seqidno:2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有木聚糖酶活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包含seqidno:2的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選方面，多肽包含seqidno:2的成熟多肽。在另一個(gè)優(yōu)選方面，多肽包含seqidno:2的氨基酸20至407，或其等位變體；或它們的具有木聚糖酶活性的片段。在另一個(gè)優(yōu)選方面，多肽包含seqidno:2的氨基酸20至407。在另一個(gè)優(yōu)選方面，多肽由seqidno:2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有木聚糖酶活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選方面，多肽由seqidno:2的氨基酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選方面，多肽由seqidno:2的成熟多肽組成。在另一個(gè)優(yōu)選方面，多肽由seqidno:2的氨基酸20至407或其等位變體；或它們的具有木聚糖酶活性的片段組成。在另一個(gè)優(yōu)選方面，多肽由seqidno:2的氨基酸20至407組成。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的分離的多肽，所述分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選非常低嚴(yán)格條件下，優(yōu)選低嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選中-高嚴(yán)格條件下，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下，并且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下，與以下雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于seqidno:1的成熟多肽編碼序列的cdna序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(j.sambrook,e.f.fritsch,和t.maniatis,1989,molecularcloning,alaboratorymanual,第2版,coldspringharbor,newyork)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述嚴(yán)格條件是高嚴(yán)格條件。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述嚴(yán)格條件是非常高嚴(yán)格條件。seqidno:1的核苷酸序列或其亞序列，以及seqidno:2的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌株鑒定和克隆編碼具有木聚糖酶活性的多肽的dna。具體而言，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組或cdna雜交，以鑒定和從其中分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長(zhǎng)度上應(yīng)為至少14，優(yōu)選至少25，更優(yōu)選至少35，并且最優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針是至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。例如，所述核酸探針的長(zhǎng)度可為至少200個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸。可使用甚至更長(zhǎng)的探針，例如長(zhǎng)度為優(yōu)選至少600個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少700個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選至少800個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少900個(gè)核苷酸的核酸探針。dna和rna探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32p、3h、35s、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。這些探針涵蓋于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組dna或cdna文庫(kù)中篩選dna，所述dna與上述探針雜交并且編碼具有木聚糖酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來(lái)自這些其它菌株的基因組或其它dna?？梢詫?lái)自文庫(kù)的dna或分離的dna轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與seqidno:1或其亞序列同源的克隆或dna，將所述載體材料優(yōu)選用在sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對(duì)應(yīng)于seqidno:1的成熟多肽編碼序列；包含于seqidno:1的成熟多肽編碼序列的cdna序列；其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或它們的亞序列?？墒褂美鐇射線片(x-rayfilm)檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是seqidno:1的成熟多肽編碼序列。在另一個(gè)優(yōu)選方面，核酸探針是seqidno:1的核苷酸58至1439。在另一個(gè)優(yōu)選方面，核酸探針是編碼seqidno:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一個(gè)優(yōu)選方面，核酸探針是seqidno:1。在另一個(gè)優(yōu)選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(e.coli)dsm22922中的質(zhì)粒pgem-t-ppin3中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有木聚糖酶活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選方面，核酸探針是包含在大腸桿菌dsm22922中的質(zhì)粒pgem-t-ppin3中含有的成熟多肽編碼區(qū)。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，將非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為在42℃，在5xsspe、0.3％sds、200μg/ml已剪切并且變性的鮭精dna中，并且對(duì)于非常低和低嚴(yán)格性為25％的甲酰胺、對(duì)于中和中-高嚴(yán)格性為35％的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)格性為50％的甲酰胺，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時(shí)。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，使用2xssc、0.2％sds優(yōu)選至少在45℃(非常低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在50℃(低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在55℃(中嚴(yán)格性)，更優(yōu)選至少在60℃(中-高嚴(yán)格性)，甚至更優(yōu)選至少在65℃(高嚴(yán)格性)，并且最優(yōu)選至少在70℃(非常高嚴(yán)格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在比根據(jù)bolton和mccarthy計(jì)算法(1962,proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa48:1390)得出的tm低大約5℃至大約10℃，在0.9mnacl，0.09mtris-hclph7.6，6mmedta，0.5％np-40，1×denhardt溶液，1mm焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，1mm磷酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate)，0.1mmatp和0.2mg每ml的酵母rna中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時(shí)。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將所述載體材料在6×ssc加0.1％sds中洗滌一次15分鐘，并用6×ssc在比計(jì)算的tm低5℃至10℃的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及由包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的多核苷酸編碼的具有木聚糖酶活性的分離的多肽，所述核苷酸序列與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，并且最優(yōu)選至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％的同一性程度，其編碼具有木聚糖酶活性的多肽。參見本文的多核苷酸部分。在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及seqidno:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的人工變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對(duì)性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)：堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如h.neurath和r.l.hill,1979,于theproteins,academicpress,newyork中描述。最普遍發(fā)生的交換是ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly。除了20個(gè)基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-n-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3,3-二甲基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適ph等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(cunningham和wells,1989,science244:1081-1085)來(lái)鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得突變分子的生物活性(即，木聚糖酶活性)以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見hilton等,1996,j.biol.chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測(cè)定，如通過以下這些技術(shù)：如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)測(cè)定。參見例如devos等,1992,science255:306-312；smith等,1992,j.mol.biol.224:899-904；wlodaver等,1992,febslett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一性分析來(lái)推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由reidhaar-olson和sauer,1988,science241:53-57；bowie和sauer,1989,proc.natl.acad.sci.usa86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625公開的那些方法來(lái)進(jìn)行并測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)pcr、噬菌體展示(例如，lowman等,1991,biochem.30:10832-10837；美國(guó)專利no.5,223,409；wo92/06204)和區(qū)域定向的誘變(derbyshire等,1986,gene46:145；ner等,1988,dna7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動(dòng)化的篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(ness等,1999,naturebiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的dna分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許快速測(cè)定感興趣的多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。seqidno:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有木聚糖酶活性的多肽的來(lái)源本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來(lái)源有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來(lái)源產(chǎn)生，或由其中插入了來(lái)自所述來(lái)源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選的方面，獲得自給定來(lái)源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是具有木聚糖酶活性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(bacillus)、鏈球菌屬(streptococcus)、鏈霉菌屬(streptomyces)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、腸球菌屬(enterococcus)、乳桿菌屬(lactobacillus)、乳球菌屬(lactococcus)、梭菌屬(clostridium)、地芽孢桿菌屬(geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(oceanobacillus)多肽；或具有木聚糖酶活性的革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌(e.coli)、假單胞菌屬(pseudomonas)、沙門氏菌屬(salmonella)、彎曲桿菌屬(campylobacter)、螺桿菌屬(helicobacter)、黃桿菌屬(flavobacterium)、梭桿菌屬(fusobacterium)、泥桿菌屬(ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(neisseria)或脲原體屬(ureaplasma)多肽。在一個(gè)優(yōu)選方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的嗜堿芽孢桿菌(bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的似馬鏈球菌(streptococcusequisimilis)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸瘟亞種(streptococcusequisubsp.zooepidemicus)多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(streptomyceslividans)多肽。本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選具有木聚糖酶活性的酵母多肽如假絲酵母屬(candida)、克魯維酵母屬(kluyveromyces)、畢赤酵母屬(pichia)、酵母屬(saccharomyces)、裂殖酵母屬(schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(yarrowia)多肽；或更優(yōu)選具有木聚糖酶活性的絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(acremonium)、傘菌屬(agaricus)、鏈格孢屬(alternaria)、曲霉屬(aspergillus)、短梗霉屬(aureobasidium)、botryospaeria、擬蠟菌屬(ceriporiopsis)、毛喙殼屬(chaetomidium)、金孢子菌屬(chrysosporium)、claviceps、cochliobolus、鬼傘屬(coprinopsis)、coptotermes、棒囊殼屬(corynascus)、隱叢赤殼菌屬(cryphonectria)、隱球菌屬(cryptococcus)、色二孢屬(diplodia)、黑耳屬(exidia)、filibasidium、鐮孢屬(fusarium)、赤霉屬(gibberella)、全鞭毛蟲屬(holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(humicola)、耙齒菌屬(irpex)、蘑菇屬(lentinula)、leptospaeria、梨孢菌屬(magnaporthe)、melanocarpus、多孔菌屬(meripilus)、毛霉屬(mucor)、毀絲霉屬(myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(neocallimastix)、脈孢菌屬(neurospora)、擬青霉屬(paecilomyces)、青霉屬(penicillium)、平革菌屬(phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(piromyces)、poitrasia、假黑盤菌屬(pseudoplectania)、pseudotrichonympha、根毛霉屬(rhizomucor)、裂褶菌屬(schizophyllum)、柱頂孢屬(scytalidium)、踝節(jié)菌屬(talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(thermoascus)、梭孢殼屬(thielavia)、彎頸霉屬(tolypocladium)、木霉屬(trichoderma)、長(zhǎng)毛盤菌屬(trichophaea)、輪枝孢屬(verticillium)、包腳菇屬(volvariella)或炭角菌屬(xylaria)多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的卡爾酵母(saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(saccharomycesoviformis)多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的解纖維枝頂孢霉(acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(aspergillusawamori)、煙曲霉(aspergillusfumigatus)、臭曲霉(aspergillusfoetidus)、日本曲霉(aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金孢子菌(chrysosporiumkeratinophilum)、chrysosporiumlucknowense、熱帶金孢子菌(chrysosporiumtropicum)、chrysosporiummerdarium、chrysosporiuminops、氈金孢子菌(chrysosporiumpannicola)、chrysosporiumqueenslandicum、chrysosporiumzonatum、桿孢狀鐮孢(fusariumbactridioides)、禾谷鐮孢(fusariumcerealis)、庫(kù)威鐮孢(fusariumcrookwellense)、大刀鐮孢(fusariumculmorum)、禾本科鐮孢(fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(fusariumgraminum)、異孢鐮孢(fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(fusariumnegundi)、尖鐮孢(fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(fusariumreticulatum)、粉紅鐮孢(fusariumroseum)、接骨木鐮孢(fusariumsambucinum)、膚色鐮孢(fusariumsarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(fusariumsporotrichioides)、硫色鐮孢(fusariumsulphureum)、圓鐮孢(fusariumtorulosum)、擬絲孢鐮孢(fusariumtrichothecioides)、鑲片鐮孢(fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(humicolalanuginosa)、白耙齒菌(irpexlacteus)、米黑毛霉(mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)、繩狀青霉(penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(penicilliumpurpurogenum)、黃孢平革菌(phanerochaetechrysosporium)、無(wú)色梭孢殼(thielaviaachromatica)、thielaviaalbomyces、thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢殼(thielaviaaustraleinsis)、thielaviafimeti、小孢梭孢殼(thielaviamicrospora)、卵孢梭孢殼(thielaviaovispora)、thielaviaperuviana、瘤孢梭孢殼(thielaviaspededonium)、毛梭孢殼(thielaviasetosa)、thielaviasubthermophila、土生梭孢霉(thielaviaterrestris)、哈茨木霉(trichodermaharzianum)、康寧木霉(trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(trichodermareesei)或綠色木霉(trichodermaviride)多肽。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的嗜松青霉多肽。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的嗜松青霉nn046877多肽，例如包含seqidno:2的成熟多肽的多肽?？衫斫獾氖菍?duì)于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無(wú)性型(anamorph)，而無(wú)論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易地識(shí)別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對(duì)于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theamericantypeculturecollection)(atcc)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh)(dsm)、真菌菌種保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures)(cbs)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(agriculturalresearchservicepatentculturecollection,northernregionalresearchcenter)(nrrl)。此外，可以使用上述的探針從其它來(lái)源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cdna文庫(kù)來(lái)獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測(cè)到編碼多肽的多核苷酸，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，sambrook等,1989,見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的n末端或c末端。通過將編碼另一個(gè)多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來(lái)產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們?cè)陂喿x框中，并且使所述融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點(diǎn)。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點(diǎn)，從融合蛋白釋放具有木聚糖酶活性的多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括，但不限于，編碼二肽lys-arg的kex2位點(diǎn)(martin等,2003,j.ind.microbiol.biotechnol.3:568-76；svetina等，2000,j.biotechnol.76:245-251；rasmussen-wilson等，1997,appl.environ.microbiol.63:3488-3493；ward等,1995,biotechnology13:498-503；和contreras等,1991,biotechnology9:378-381)；ile-(glu或asp)-gly-arg位點(diǎn)，其在精氨酸殘基后通過因子xa蛋白酶切割(eaton等,1986,biochem.25:505-512)；asp-asp-asp-asp-lys位點(diǎn)，其在賴氨酸后通過腸激酶切割(collins-racie等,1995,biotechnology13:982-987)；his-tyr-glu位點(diǎn)或his-tyr-asp位點(diǎn)，其通過genenasei切割(carter等,1989,proteins:structure,function,andgenetics6:240-248)；leu-val-pro-arg-gly-ser位點(diǎn)，其在arg后通過凝血酶切割(stevens,2003,drugdiscoveryworld4:35-48)；glu-asn-leu-tyr-phe-gln-gly位點(diǎn)，其在gln后通過tev蛋白酶切割(stevens,2003，見上)；和leu-glu-val-leu-phe-gln-gly-pro位點(diǎn)，其在gln后通過遺傳工程形式的人鼻病毒3c蛋白酶切割(stevens,2003，見上)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列，或由編碼本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含seqidno:1或由seqidno:1組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌dsm22922中所含質(zhì)粒pgem-t-ppin3中所含的序列，或由大腸桿菌dsm22922中所含質(zhì)粒pgem-t-ppin3中所含的序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選方面，核苷酸序列包含seqidno:1的成熟多肽編碼序列或由seqidno:1的成熟多肽編碼序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選方面，核苷酸序列包含seqidno:1的核苷酸58至1439或由seqidno:1的核苷酸58至1439組成。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌dsm22922中所含質(zhì)粒pgem-t-ppin3中含有的成熟多肽編碼序列或由大腸桿菌dsm22922中所含質(zhì)粒pgem-t-ppin3中含有的成熟多肽編碼序列組成。本發(fā)明還涵蓋編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含seqidno:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由seqidno:2的氨基酸序列或其成熟多肽組成；由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列分別不同于seqidno:1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及seqidno:1的亞序列，所述亞序列編碼具有木聚糖酶活性的seqidno:2的片段。本發(fā)明還涉及突變多核苷酸，所述突變多核苷酸在seqidno:1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)突變，或由在seqidno:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個(gè)突變的核苷酸組成，其中所述突變核苷酸序列編碼seqidno:2的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組dna分離，從cdna制備，或其組合。可通過例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆dna片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組dna克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，innis等,1990,pcr:aguidetomethodsandapplication,academicpress,newyork?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法，如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；lat)和基于核苷酸序列的擴(kuò)增(nasba)。可以從青霉屬菌株，或其它或相關(guān)生物體克隆多核苷酸，并且因此可為例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成的分離的多核苷酸，所述核苷酸序列與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，并且最優(yōu)選至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％的同一性程度，其編碼具有木聚糖酶活性的多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對(duì)于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語(yǔ)與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來(lái)源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適ph等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛閟eqidno:1的多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過引入如下核苷酸取代來(lái)構(gòu)建變體序列：所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例如，ford等,1991,proteinexpressionandpurification2:95-107。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代能夠在對(duì)于分子功能重要的區(qū)域之外進(jìn)行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對(duì)于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進(jìn)行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，cunningham和wells,1989,見上文)來(lái)鑒定。在后一技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個(gè)荷正電的殘基處，并且測(cè)試所得突變分子的木聚糖酶活性，以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點(diǎn)也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測(cè)定，通過如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記這樣的技術(shù)來(lái)測(cè)定(參見，例如，devos等,1992,見上文；smith等,1992,見上文；wlodaver等,1992,見上文)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴(yán)格條件下，優(yōu)選低嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴(yán)格條件下，與以下序列雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于seqidno:1的成熟多肽編碼序列的cdna序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或它們的等位變體和亞序列(sambrook等,1989,見上文)，如本文所定義的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述嚴(yán)格條件為高嚴(yán)格條件。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述嚴(yán)格條件為非常高嚴(yán)格條件。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸通過以下方法獲得：(a)在非常低、低、中等、中-高、高或非常高的嚴(yán)格條件下，將dna群體與以下雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于seqidno:1的成熟多肽編碼序列的cdna序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有木聚糖酶活性的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述嚴(yán)格條件為高嚴(yán)格條件。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述嚴(yán)格條件為非常高嚴(yán)格條件。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組dna方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識(shí)別的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子：大腸桿菌lac操縱子、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂糖酶基因(daga)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyl)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amym)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penp)、枯草芽孢桿菌xyla和xylb基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(villa-kamaroff等,1978,proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa75:3727-3731)，以及tac啟動(dòng)子(deboer等,1983,proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa80:21-25)。另外的啟動(dòng)子在"usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于scientificamerican,1980,242:74-94中；和在sambrook等,1989,見上文中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子：米曲霉taka淀粉酶、曼赫根毛霉(rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaa)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、鑲片鐮孢daria(wo00/56900)、鑲片鐮孢quinn(wo00/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(wo96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶i、里氏木霉纖維二糖水解酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iv、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉β-木糖苷酶，以及na2-tpi啟動(dòng)子(一種修飾的啟動(dòng)子，來(lái)自在黑曲霉中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在構(gòu)巢曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從如下酶的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶(eno-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(gal1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(adh1,adh2/gap)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)、釀酒酵母金屬硫蛋白(cup1)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動(dòng)子由romanos等,1992,yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得：米曲霉taka淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素c(cyc1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由romanos等,1992,見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其為對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mrna非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得：米曲霉taka淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得：釀酒酵母烯醇化酶(eno-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(adh2/gap)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3’末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識(shí)別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mrna的信號(hào)?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得：米曲霉taka淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由guo和sherman,1995,molecularcellularbiology15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的信號(hào)肽，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號(hào)肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。可供選擇的是，編碼序列5’端可含有對(duì)于所述編碼序列異源的信號(hào)肽編碼序列。異源信號(hào)肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號(hào)肽編碼序列時(shí)可為必需的。或者，外源信號(hào)肽編碼序列可以簡(jiǎn)單地取代天然信號(hào)肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號(hào)肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列：芽孢桿菌屬ncib11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt,nprs,nprm)和枯草芽孢桿菌prsa。另外的信號(hào)肽由simonen和palva,1993,microbiologicalreviews57:109-137描述。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列：米曲霉taka淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶v和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號(hào)肽編碼序列由romanos等,1992,見上文描述。在一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽包含seqidno:2的氨基酸1至19，或者由seqidno:2的氨基酸1至19組成。在另一個(gè)優(yōu)選方面，信號(hào)肽編碼序列包含seqidno:1的核苷酸1至57，或者由seqidno:1的核苷酸1至57組成。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無(wú)活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽。可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(apre)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(wo95/33836)的基因獲得前肽編碼序列。當(dāng)信號(hào)肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時(shí)，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號(hào)肽序列置于緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用adh2系統(tǒng)或gal1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用takaα-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來(lái)表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組dna步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘撸d體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整dna(totaldna)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))選擇性標(biāo)記，其允許簡(jiǎn)單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ade2、his3、leu2、lys2、met3、trp1和ura3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argb(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niad(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrg(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sc(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpc(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amds和pyrg基因和吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10,000堿基對(duì)，優(yōu)選400至10,000堿基對(duì)，并且最優(yōu)選800至10,000堿基對(duì)，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(replicator)，其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pbr322、puc19、pacyc177和pacyc184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pub110、pe194、pta1060和pamβ1的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ars1,ars4,ars1和cen3的組合，和ars4和cen6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是ama1和ans1(gems等,1991,gene98:61-67；cullen等,1987,nucleicacidsresearch15:9163-9175；wo00/24883)。分離ama1基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于wo00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得：將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，sambrook等,1989,見上文)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，所述多核苷酸可有利地用于重組產(chǎn)生具有木聚糖酶活性的多肽。將包含本發(fā)明多核苷酸的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使載體如前所述作為染色體整合體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括親本細(xì)胞的任何后代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來(lái)源。宿主細(xì)胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳酸菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的鏈球菌屬細(xì)胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是似馬鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是釀膿鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是乳房鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的鏈霉菌屬細(xì)胞包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是除蟲鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是天藍(lán)鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是灰色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌細(xì)胞?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將dna引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞：例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，chang和cohen,1979,moleculargeneralgenetics168:111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，young和spizizen,1961,journalofbacteriology81:823-829或dubnau和davidoff-abelson,1971,journalofmolecularbiology56:209-221)，電穿孔(參見，例如，shigekawa和dower,1988,biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，koehler和thorne,1987,journalofbacteriology169:5771-5278)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將dna引入到大腸桿菌細(xì)胞：例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，hanahan,1983,j.mol.biol.166:557-580)或電穿孔(參見，例如，dower等,1988,nucleicacidsres.16:6127-6145)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將dna引入到鏈霉菌屬細(xì)胞：例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，gong等,2004,foliamicrobiol.(praha)49:399-405)，接合(參見，例如，mazodier等,1989,j.bacteriol.171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，burke等,2001,proc.natl.acad.sci.usa98:6289-6294)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將dna引入到假單胞菌屬細(xì)胞：例如電穿孔(參見，例如，choi等,2006,j.microbiol.methods64:391-397)或接合(參見，例如，pinedo和smets,2005,appl.environ.microbiol.71:51-57)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將dna引入到鏈球菌屬細(xì)胞：例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，perry和kuramitsu,1981,infect.immun.32:1295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，catt和jollick,1991,microbios.68:189-207)，電穿孔(參見，例如，buckley等,1999,appl.environ.microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，clewell,1981,microbiol.rev.45:409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的將dna引入宿主細(xì)胞的任何方法。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。“真菌”用在本文包括以下門：子囊菌門(ascomycota)、擔(dān)子菌門(basidiomycota)、壺菌門(chytridiomycota)和接合菌門(zygomycota)(如由hawksworth等,于ainsworthandbisby’sdictionaryofthefungi,第8版,1995,cabinternational,universitypress,cambridge,uk中所定義)以及卵菌門(oomycota)(如hawksworth等,1995,見上,171頁(yè)中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(hawksworth等,1995,見上文)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。“酵母”用在本文包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)和屬于半知菌類(fungiimperfecti)(芽孢綱(blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來(lái)可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如biologyandactivitiesofyeast(skinner,f.a.,passmore,s.m.,和davenport,r.r.編,soc.app.bacteriol.symposiumseriesno.9,1980)中所述。在一個(gè)甚至更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母細(xì)胞、釀酒酵母細(xì)胞、糖化酵母細(xì)胞、道格拉氏酵母細(xì)胞、克魯弗酵母細(xì)胞、諾地酵母細(xì)胞或卵形酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂西洋蓍霉(yarrowialipolytica)細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括真菌門(eumycota)和卵菌門的亞門(如由hawksworth等,1995,見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(coprinus)、革蓋菌屬(coriolus)、隱球菌屬、filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(phanerochaete)、射脈菌屬(phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(trametes)或木霉屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺煙管菌(bjerkanderaadusta)、干擬蠟菌(ceriporiopsisaneirina)、干擬蠟菌、ceriporiopsiscaregiea、ceriporiopsisgilvescens、ceriporiopsispannocinta、ceriporiopsisrivulosa、ceriporiopsissubrufa、蟲擬蠟菌(ceriporiopsissubvermispora)、嗜角質(zhì)金孢子菌、chrysosporiumlucknowense、熱帶金孢子菌、chrysosporiummerdarium、chrysosporiuminops、氈金孢子菌、chrysosporiumqueenslandicum、chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(coprinuscinereus)、毛革蓋菌(coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(phanerochaetechrysosporium)、輻射射脈菌(phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、長(zhǎng)絨毛栓菌(trametesvillosa)、變色栓菌(trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞?？梢詫⒄婢?xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在ep238023和yelton等,1984,proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由malardier等,1989,gene78:147-156和wo96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母：becker和guarente,于abelson,j.n.和simon,m.i.編,guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology,methodsinenzymology,volume194,pp182-187,academicpress,inc.,newyork；ito等,1983,journalofbacteriology153:163；和hinnen等,1978,proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa75:1920。產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括：(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是青霉屬的細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是嗜松青霉。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是嗜松青霉nn046877。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括：(a)如本文所述，在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括：(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含突變核苷酸序列，其在seqidno:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個(gè)突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，該多肽包含seqidno:2的成熟多肽或由seqidno:2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細(xì)胞裂解物(lysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對(duì)于所述多肽是特異性的方法來(lái)檢測(cè)多肽。這些檢測(cè)方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(yàn)(enzymeassay)可用于測(cè)定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、sds-page或提取(參見，例如，proteinpurification,j.-c.janson和larsryden,editors,vchpublishers,newyork,1989)。植物本發(fā)明還涉及植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽，從而以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收。或者，可以按原樣(assuch)將含有該重組多肽的植物或植物部分用于改進(jìn)食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties)，或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass)，早熟禾屬(poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(festuca)、黑麥草屬(lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如agrostis(翦股穎屬)；和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草(tobacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familybrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(arabidopsisthaliana)。植物部分的實(shí)例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf)、根(root)、果實(shí)(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細(xì)胞區(qū)室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)外體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無(wú)論什么組織來(lái)源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如分離以促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)。同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代。表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞：將編碼本發(fā)明多肽的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細(xì)胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。表達(dá)構(gòu)建體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸序列所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對(duì)于鑒定宿主細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記，在所述宿主細(xì)胞中整合了表達(dá)構(gòu)建體和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的dna序列(后者依賴于使用的dna引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動(dòng)子和終止子序列和任選地信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，舉例來(lái)說(shuō)，基于期望何時(shí)、何處以及如何表達(dá)多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如tague等,1988,plantphysiology86:506所述。對(duì)于組成性表達(dá)，可以使用35s-camv、玉米泛素1和稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子(franck等,1980,cell21:285-294,christensen等,1992,plantmo.biol.18:675-689；zhang等,1991,plantcell3:1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如來(lái)自貯藏庫(kù)組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)的啟動(dòng)子(edwards和coruzzi,1990,ann.rev.genet.24:275-303)，或來(lái)自代謝庫(kù)組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動(dòng)子(ito等,1994,plantmol.biol.24:863-878)，種子特異性啟動(dòng)子諸如來(lái)自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動(dòng)子(wu等,1998,plantandcellphysiology39:885-889)，來(lái)自豆球蛋白(legumin)b4和蠶豆(viciafaba)的未知的種子蛋白基因的蠶豆啟動(dòng)子(conrad等,1998,journalofplantphysiology152:708-711)、來(lái)自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動(dòng)子(chen等,1998,plantandcellphysiology39:935-941)，來(lái)自歐洲油菜(brassicanapus)的貯藏蛋白napa啟動(dòng)子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
：公知的任何其他種子特異性的啟動(dòng)子，例如，在wo91/14772中所描述的。此外，啟動(dòng)子可為葉特異性的啟動(dòng)子，如來(lái)自稻或番茄的rbcs啟動(dòng)子(kyozuka等,1993,plantphysiology102:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動(dòng)子(mitra和higgins,1994,plantmolecularbiology26:85-93)，或來(lái)自稻的aldp基因啟動(dòng)子(kagaya等,1995,molecularandgeneralgenetics248:668-674)，或傷口誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(xu等,1993,plantmolecularbiology22:573-588)。同樣地，所述啟動(dòng)子可通過非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動(dòng)子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid)，和重金屬。啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件也可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如xu等,1993,見上，公開了使用稻肌動(dòng)蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(gasser等,1990,science244:1293；potrykus,1990,bio/technology8:535；shimamoto等,1989,nature338:274)。目前，根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)，是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見hooykas和schilperoort,1992,plantmolecularbiology19:15-38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對(duì)于這些植物其他的轉(zhuǎn)化方法是常用的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化dna涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(christou,1992,plantjournal2:275-281；shimamoto,1994,currentopinionbiotechnology5:158-162；vasil等,1992,bio/technology10:667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由omirulleh等,1993,plantmolecularbiology21:415-428所描述的。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇具有并入的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因：例如，使用帶有兩個(gè)獨(dú)立的t-dna構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點(diǎn)特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括：(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。在實(shí)施方案中，除了直接用根據(jù)本發(fā)明制備的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化具體植物基因型之外，還可通過將具有本發(fā)明的構(gòu)建體的植物與缺乏該構(gòu)建體的第二植物雜交來(lái)制備轉(zhuǎn)基因植物。舉例而言，可將編碼具有木聚糖酶活性的多肽的構(gòu)建體或其部分通過雜交而引入特定植物品種，而根本無(wú)需直接轉(zhuǎn)化該給定品種的植物。因此，本發(fā)明不僅涵蓋從依照本發(fā)明經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接再生的植物，還包括此類植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本發(fā)明制備的親本植物任何世代的后裔(offspring)。此種后代可包含依據(jù)本發(fā)明制備的dna構(gòu)建體，或依據(jù)本發(fā)明制備的dna構(gòu)建體的一部分。在實(shí)施方案中，雜交導(dǎo)致本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因通過將起始種系與包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的供體植物種系交叉授粉而引入植物種系。此類步驟的非限制性實(shí)例進(jìn)一步闡述于美國(guó)專利7,151,204號(hào)。涵蓋了包含本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的植物包括通過回交轉(zhuǎn)化方法生成的植物。舉例而言，本發(fā)明的植物包括稱作回交轉(zhuǎn)化的基因型、種系、近交體(inbred)或雜交體(hybrid)的植物。在實(shí)施方案中，可使用遺傳標(biāo)記以協(xié)助本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一個(gè)遺傳背景基因滲入(introgression)至另一個(gè)。標(biāo)記協(xié)助的選擇提供了相對(duì)于常規(guī)育種的優(yōu)勢(shì)，在于其可用于避免由表型變異導(dǎo)致的錯(cuò)誤。進(jìn)一步，遺傳標(biāo)記可在特定雜交的個(gè)體后代中提供有關(guān)良種種質(zhì)相對(duì)程度的數(shù)據(jù)。舉例而言，當(dāng)本不(otherwise)具有非農(nóng)藝學(xué)所需的遺傳背景但具有所需性狀的植物與良種親本雜交時(shí)，可使用遺傳標(biāo)記來(lái)選擇不僅具有目標(biāo)性狀，還具有相對(duì)較大比例所需種質(zhì)的后代。以此方式，使一種或多種性狀基因滲入特定遺傳背景所需的世代數(shù)得到最小化。去除或減少木聚糖酶活性本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸或其部分，所述方法導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與親本細(xì)胞相比突變的細(xì)胞產(chǎn)生較少的所述多肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法(例如，插入、破壞、替代或缺失)通過減少或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達(dá)來(lái)構(gòu)建突變細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區(qū)或其對(duì)活性關(guān)鍵的部分，或表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子?？梢酝ㄟ^向親本細(xì)胞施以誘變，并且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達(dá)減少或消除的突變細(xì)胞來(lái)進(jìn)行核苷酸序列的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機(jī)的，可以通過例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行，通過使用合適的寡核苷酸進(jìn)行，或通過將所述dna序列進(jìn)行pcr產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來(lái)進(jìn)行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(uv)照射、羥胺、n-甲基-n'-硝基-n-亞硝基胍(mnng)、o-甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(ems)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些試劑時(shí)，通常通過如下方法來(lái)進(jìn)行所述誘變：在合適條件下存在優(yōu)選的誘變劑時(shí)溫育待誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達(dá)減少的或無(wú)基因表達(dá)的突變體細(xì)胞。通過導(dǎo)入、取代或去除基因中的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件可以實(shí)現(xiàn)所述核苷酸序列的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開放閱讀框。按照本領(lǐng)域已知的方法通過定位誘變或pcr產(chǎn)生的誘變可以實(shí)現(xiàn)這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即，直接在表達(dá)待修飾核苷酸序列的細(xì)胞上進(jìn)行，但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進(jìn)行所述修飾。消除或減少核苷酸序列通過細(xì)胞表達(dá)的便利方式的例子是基于基因取代，基因缺失，或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將相應(yīng)于內(nèi)源核苷酸序列的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內(nèi)源性核苷酸序列。理想的是所述缺陷性核苷酸序列還編碼標(biāo)記，其可用于選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化子。在特別優(yōu)選的方面，用可選擇的標(biāo)記(如本文所述的那些)來(lái)破壞所述核苷酸序列?；蛘?，可以使用與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列通過確定的反義或rnai技術(shù)來(lái)進(jìn)行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地，通過導(dǎo)入與所述基因的核苷酸序列互補(bǔ)的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過細(xì)胞的表達(dá)，所述序列可以在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并且能夠與細(xì)胞中產(chǎn)生的mrna雜交。由此在允許所述互補(bǔ)反義核苷酸序列與mrna雜交的條件下，減少或消除翻譯的蛋白質(zhì)的量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及親本細(xì)胞的突變體細(xì)胞，其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調(diào)控序列的破壞或缺失，這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比突變體細(xì)胞產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽。這樣生成的多肽缺陷型突變細(xì)胞作為表達(dá)天然和/或異源多肽的宿主細(xì)胞特別有用。所以，本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)天然或異源多肽的方法，其包括：(a)在有助于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語(yǔ)“異源多肽”在本文中定義為對(duì)宿主細(xì)胞不是天然的多肽，進(jìn)行了修飾以改變天然序列的天然蛋白，或作為通過重組dna技術(shù)對(duì)宿主細(xì)胞操作的結(jié)果其表達(dá)在量上改變的天然蛋白。在另一方面，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵可產(chǎn)生本發(fā)明的多肽以及目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)基本上無(wú)木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的方法：在發(fā)酵之前、過程中或發(fā)酵完成之后向發(fā)酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能夠抑制木聚糖酶活性的試劑，從發(fā)酵液中回收目標(biāo)產(chǎn)物，并且任選地將回收的產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化。在另一方面，本發(fā)明涉及如下生產(chǎn)基本上無(wú)木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的方法：在允許產(chǎn)物表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行組合的ph和溫度處理以基本上減少木聚糖酶活性，和從發(fā)酵液中回收產(chǎn)物?；蛘撸梢詫呐囵B(yǎng)液回收的酶制備物進(jìn)行組合的ph和溫度處理。所述組合的ph和溫度處理可任選地與用木聚糖酶抑制劑處理組合使用。依照本發(fā)明的這個(gè)方面，可能去除至少60％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少85％，還更優(yōu)選至少95％，并且最優(yōu)選至少99％的木聚糖酶活性?？墒褂么朔椒ǐ@得木聚糖酶活性的完全去除。組合的ph和溫度處理優(yōu)選在2-4或9-11范圍內(nèi)的ph和至少60-70℃范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行一段足夠的時(shí)間以達(dá)到期望的效果，通常30至60分鐘是足夠的。用于培養(yǎng)和純化感興趣的產(chǎn)物的方法可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。本發(fā)明用于產(chǎn)生基本上無(wú)木聚糖酶活性的產(chǎn)物的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質(zhì)例如酶的產(chǎn)生中是特別令人有興趣的。所述酶可以選自，例如，淀粉分解酶(amylolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶。這些酶的實(shí)例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶(chitinase)、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。木聚糖酶-缺陷細(xì)胞也可以用于表達(dá)在制藥上感興趣的異源蛋白質(zhì)例如激素、生長(zhǎng)因子、受體等?？衫斫獾氖切g(shù)語(yǔ)“真核多肽”不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過氨基酸取代、缺失或添加或其它這樣的修飾而被修飾以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性、ph耐受性等。在另外的方面，本發(fā)明涉及基本上無(wú)木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生。抑制具有木聚糖酶活性的多肽表達(dá)的方法本發(fā)明還涉及抑制具有木聚糖酶活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對(duì)細(xì)胞施用雙鏈rna(dsrna)分子或者在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈rna(dsrna)分子，其中dsrna包含本發(fā)明多核苷酸的亞序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，dsrna長(zhǎng)約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的雙鏈體核苷酸。dsrna優(yōu)選是小干擾rna(sirna)或微rna(mirna)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，dsrna是用于抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾rna(sirna)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，dsrna是用于抑制翻譯的微rna(mirna)。本發(fā)明還涉及用于抑制細(xì)胞中具有木聚糖酶活性的多肽表達(dá)的這些雙鏈rna(dsrna)分子，其包含seqidno:1的成熟多肽編碼序列的部分。本發(fā)明不受限于任何特定作用機(jī)制，dsrna能進(jìn)入細(xì)胞，并引起相似或相同序列的單鏈rna(ssrna)的降解，所述rna包括內(nèi)源mrna。當(dāng)細(xì)胞接觸dsrna時(shí)，來(lái)自同源基因的mrna選擇性地受到稱為rna干擾(rnai)的過程的降解。本發(fā)明的dsrna可以用于基因沉默。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的dsrnai選擇性地降解rna的方法。所述過程可以在體外、在活體外或離體(exvivo)或在體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)方面，dsrna分子能夠用于產(chǎn)生細(xì)胞、器官或動(dòng)物中的功能缺失突變(loss-of-functionmutation)。制備或使用選擇性降解rna的dsrna分子的方法是本領(lǐng)域中公知的，參見，例如，美國(guó)專利no.6,506,559；美國(guó)專利no.6,511,824；美國(guó)專利no.6,515,109；和美國(guó)專利no.6,489,127。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語(yǔ)“富含”表示所述組合物的木聚糖酶活性，例如，以至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)增加。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物?；蛘?，所述組合物可以包含多種酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產(chǎn)生：曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知方法將包括于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。下面給出的是本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選的用途的實(shí)例。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法確定。用途本發(fā)明還涉及使用具有木聚糖酶活性的多肽或其組合物的方法。本發(fā)明的多肽可用于降解或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞壁或任何含木聚糖材料，例如木素纖維素，其來(lái)源于植物細(xì)胞壁(參見，例如wo2002/18561)。多種用途的實(shí)例如下所述。本發(fā)明的多肽的劑量和使用所述多肽的其他條件可基于本領(lǐng)域已知方法來(lái)確定。通過完全或部分去除側(cè)鏈(sidebranch)促進(jìn)了含木聚糖材料的酶法降解。本發(fā)明的多肽優(yōu)選與其他木聚糖降解酶如木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合在其中待降解含木聚糖材料的工藝中一同使用。舉例而言，可通過乙酰木聚糖酯酶去除乙?；鶊F(tuán)；通過α-阿拉伯糖苷酶去除阿拉伯糖基團(tuán)；通過阿魏酸酯酶去除阿魏酰基團(tuán)和通過α-葡糖醛酸糖苷酶去除葡糖醛酸基團(tuán)。由木聚糖酶，或由木聚糖酶和側(cè)鏈水解酶的組合釋放的寡聚物可由β-木糖苷酶進(jìn)一步降解為游離的木糖。本發(fā)明還涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料或含木聚糖材料的方法，其包括：在存在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的情況下，用酶組合物處理纖維素材料或含木聚糖材料。在一個(gè)優(yōu)選方面，所述方法還包括回收已降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料或含木聚糖材料。本發(fā)明還涉及供產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括：(a)在存在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的條件下，用酶組合物糖化纖維素材料或含木聚糖材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料或含木聚糖材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料或含木聚糖材料的方法，其包括：用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料或含木聚糖材料，其中所述纖維素材料或含木聚糖材料是在存在本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽的條件下用酶組合物糖化的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料或含木聚糖材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明的方法可以用于將纖維素材料或含木聚糖材料糖化成可發(fā)酵糖，并且將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成很多有用的物質(zhì)，例如燃料、飲用乙醇和/或發(fā)酵產(chǎn)物(例如酸、醇、酮、氣體等)。從纖維素材料或含木聚糖材料產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物通常涉及預(yù)處理、酶水解(糖化)和發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明的纖維素材料或含木聚糖材料的處理可以使用本領(lǐng)域的常規(guī)工藝完成。此外，本發(fā)明的方法能使用經(jīng)配置以依照發(fā)明操作的任何常規(guī)生物質(zhì)加工設(shè)備進(jìn)行。水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時(shí)，包括但不限于，分離的水解和發(fā)酵(shf)、同步糖化和發(fā)酵(ssf)、同步糖化和共發(fā)酵(sscf)、混合的水解和發(fā)酵(hhf)、分離的水解和共發(fā)酵(shcf)、混合的水解和共發(fā)酵(hhcf)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(dmc)。shf使用分離的處理步驟以首先將纖維素材料或含木聚糖材料酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖、纖維三糖和戊糖，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在ssf中，纖維素材料或含木聚糖材料的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵在一個(gè)步驟中組合(philippidis,g.p.,1996,cellulosebioconversiontechnology,于handbookonbioethanol:productionandutilization,wyman,c.e編,taylor&francis,washington,dc,179-212)。sscf包括多種糖的共發(fā)酵(sheehan,j.,和himmel,m.,1999,enzymes,energyandtheenvironment:astrategicperspectiveontheu.s.departmentofenergy’sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,biotechnol.prog.15:817-827)。hhf在同步糖化和水解步驟之外，還涉及單獨(dú)的水解步驟，所述步驟可以在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行。hhf過程中的步驟可以在不同的溫度，即，高溫酶法糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進(jìn)行ssf。dmc在一個(gè)或多個(gè)步驟中組合了所有三個(gè)過程(酶產(chǎn)生、水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將纖維素或含木聚糖材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的酶(lynd,l.r.,weimer,p.j.,vanzyl,w.h.,和pretorius,i.s.,2002,microbialcelluloseutilization:fundamentalsandbiotechnology,microbiol.mol.biol.reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，任何本領(lǐng)域中已知的方法，包括預(yù)處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。常規(guī)設(shè)備包括補(bǔ)料批式攪拌反應(yīng)器、批式攪拌反應(yīng)器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器和/或連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(fernandadecastilhoscorazza,fláviofariademoraes,gisellamariazanin和ivoneitzel,2003,optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,actascientiarum.technology25:33-38；gusakov,a.v.,和sinitsyn,a.p.,1985,kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose:1.amathematicalmodelforabatchreactorprocess,enz.microb.technol.7:346-352)、研磨反應(yīng)器(ryu,s.k.,和lee,j.m.,1983,bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,biotechnol.bioeng.25:53-65)，或者具有由電磁場(chǎng)引起的強(qiáng)烈攪拌的反應(yīng)器(gusakov,a.v.,sinitsyn,a.p.,davydkin,i.y.,davydkin,v.y.,protas,o.v.,1996,enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,appl.biochem.biotechnol.56:141-153)。其它反應(yīng)器類型包括：流化床、升流層(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或發(fā)酵的擠出機(jī)型的反應(yīng)器。預(yù)處理。在本發(fā)明的方法的實(shí)施中，可以使用本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理過程破壞植物細(xì)胞壁的纖維素材料和/或含木聚糖材料組分(chandra等,2007,substratepretreatment:thekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics？adv.biochem.engin./biotechnol.108:67-93；galbe和zacchi,2007,pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,adv.biochem.engin./biotechnol.108:41-65；hendriks和zeeman,2009,pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass,bioresourcetechnol.100:10-18；mosier等,2005,featuresofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass,bioresourcetechnol.96:673-686；taherzadeh和karimi,2008,pretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproduction:areview,int.j.ofmol.sci.9:1621-1651；yang和wyman,2008,pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,biofuelsbioproductsandbiorefining-biofpr.2:26-40)。纖維素材料或含木聚糖材料也可以在預(yù)處理之前使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行粒度減小、預(yù)浸泡、潤(rùn)濕、洗滌或調(diào)節(jié)。常規(guī)的預(yù)處理包括但不限于，蒸汽預(yù)處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、堿性預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機(jī)溶劑預(yù)處理和生物預(yù)處理。其它預(yù)處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界co2、超臨界h2o、臭氧和γ輻射預(yù)處理?？梢栽谒夂?或發(fā)酵之前預(yù)處理纖維素材料或含木聚糖材料。預(yù)處理優(yōu)選在水解前進(jìn)行?；蛘?，預(yù)處理可以與酶水解同時(shí)進(jìn)行以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟本身使一些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。蒸汽預(yù)處理。在蒸汽預(yù)處理中，加熱纖維素材料或含木聚糖材料以破壞植物細(xì)胞壁成分，包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，使酶可接觸纖維素和其它級(jí)分，例如，半纖維素。將纖維素材料或含木聚糖材料經(jīng)過或通過反應(yīng)容器，其中注入蒸汽以增加溫度至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應(yīng)時(shí)間。蒸汽預(yù)處理優(yōu)選在140-230℃，更優(yōu)選160-200℃，并且最優(yōu)選170-190℃進(jìn)行，其中最優(yōu)的溫度范圍依賴于任何化學(xué)催化劑的添加。蒸汽預(yù)處理的停留時(shí)間優(yōu)選1-15分鐘，更優(yōu)選3-12分鐘，并且最優(yōu)選4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時(shí)間依賴于溫度范圍和任何化學(xué)催化劑的添加。蒸汽預(yù)處理允許相對(duì)較高的固體加載量，使纖維素材料或含木聚糖材料在預(yù)處理過程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后的物質(zhì)的爆炸放料(explosivedischarge)組合，這稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和物質(zhì)的湍流，以通過破碎增加可接觸的表面積(duff和murray,1996,bioresourcetechnology855:1-33；galbe和zacchi,2002,appl.microbiol.biotechnol.59:618-628；美國(guó)專利申請(qǐng)no.20020164730)。在蒸汽預(yù)處理過程中，切割半纖維素乙酰基團(tuán)，并且得到的酸自催化半纖維素部分水解成為單糖和寡糖。去除木質(zhì)素僅至有限的程度。經(jīng)常在蒸汽預(yù)處理之前加入催化劑如h2so4或so2(通常0.3至3％w/w)，其可減少時(shí)間，降低溫度，增加回收率，并改進(jìn)酶水解(ballesteros等,2006,appl.biochem.biotechnol.129-132:496-508；varga等,2004,appl.biochem.biotechnol.113-116:509-523；sassner等.,2006,enzymemicrob.technol.39:756-762)?；瘜W(xué)預(yù)處理：術(shù)語(yǔ)“化學(xué)處理“指能促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/或釋放的任何化學(xué)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理步驟的實(shí)例包括例如稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(afex)、氨滲濾(apr)和有機(jī)溶劑預(yù)處理。在稀酸預(yù)處理中，將纖維素材料或含木聚糖材料與稀酸(通常是h2so4)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時(shí)間后閃變至大氣壓。可以用很多反應(yīng)器設(shè)計(jì)進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如，活塞流反應(yīng)器、逆流反應(yīng)器或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器(duff和murray,1996,supra；schell等,2004,bioresourcetechnol.91:179-188；lee等,1999,adv.biochem.eng.biotechnol.65:93-115)。還可以使用堿性條件下的幾種預(yù)處理方法。這些堿預(yù)處理包括，但不限于，石灰預(yù)處理、濕氧化、氨滲濾(apr)和氨纖維/冷凍爆炸(afex)。用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨，在85-150℃的低溫進(jìn)行石灰預(yù)處理，停留時(shí)間從1小時(shí)到幾天(wyman等,2005,bioresourcetechnol.96:1959-1966；mosier等,2005,bioresourcetechnol.96:673-686)。wo2006/110891、wo2006/110899、wo2006/110900和wo2006/110901公開了使用氨的預(yù)處理方法。濕法氧化是熱預(yù)處理，通常在180-200℃進(jìn)行5-15分鐘，加入氧化劑如過氧化氫或過壓氧(schmidt和thomsen,1998,bioresourcetechnol.64:139-151；palonen等,2004,appl.biochem.biotechnol.117:1-17；varga等,2004,biotechnol.bioeng.88:567-574；martin等,2006,j.chem.technol.biotechnol.81:1669-1677)。預(yù)處理以優(yōu)選1-40％干物質(zhì)，更優(yōu)選2-30％干物質(zhì)，并且最優(yōu)選5-20％干物質(zhì)進(jìn)行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始ph經(jīng)常會(huì)增加。濕法氧化預(yù)處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達(dá)30％的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在預(yù)處理過程中，在一定的停留時(shí)間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結(jié)束預(yù)處理(wo2006/032282)。氨纖維爆炸(afex)涉及在溫和溫度如90-100℃和高壓如17-20bar，用液體或氣體氨將纖維素材料或含木聚糖材料處理5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達(dá)60％(gollapalli等,2002,appl.biochem.biotechnol.98:23-35；chundawat等,2007,biotechnol.bioeng.96:219-231；alizadeh等,2005,appl.biochem.biotechnol.121:1133-1141；teymouri等,2005,bioresourcetechnol.96:2014-2018)。afex預(yù)處理導(dǎo)致纖維素解聚，和半纖維素的部分水解。木質(zhì)素-糖復(fù)合物得到切割。有機(jī)溶劑預(yù)處理通過用含水乙醇(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分鐘而將纖維素材料或含木聚糖材料去木質(zhì)素化(pan等,2005,biotechnol.bioeng.90:473-481；pan等,2006,biotechnol.bioeng.94:851-861；kurabi等,2005,appl.biochem.biotechnol.121:219-230)。經(jīng)常加入硫酸作為催化劑。在有機(jī)溶劑預(yù)處理中，去除大部分半纖維素。合適的預(yù)處理方法的其他實(shí)例如schell等,2003,appl.biochemandbiotechn.vol.105-108:69-85,和mosier等,2005,bioresourcetechnology96:673-686,和美國(guó)專利公開申請(qǐng)2002/0164730所述。在一個(gè)方面，化學(xué)預(yù)處理優(yōu)選作為酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸和/或弱酸(mildacid)處理進(jìn)行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸處理在優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4，并且最優(yōu)選1-3的ph范圍內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)方面，酸濃度在優(yōu)選0.01至20wt％酸，更優(yōu)選0.05至10wt％酸，甚至更優(yōu)選0.1至5wt％酸，并且最優(yōu)選0.2至2.0wt％酸的范圍內(nèi)。酸與纖維素材料或含木聚糖材料接觸，并在優(yōu)選160-220℃，和更優(yōu)選165-195℃范圍內(nèi)的溫度保持?jǐn)?shù)秒到數(shù)分鐘，例如1秒-60分鐘的時(shí)間。在另一個(gè)方面，預(yù)處理作為氨纖維爆炸步驟(afex預(yù)處理步驟)進(jìn)行。在另一個(gè)方面，預(yù)處理發(fā)生在含水漿料中。在優(yōu)選的方面，在預(yù)處理過程中纖維素材料或含木聚糖材料以優(yōu)選10-80wt％，更優(yōu)選20-70wt％，并且最優(yōu)選30-60wt％，如約50wt％的量存在。預(yù)處理的纖維素材料或含木聚糖材料可以不洗滌或者使用本領(lǐng)域任何已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。機(jī)械預(yù)處理：術(shù)語(yǔ)“機(jī)械預(yù)處理”指各種類型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、濕磨或振動(dòng)球磨)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，機(jī)械預(yù)處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過程、蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如來(lái)自sundsdefibratorab,sweden的sundshydrolyzer中進(jìn)行。物理預(yù)處理：術(shù)語(yǔ)“物理預(yù)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料或含木聚糖材料分離和/或釋放的任何預(yù)處理。例如，物理預(yù)處理可涉及輻射(例如，微波輻射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)和它們的組合。物理預(yù)處理可以涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一個(gè)方面，高壓指優(yōu)選約300至約600psi，更優(yōu)選約350至約550psi，并且最優(yōu)選約400至約500psi，如約450psi的壓力。在另一個(gè)方面，高溫指約100至300℃，優(yōu)選約140至235℃的溫度。組合的物理和化學(xué)預(yù)處理：可以對(duì)纖維素材料或含木聚糖材料進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。例如，預(yù)處理步驟可以涉及稀酸或弱酸處理和高的溫度和/或壓力處理。根據(jù)需要，可以順序或同時(shí)進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。還可以包括機(jī)械預(yù)處理。因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面，對(duì)纖維素材料或含木聚糖材料進(jìn)行機(jī)械、化學(xué)或物理預(yù)處理，或者它們的任何組合，以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。生物預(yù)處理：術(shù)語(yǔ)“生物預(yù)處理”指可以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料或含木聚糖材料分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以包括應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物(參見，例如，hsu,t.-a.,1996,pretreatmentofbiomass,于handbookonbioethanol:productionandutilization,wyman,c.e編,taylor&francis,washington,dc,179-212；ghosh和singh,1993,physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,adv.appl.microbiol.39:295-333；mcmillan,j.d.,1994,pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于enzymaticconversionofbiomassforfuelsproduction,himmel,m.e.,baker,j.o.,和overend,r.p.,編,acssymposiumseries566,americanchemicalsociety,washington,dc,第15章；gong,c.s.,cao,n.j.,du,j.,和tsao,g.t.,1999,ethanolproductionfromrenewableresources,于advancesinbiochemicalengineering/biotechnology,scheper,t.,編,springer-verlagberlinheidelberg,germany,65:207-241；olsson和hahn-hagerdal,1996,fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,enz.microb.tech.18:312-331；和vallander和eriksson,1990,productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:stateoftheart,adv.biochem.eng./biotechnol.42:63-95)。糖化。在水解(也稱作糖化)步驟中，將例如經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料或含木聚糖材料水解以將纖維素和半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由酶組合物以酶法在本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽的存在下進(jìn)行。組合物的酶還可以順序加入。酶水解優(yōu)選在易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的方面，水解在適于酶的活性，即對(duì)于酶最佳的條件下進(jìn)行。水解可以以補(bǔ)料批式或連續(xù)的過程進(jìn)行，其中將預(yù)處理的纖維素材料或含木聚糖材料(底物)逐漸補(bǔ)入，例如，含酶的水解溶液中。糖化通常在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中，在受控的ph、溫度和混合條件下進(jìn)行。合適的處理時(shí)間、溫度和ph條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長(zhǎng)達(dá)200小時(shí)，但是通常優(yōu)選進(jìn)行約12至約96小時(shí)，更優(yōu)選約16至約72小時(shí)，并且最優(yōu)選約24至約48小時(shí)。溫度優(yōu)選約25℃至約70℃，更優(yōu)選約30℃至約65℃，并且最優(yōu)選約40℃至約60℃，特別是約50℃。ph優(yōu)選約3至約8，更優(yōu)選約3.5至約7，并且最優(yōu)選約4至約6，特別是約ph5。干燥固體含量?jī)?yōu)選約5至約50wt％，更優(yōu)選約10至約40wt％，并且最優(yōu)選約20至約30wt％。所述酶組合物優(yōu)選包含具有纖維素分解活性和/或木聚糖降解活性。在一個(gè)方面，所述酶組合物包含一種或多種木聚糖降解酶。在另一個(gè)方面所述酶組合物包含一種或多種纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，所述酶組合物包含一種或多種木聚糖降解酶和一種或多種纖維素分解酶。所述一種或多種木聚糖降解酶優(yōu)選選自下組：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。所述一種或多種纖維素分解酶優(yōu)選選自下組：內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述酶組合物另外或甚至還包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(參見，例如wo2005/074647、wo2005/074656和wo2007/089290)。在另一個(gè)方面，所述酶組合物可進(jìn)一步或甚至進(jìn)一步包含一種或多種其他酶活性以改善含纖維素材料或含木聚糖材料的降解。其他優(yōu)選的酶為半纖維素酶(例如α-d-葡糖醛酸糖苷酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、內(nèi)切甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、內(nèi)切-α-l-阿拉伯聚糖酶、β-半乳糖苷酶)，糖酯酶(例如乙酰木聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡糖醛酸酯酶(glucuronoylesterases))，果膠酶，蛋白酶，木質(zhì)素分解酶(ligninolyticenzyme)(例如漆酶、錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶、h2o2產(chǎn)生酶、氧化還原酶)，棒曲霉素(expansin)、膨脹素(swollenin)或其組合。在本發(fā)明的方法中，其他酶可在發(fā)酵之前或之中添加，例如在糖化過程中或在發(fā)酵微生物繁殖過程中或之后添加。所述酶組合物的一種或多種組分可為野生型蛋白、重組蛋白或野生型蛋白和重組蛋白的組合。舉例而言，一種或多種組分可為細(xì)胞的天然蛋白，其用作宿主細(xì)胞以重組表達(dá)酶組合物的一種或多種(幾種)其他組分。酶組合物的一種或多種組分可作為單組分產(chǎn)生，然后將其組合以形成酶組合物。所述酶組合物可為多組分和單組分蛋白制備物的組合。用于本發(fā)明方法中的酶可為任何適用于本文中所述工藝的形式，如例如去除或未去除細(xì)胞的粗發(fā)酵液，半純化或純化的酶制備物，或宿主細(xì)胞，作為酶的來(lái)源。所述酶組合物可為干粉或顆粒，無(wú)粉塵的顆粒，液體，穩(wěn)定化液體或穩(wěn)定化受保護(hù)的酶。液體酶制備物可根據(jù)確立的工藝，例如通過添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機(jī)酸來(lái)穩(wěn)定化。具有木聚糖酶活性的酶和多肽的最適量取決于幾個(gè)因素，其包括但不限于，組分酶的混合物、纖維素材料或含木聚糖材料、纖維素材料或含木聚糖材料的濃度、纖維素材料或含木聚糖材料的預(yù)處理、溫度、時(shí)間、ph和包括發(fā)酵生物體(例如，同步糖化和發(fā)酵的酵母)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素分解酶和/或木聚糖降解酶對(duì)于纖維素材料或含木聚糖材料的有效量是約0.5至約50mg，優(yōu)選約0.5至約40mg，更優(yōu)選約0.5至約25mg，更優(yōu)選約0.75至約20mg，更優(yōu)選約0.75至約15mg，甚至更優(yōu)選約0.5至約10mg，并且最優(yōu)選約2.5至約10mg每g纖維素材料或含木聚糖材料。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有木聚糖酶活性的多肽對(duì)于纖維素材料或含木聚糖材料的有效量是約0.01至約50.0mg，優(yōu)選約0.01至約40mg，更優(yōu)選約0.01至約30mg，更優(yōu)選約0.01至約20mg，更優(yōu)選約0.01至約10mg，更優(yōu)選約0.01至約5mg，更優(yōu)選約0.025至約1.5mg，更優(yōu)選約0.05至約1.25mg，更優(yōu)選約0.075至約1.25mg，更優(yōu)選約0.1至約1.25mg，甚至更優(yōu)選約0.15至約1.25mg，并且最優(yōu)選約0.25至約1.0mg每g纖維素材料或含木聚糖材料。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有木聚糖酶活性的多肽對(duì)于纖維素分解酶和/或木聚糖降解酶的有效量是約0.005至約1.0g，優(yōu)選約0.01至約1.0g，更優(yōu)選約0.15至約0.75g，更優(yōu)選約0.15至約0.5g，更優(yōu)選約0.1至約0.5g，甚至更優(yōu)選約0.1至約0.5g，并且最優(yōu)選約0.05至約0.2g每g纖維素分解酶。酶可源自或獲得自任何合適的來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、酵母、植物或哺乳動(dòng)物來(lái)源。術(shù)語(yǔ)“獲得”在本文中意指該酶可從天然產(chǎn)生該酶作為天然酶的生物分離。術(shù)語(yǔ)“獲得”在本文中還意指該酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重組產(chǎn)生，其中經(jīng)重組產(chǎn)生的酶對(duì)于宿主生物是天然的或異源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，具有一個(gè)或多個(gè)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶，其為天然氨基酸序列的片段和/或突變體或通過本領(lǐng)域已知的氨基酸改組方法產(chǎn)生的酶。天然酶的含義中涵蓋的是天然變體，而外來(lái)酶的含義中涵蓋的是重組(如通過定位誘變或重排)獲得的變體具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽如芽孢桿菌屬(bacillus)、鏈球菌屬(streptococcus)、鏈霉菌屬(streptomyces)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、腸球菌屬(enterococcus)、乳桿菌屬(lactobacillus)、乳球菌屬(lactococcus)、梭菌屬(clostridium)、地芽孢桿菌屬(geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(oceanobacillus)多肽，所述多肽具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(pseudomonas)、沙門氏菌屬(salmonella)、彎曲桿菌屬(campylobacter)、螺桿菌屬(helicobacter)、黃桿菌屬(flavobacterium)、梭桿菌屬(fusobacterium)、泥桿菌屬(ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(neisseria)或脲原體屬(ureaplasma)多肽，所述多肽具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌或淺青紫鏈霉菌多肽。具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬多肽，其具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬、傘菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、botryospaeria、擬蠟菌屬、chaetomidium、金孢子菌屬、claviceps、cochliobolus、鬼傘屬、coptotermes、棒囊殼屬、隱叢赤殼菌屬、隱球菌屬、色二孢屬、黑耳屬、filibasidium、鐮孢屬、赤霉屬、全鞭毛蟲屬、腐質(zhì)霉屬、耙齒菌屬、蘑菇屬、leptospaeria、梨孢菌屬、melanocarpus、多孔菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、poitrasia、假黑盤菌屬、pseudotrichonympha、根毛霉屬、裂褶菌屬、柱頂孢屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、長(zhǎng)毛盤菌屬、輪枝孢屬、包腳菇屬或炭角菌屬多肽，其具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有纖維素分解活性或木聚糖降解活性的解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角質(zhì)金孢子菌、chrysosporiumlucknowense、熱帶金孢子菌、chrysosporiummerdarium、chrysosporiuminops、氈金孢子菌、chrysosporiumqueenslandicum、chrysosporiumzonatum、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質(zhì)霉、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、白耙齒菌、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、thielaviaachromatica、thielaviaalbomyces、thielaviaalbopilosa、澳洲梭孢殼、thielaviafimeti、小孢梭孢殼、卵孢梭孢殼、thielaviaperuviana、瘤孢梭孢殼、毛梭孢殼、thielaviasubthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、綠色木霉或褐孢長(zhǎng)毛盤菌(trichophaeasaccata)多肽。還可以使用具有纖維素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。所述纖維素分解酶組合物的一種或多種組分可以是重組組分，亦即，通過克隆編碼所述單獨(dú)組分的dna序列并隨后用該dna序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并在宿主中表達(dá)(參見，例如，wo91/17243和wo91/17244)產(chǎn)生。所述宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對(duì)宿主是外源的)，但該宿主在一定條件下也可以是同源宿主(酶對(duì)宿主是天然的)。單組分纖維素分解蛋白還可以通過從發(fā)酵液中提純這樣的蛋白質(zhì)來(lái)制備。適用于本發(fā)明的商業(yè)的纖維素分解蛋白制備物的實(shí)例包括，例如，cellictmctec(novozymesa/s)、celluclasttm(novozymesa/s)和novozymtm188(novozymesa/s)。其他可用的商業(yè)上可獲得的包含纖維素酶的制備物包括celluzymetm、cereflotm和ultraflotm(novozymesa/s)，laminextm和spezymetmcp(genencorint.)，rohamenttm7069w(gmbh)，和ldi、lbr或150l(dyadicinternational,inc.)。所述纖維素酶以固體的約0.001到約5.0wt.％，更優(yōu)選固體的0.025到約4.0wt.％，且最優(yōu)選固體的約0.005到約2.0wt.％的有效量添加?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，解纖維熱酸菌(acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(wo91/05039；wo93/15186；美國(guó)專利5,275,944；wo96/02551；美國(guó)專利5,536,655，wo00/70031，wo05/093050)；thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶iii(wo05/093050)；和thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶v(wo05/093050)?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i(penttila等,1986,gene45:253-263；genbanktm登錄號(hào)m15665)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ii(saloheimo等,1988,gene63:11-22；genbanktm登錄號(hào)m19373)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iii(okada等,1988,appl.environ.microbiol.64:555-563；genbanktm登錄號(hào)ab003694)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iv(saloheimo等,1997,eur.j.biochem.249:584-591；genbanktm登錄號(hào)y11113)；和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v(saloheimo等,1994,molecularmicrobiology13:219-228；genbanktm登錄號(hào)z33381)；棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(ooi等,1990,nucleicacidsresearch18:5884)；川地曲霉(aspergilluskawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(sakamoto等,1995,currentgenetics27:435-439)；胡蘿卜軟腐歐文氏菌(erwiniacarotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(saarilahti等,1990,gene90:9-14)；尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(genbanktm登錄號(hào)l29381)；灰腐質(zhì)霉thermoidea變種內(nèi)切葡聚糖酶(genbanktm登錄號(hào)ab003107)；melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(genbanktm登錄號(hào)mal515703)；粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(genbanktm登錄號(hào)xm_324477)；特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶v；嗜熱毀絲霉cbs117.65內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱(basidiomycete)cbs495.95內(nèi)切葡聚糖酶；擔(dān)子菌綱cbs494.95內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉nrrl8126cel6b內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉nrrl8126cel6c內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉nrrl8126cel7c內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉nrrl8126cel7e內(nèi)切葡聚糖酶；土生梭孢霉nrrl8126cel7f內(nèi)切葡聚糖酶；cladorrhinumfoecundissimumatcc62373cel7a內(nèi)切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株vtt-d-80133內(nèi)切葡聚糖酶(genbanktm登錄號(hào)m15665)?？捎糜诒景l(fā)明的方法的纖維二糖水解酶的實(shí)例包括但不僅限于，里氏木霉纖維二糖水解酶i；里氏木霉纖維二糖水解酶ii；特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶i、嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶ii、土生梭孢霉纖維二糖水解酶ii(cel6a)、嗜熱毛殼菌(chaetomiumthermophilum)纖維二糖水解酶i以及嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶ii?？捎糜诒景l(fā)明的方法的β-葡糖苷酶的實(shí)例包括但不僅限于米曲霉β-葡糖苷酶；煙曲霉β-葡糖苷酶；巴西青霉(penicilliumbrasilianum)ibt20888β-葡糖苷酶；黑曲霉β-葡糖苷酶；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶。具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根據(jù)wo2002/095014獲取。具有β-葡糖苷酶活性的煙曲霉多肽可根據(jù)wo2005/047499獲取。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根據(jù)wo2007/019442獲取。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根據(jù)dan等,2000,j.biol.chem.275:4973-4980獲取。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根據(jù)kawaguchi等,1996,gene173:287-288獲取。所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一個(gè)方面，所述β-葡糖苷酶是根據(jù)wo2008/057637獲得的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶變體bg融合蛋白。其它內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶使用根據(jù)henrissatb.,1991,aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,biochem.j.280:309-316和henrissatb.和bairocha.,1996,updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,biochem.j.316:695-696的分類公開于許多糖基水解酶家族中。其它可用于本發(fā)明的纖維素分解酶描述于ep495,257、ep531,315、ep531,372、wo89/09259、wo94/07998、wo95/24471、wo96/11262、wo96/29397、wo96/034108、wo97/14804、wo98/08940、wo98/012307、wo98/13465、wo98/015619、wo98/015633、wo98/028411、wo99/06574、wo99/10481、wo99/025846、wo99/025847、wo99/031255、wo2000/009707、wo2002/050245、wo2002/0076792、wo2002/101078、wo2003/027306、wo2003/052054、wo2003/052055、wo2003/052056、wo2003/052057、wo2003/052118、wo2004/016760、wo2004/043980、wo2004/048592、wo2005/001065、wo2005/028636、wo2005/093050、wo2005/093073、wo2006/074005、wo2006/117432、wo2007/071818、wo2007/071820、wo2008/008070、wo2008/008793、美國(guó)專利no.4,435,307、美國(guó)專利no.5,457,046、美國(guó)專利no.5,648,263、美國(guó)專利no.5,686,593、美國(guó)專利no.5,691,178、美國(guó)專利no.5,763,254以及美國(guó)專利no.5,776,757。在本發(fā)明的方法中，可使用任何具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在一個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含下述基序：[ilmv]-p-x(4,5)-g-x-y-[ilmv]-x-r-x-[eq]-x(4)-[hnq]和[fw]-[tf]-k-[aiv]，其中x為任意氨基酸，x(4,5)為在4或5個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而x(4)是在4個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。包含上述所示的基序的多肽可進(jìn)一步包含：h-x(1,2)-g-p-x(3)-[yw]-[ailmv]，[eq]-x-y-x(2)-c-x-[ehqn]-[filv]-x-[ilv]，或h-x(1,2)-g-p-x(3)-[yw]-[ailmv]和[eq]-x-y-x(2)-c-x-[ehqn]-[filv]-x-[ilv]，其中x為任意氨基酸，x(1,2)為在1個(gè)位置或2個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，x(3)為3個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而x(2)為2個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認(rèn)的iupac單字母氨基酸縮寫。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽進(jìn)一步包含h-x(1,2)-g-p-x(3)-[yw]-[ailmv]。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽包含[eq]-x-y-x(2)-c-x-[ehqn]-[filv]-x-[ilv]。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽進(jìn)一步包含h-x(1,2)-g-p-x(3)-[yw]-[ailmv]和[eq]-x-y-x(2)-c-x-[ehqn]-[filv]-x-[ilv]。在第二個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含下述基序：[ilmv]-p-x(4,5)-g-x-y-[ilmv]-x-r-x-[eq]-x(3)-a-[hnq],其中x為任意氨基酸，x(4,5)為在4或5個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸，而x(3)為3個(gè)連續(xù)位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公認(rèn)的iupac單字母氨基酸縮寫?？捎糜诒景l(fā)明的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的實(shí)例包括但不限于來(lái)自土生梭孢霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(wo2005/074647)；來(lái)自桔橙熱子囊菌的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(wo2005/074656)；和來(lái)自里氏木霉的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽(wo2007/089290)。適用于本發(fā)明的商業(yè)性木聚糖降解酶制備物的實(shí)例包括，例如shearzymetm(novozymesa/s)、cellictmhtec(novozymesa/s)、(novozymesa/s)、(novozymesa/s)、hc(novozymesa/s)、xylanase(genencor)、tx-200a(abenzymes)、hsp6000xylanase(dsm)、depoltm333p(biocatalystslimit,wales,uk)、depoltm740l(biocatalystslimit,wales,uk)和depoltm762p(biocatalystslimit,wales,uk)?？捎糜诒景l(fā)明方法的木聚糖酶的實(shí)例包括但不限于棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)木聚糖酶(geneseqp:aar63790；wo94/21785)、煙曲霉(aspergillusfumigatus)木聚糖酶(wo2006/078256)和土生梭孢霉(thielaviaterrestris)nrrl8126木聚糖酶(wo2009/079210)?？捎糜诒景l(fā)明方法的β-木糖苷酶的實(shí)例包括但不限于里氏木霉(trichodermareesei)β-木糖苷酶(uniprotkb/trembl登錄號(hào)q92458)、埃默森踝節(jié)菌(talaromycesemersonii)(swissprot登錄號(hào)q8x212)和粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)(swissprot登錄號(hào)q7sow4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的乙酰木聚糖酯酶的實(shí)例包括但不限于紅褐肉座菌(hypocreajecorina)乙酰木聚糖酯酶(wo2005/001036)、粗糙脈孢菌乙酰木聚糖酯酶(uniprot登錄號(hào)q7s259)、土生梭孢霉nrrl8126乙酰木聚糖酯酶(wo2009/042846)、球毛殼菌(chaetomiumglobosum)乙酰木聚糖酯酶(uniprot登錄號(hào)q2gwx4)、細(xì)麗毛殼菌(chaetomiumgracile)乙酰木聚糖酯酶(geneseqp登錄號(hào)aab82124)、穎枯殼針孢(phaeosphaerianodorum)乙酰木聚糖酯酶(uniprot登錄號(hào)q0uhj1)和特異腐質(zhì)霉(humicolainsolens)dsm1800乙酰木聚糖酯酶(wo2009/073709)?？捎糜诒景l(fā)明方法的阿魏酸酯酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉dsm1800阿魏酸酯酶(wo2009/076122)、粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶(uniprot登錄號(hào)q9hgr3)和費(fèi)希新薩托菌(neosartoryafischer)阿魏酸酯酶(uniprot登錄號(hào)a1d9t4)。可用于本發(fā)明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉(humicolainsolens)dsm1800阿拉伯呋喃糖苷酶(wo2009/073383)和黑曲霉(aspergillusniger)阿拉伯呋喃糖苷酶(geneseqp登錄號(hào)aar94170)?？捎糜诒景l(fā)明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的實(shí)例包括但不限于棒曲霉(aspergillusclavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(uniprot登錄號(hào)alcc12)、里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(uniprot登錄號(hào)q99024)、埃默森踝節(jié)菌α-葡糖醛酸糖苷酶(uniprot登錄號(hào)q8x211)、黑曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(uniprot登錄號(hào)q96wx9)、土曲霉(aspergillusterreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(swissprot登錄號(hào)q0cjp9)和煙曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(swissprot登錄號(hào)q4ww45)。用于本發(fā)明方法的酶和蛋白可通過在含有合適碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，使用本領(lǐng)域已知方法(參見，例如bennett,j.w.和lasure,l.(編),moregenemanipulationsinfungi,academicpress,ca,1991)發(fā)酵上述指出的微生物菌株來(lái)產(chǎn)生。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商獲得，或可根據(jù)已公開組合物制備(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。適于生長(zhǎng)和酶產(chǎn)生的溫度范圍和其他條件在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如bailey,j.e.和ollis,d.f.,biochemicalengineeringfundamentals,mcgraw-hillbookcompany,ny,1986)。所述發(fā)酵可以是任何其結(jié)果為酶表達(dá)或分離的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。因此，發(fā)酵可以理解為包括在合適的培養(yǎng)基中并在允許所述酶得以表達(dá)或分離的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小-或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產(chǎn)生的所得的酶可從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并通過常規(guī)方法純化。發(fā)酵?？赏ㄟ^一種或多種能將糖直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物發(fā)酵自經(jīng)預(yù)處理和水解的纖維素材料或含木聚糖材料獲得的可發(fā)酵糖?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費(fèi)品醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如，發(fā)酵乳產(chǎn)品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且能由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料或含木聚糖材料釋放的糖，通過發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為產(chǎn)物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是單獨(dú)或同時(shí)的。在實(shí)施本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料或含木聚糖材料。通常根據(jù)所需發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來(lái)選擇所述材料，如本領(lǐng)域中所公知的。術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(ssf)中使用的培養(yǎng)基?！鞍l(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細(xì)菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是c6和/或c5發(fā)酵生物體，或它們的組合。c6和c5發(fā)酵生物體均在本領(lǐng)域公知。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成所需的發(fā)酵產(chǎn)品?？僧a(chǎn)生乙醇的細(xì)菌和真菌發(fā)酵生物體的實(shí)例如lin等,2006,appl.microbiol.biotechnol.69:627-642所述。能發(fā)酵c6糖的發(fā)酵微生物的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種，優(yōu)選釀酒酵母。能發(fā)酵c5糖的發(fā)酵生物體的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的c5發(fā)酵酵母包括畢赤酵母屬，優(yōu)選樹干畢赤酵母(pichiastipitis)的菌株，如樹干畢赤酵母cbs5773；假絲酵母屬，優(yōu)選博伊丁假絲酵母(candidaboidinii)、蕓薹假絲酵母(candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(candidapseudotropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母(candidautilis)的菌株。其它發(fā)酵生物體包括發(fā)酵單胞菌屬(zymomonas)，如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilis)；漢遜酵母屬，如異常漢遜酵母(hansenulaanomala)；克魯維酵母屬，如脆壁克魯維酵母；裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(s.pombe)；和大腸桿菌，特別是已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾而改進(jìn)乙醇產(chǎn)量的大腸桿菌。在一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(saccharomycesdistaticus)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(saccharomycesuvarum)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是克魯維酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母(kluyveromycesmarxianus)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是假絲酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(clavispora)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(clavisporalusitaniae)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(clavisporaopuntiae)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬(pachysolen)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(pachysolentannophilus)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬(bretannomyces)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(bretannomycesclausenii)(philippidis,g.p.,1996,cellulosebioconversiontechnology,于handbookonbioethanol:productionandutilization,wyman,c.e.編,taylor&francis,washington,dc,179-212)。能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細(xì)菌包括，例如，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和熱纖維梭菌(philippidis,1996,見上文)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌是發(fā)酵單胞菌屬。在更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌是梭菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是熱纖維梭菌。商業(yè)上可得到的適合乙醇產(chǎn)生的酵母包括，例如ethanolredtm酵母(可從redstar/lesaffre,usa獲得)、falitm(可從fleischmann’syeast,burnsphilpfoodinc.,usa獲得)、superstarttm和thermosacctm新鮮酵母(可從ethanoltechnology,wi,usa獲得)、biofermtmaft和xr(可從nabc-northamericanbioproductscorporation,ga,usa獲得)、gertstrandtm(可從gertstrandab,sweden獲得)和fermioltm(可從dsmspecialties獲得)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾，提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通過將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(chen和ho,1993,cloningandimprovingtheexpressionofpichiastipitisxylosereductasegeneinsaccharomycescerevisiae,appl.biochem.biotechnol.39-40:135-147；ho等,1998,geneticallyengineeredsaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,appl.environ.microbiol.64:1852-1859；kotter和ciriacy,1993,xylosefermentationbysaccharomycescerevisiae,appl.microbiol.biotechnol.38:776-783；walfridsson等,1995,xylose-metabolizingsaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingthetkl1andtal1genesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,appl.environ.microbiol.61:4184-4190；kuyper等,2004,minimalmetabolicengineeringofsaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple,femsyeastresearch4:655-664；beall等,1991,parametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantescherichiacoli,biotech.bioeng.38:296-303；ingram等,1998,metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,biotechnol.bioeng.58:204-214；zhang等,1995,metabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologeniczymomonasmobilis,science267:240-243；deanda等,1996,developmentofanarabinose-fermentingzymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,appl.environ.microbiol.62:4465-4470；wo2003/062430,xyloseisomerase)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是克魯維酵母菌種。本領(lǐng)域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。通常向水解物加入發(fā)酵微生物，并進(jìn)行約8至約96小時(shí)，如約24至約60小時(shí)發(fā)酵。溫度通常為約26℃至約60℃，特別是約32℃或50℃，并且在約ph3至約ph8，如約ph4-5、6或7。在一個(gè)優(yōu)選的方面，對(duì)降解的纖維素材料或含木聚糖材料施用酵母和/或另一種微生物，并進(jìn)行約12至約96小時(shí)，如通常為24-60小時(shí)發(fā)酵。在一個(gè)優(yōu)選的方面，溫度優(yōu)選為約20℃至約60℃，更優(yōu)選約25℃至約50℃，并且最優(yōu)選約32℃至約50℃，特別是約32℃或50℃，并且ph通常為約ph3至約ph7，優(yōu)選約ph4-7。然而，一些發(fā)酵生物體例如細(xì)菌，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約105-1012，優(yōu)選約107-1010，特別是約2x108活細(xì)胞計(jì)數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關(guān)于使用酵母進(jìn)行發(fā)酵的進(jìn)一步指導(dǎo)可以在例如“thealcoholtextbook”(k.jacques,t.p.lyons和d.r.kelsall編,nottinghamuniversitypress,unitedkingdom1999)中找到，其通過提述并入本文。發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何方法組合使用，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵工藝，而且特定地，改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“發(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長(zhǎng)的刺激劑。優(yōu)選的用于生長(zhǎng)的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素a、b、c、d和e。參見，例如，alfenore等,improvingethanolproductionandviabilityofsaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-batchprocess,springer-verlag(2002)，其通過提述并入本文。礦物質(zhì)的實(shí)例包括能夠提供營(yíng)養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營(yíng)養(yǎng)物包括p、k、mg、s、ca、fe、zn、mn和cu。發(fā)酵產(chǎn)物：發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機(jī)酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2,5-二酮-d-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如，甲烷、氫氣(h2)、二氧化碳(co2)和一氧化碳(co))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價(jià)值產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇?？衫斫獾氖?，術(shù)語(yǔ)“醇”包括包含一個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見，例如，gong,c.s.,cao,n.j.,du,j.,和tsao,g.t.,1999,ethanolproductionfromrenewableresources,于advancesinbiochemicalengineering/biotechnology,scheper,t.編,springer-verlagberlinheidelberg,germany,65:207-241；silveira,m.m.,和jonas,r.,2002,thebiotechnologicalproductionofsorbitol,appl.microbiol.biotechnol.59:400-408；nigam,p.,和singh,d.,1995,processesforfermentativeproductionofxylitol–asugarsubstitute,processbiochemistry30(2):117-124；ezeji,t.c.,qureshi,n.和blaschek,h.p.,2003,productionofacetone,butanolandethanolbyclostridiumbeijerinckiiba101andinsiturecoverybygasstripping,worldjournalofmicrobiologyandbiotechnology19(6):595-603。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是有機(jī)酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是醋酮酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是己二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是檸檬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是2,5-二酮-d-葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是甲酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是反丁烯二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖醛酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是戊二酸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是3-羥基丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是衣康酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乳酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是蘋果酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是草酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是木糖酸。參見，例如，chen,r.,和lee,y.y.,1997,membrane-mediatedextractivefermentationforlacticacidproductionfromcellulosicbiomass,appl.biochem.biotechnol.63-65:435-448。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是酮?？衫斫獾氖切g(shù)語(yǔ)“酮”涵蓋含有一個(gè)或多個(gè)酮基的物質(zhì)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見，例如，qureshi和blaschek,2003，見上文。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氨基酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是天冬氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見，例如，richard,a.,和margaritis,a.,2004,empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,biotechnologyandbioengineering87(4):501-515。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氣體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是h2。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是co2。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是co。參見，例如，kataoka,n.,a.miya,和k.kiriyama,1997,studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,waterscienceandtechnology36(6-7):41-47；和gunaseelanv.n.于biomassandbioenergy,vol.13(1-2),pp.83-114,1997,anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:areview?；厥湛梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度、蒸餾或提取。例如，通過常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料或含木聚糖材料分離并純化醇?？梢垣@得純度高達(dá)約96vol％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。其他用途本發(fā)明的多肽還可與其他木聚糖分解酶的有限活性一同使用以降解木聚糖以供產(chǎn)生寡糖。所述寡糖可用作填充劑(bulkingagent)，如從谷物細(xì)胞壁材料釋放的阿拉伯木聚糖寡糖，或來(lái)自谷物的或多或少(moreorless)經(jīng)純化的阿拉伯木聚糖。本發(fā)明的多肽還可用于與其他木聚糖分解酶組合以將木聚糖降解為木糖和其他單糖(美國(guó)專利5,658,765號(hào))。釋放出的木糖可轉(zhuǎn)化為其他化合物。本發(fā)明的多肽可與其他酶如葡聚糖酶一同使用以改善從富油植物材料提取油，如從玉米胚提取玉米油。本發(fā)明的多肽還可用于烘烤以改善生面團(tuán)的成熟(development)、彈性和/或穩(wěn)定性，和/或烘烤產(chǎn)品的體積、瓤結(jié)構(gòu)(crumbstructure)和/或防腐性(anti-stalingproperty)(參見美國(guó)專利5,693,518號(hào))。所述多肽還可用于制備從任何類型的面粉或粉(例如基于小麥、黑麥、大麥、燕麥或玉米的)制備的生面團(tuán)或烘烤產(chǎn)品。用本發(fā)明的多肽產(chǎn)生的烘烤產(chǎn)品包括面包、小白面包(roll)、法國(guó)棍狀面包(baquette)等。就烘烤目的，本發(fā)明的多肽可用作僅有的或主要的酶活性，或可與其他酶如木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶、氧化酶(例如葡糖氧化酶、過氧化物酶)、漆酶和/或蛋白酶組合使用。本發(fā)明的多肽亦可用于修飾動(dòng)物飼料并可在體外(通過修飾飼料的組分)或在體內(nèi)施加其作用以改善飼料的可消化性并增加其利用效率(美國(guó)專利6,245,546號(hào))。可將所述多肽添加至包含高量阿拉伯木聚糖和葡糖醛酸木聚糖的動(dòng)物飼料組合物中，例如包含谷物如大麥、小麥、黑麥、燕麥或玉米的飼料。當(dāng)添加至飼料時(shí)，多肽會(huì)改善植物細(xì)胞壁材料的體內(nèi)降解，這部分是由于腸粘度(intestinalviscosity)的減少(bedford等,1993,proceedingsofthe1stsymposiumonenzymesinanimalnutrition,pp.73-77)，由此實(shí)現(xiàn)動(dòng)物對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)利用的改善。由此，改善了動(dòng)物的生長(zhǎng)速率和/或飼料轉(zhuǎn)化率(即攝入的飼料的重量相對(duì)于體重增加的比例)。本發(fā)明的多肽還可用于造紙和紙漿工業(yè)，用于漂白工藝以增強(qiáng)經(jīng)漂白的紙漿的亮度由此減少在漂白階段使用的氯的量，和用于在回收紙工藝中增加紙漿的自由度(freeness)(eriksson,1990,woodscienceandtechnology24:79-101；paice等,1988,biotechnol.andbioeng.32:235-239,和pommier等,1989,tappijournal187-191)，但不限于此。對(duì)木素纖維素紙漿的處理可例如如美國(guó)專利5,658,765號(hào)、wo93/08275、wo91/02839和wo92/03608中所述進(jìn)行。本發(fā)明的多肽還可用于啤酒釀造，特別是用于改善包含例如大麥和/或高粱麥芽的麥芽汁的可濾過性(filterability)(wo2002/24926)。所述多肽可以以相同方式用作常規(guī)用于釀造的戊聚糖酶，例如，如等,1993,j.inst.brew.99:243-248和ep227159所述。此外，所述多肽可用于處理釀酒干酒糟(brewersspentgrain)，即來(lái)自包含大麥或發(fā)芽大麥或其他谷物的啤酒麥芽汁的殘余物，從而改善所述殘余物的利用，例如，用于動(dòng)物飼料。本發(fā)明的多肽還可用于分離植物細(xì)胞材料的組分，特別是谷物組分如小麥組分。最令人感興趣的是將小麥分離為麩質(zhì)(gluten)和淀粉，即有很大商業(yè)利益的組分。該分離工藝可通過本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行，如作為水力旋流器或傾析器工藝進(jìn)行的所謂掛糊(batter)工藝(或濕磨工藝)。在該掛糊工藝中，起始材料是待進(jìn)行分離的植物材料如小麥的稀而可泵送的分散物。在小麥分離工藝中，通常從小麥粉和水制備所述分散物。本發(fā)明的多肽還可用于制備水果或蔬菜汁以增加產(chǎn)率(參見，例如美國(guó)專利號(hào)6,228,630)。本發(fā)明的多肽還可用作紡織品的酶法煮煉(scouring)系統(tǒng)(參見，例如美國(guó)專利號(hào)6,258,590)的組分。本發(fā)明的多肽還可與其他酶功能性(functionality)組合用于洗衣去污劑應(yīng)用(參見，例如美國(guó)專利號(hào)5,696,068)。信號(hào)肽本發(fā)明還涉及編碼信號(hào)肽的分離的多核苷酸，所述信號(hào)肽包含seqidno:2的氨基酸1至19，或由seqidno:2的氨基酸1至19組成。本發(fā)明還涉及包含編碼蛋白的基因的核酸構(gòu)建體，其中所述基因可操作地連接于編碼信號(hào)肽的多核苷酸其中所述信號(hào)肽包含seqidno:2的氨基酸1至19，或由seqidno:2的氨基酸1至19組成，其中所述基因?qū)幋a所述信號(hào)肽的多核苷酸是外源的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多核苷酸的核苷酸序列包含seqidno:1的核苷酸1至57，或者由seqidno:1的核苷酸1至57組成。本發(fā)明還涉及包含這種核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括：(a)在適于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)此種重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)對(duì)于宿主細(xì)胞可以是天然的或異源的。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”在本文的意思不是指特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，并且因此涵蓋肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”還涵蓋經(jīng)組合以形成編碼產(chǎn)物的兩種以上多肽。所述蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，其包含部分或全部多肽序列的組合，所述多肽序列從至少兩種不同的蛋白質(zhì)獲得，其中一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))對(duì)于宿主細(xì)胞可以是異源或天然的。蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白質(zhì)的天然存在的等位基因變異和工程改造的變異。優(yōu)選蛋白質(zhì)是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報(bào)告蛋白(reporter)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構(gòu)酶或連接酶。在一個(gè)更加優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。基因可以從任何原核、真核或其它來(lái)源獲得。通過以下實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例材料作為緩沖液和底物使用的化學(xué)品是至少試劑等級(jí)的商業(yè)產(chǎn)品。菌株嗜松青霉nn046877用作具有木聚糖酶活性的家族10多肽的來(lái)源。米曲霉菌株howb101(wo95/35385)用作供重組表達(dá)具有木聚糖酶活性的嗜松青霉nn046877家族10多肽的宿主。培養(yǎng)基pda平板組成為39克的馬鈴薯右旋糖瓊脂和去離子水加至1升。nncyp-pcs培養(yǎng)基組成為每升5.0g的nano3，3.0g的nh4cl，2.0g的mes，2.5g的檸檬酸，0.2g的cacl22h2o，1.0g的bactopeptone，5.0g的酵母提取物，0.2g的mgso47h2o，4.0g的k2hpo4，1.0ml的cove痕量元素溶液，2.5g的葡萄糖，25.0g的預(yù)處理的玉米秸稈(pcs)，和去離子水加至1升。cove痕量元素溶液組成為0.04g的na2b4o7·10h2o，0.4g的cuso4·5h2o，1.2g的feso4·7h2o，0.7g的mnso4·h2o，0.8g的na2moo2·2h2o，10g的znso4·7h2o，和去離子水加至1升。lb平板組成為10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，10g的氯化鈉，15g的瓊脂，和去離子水加至1升。soc培養(yǎng)基組成為2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mmnacl，2.5mmkcl，10mmmgcl2，和10mmmgso4；通過高壓滅菌來(lái)滅菌，然后添加過濾滅菌的葡萄糖至20mm。ypm培養(yǎng)基組成為1％酵母提取物，2％bacto蛋白胨，和2％麥芽糖?；九囵B(yǎng)基平板組成為6g的nano3，0.52的kcl，1.52g的kh2po4，1ml的cove痕量金屬溶液，20g的noble瓊脂，20ml的50％葡萄糖，2.5ml的20％mgso4·7h2o，20ml的生物素儲(chǔ)液，和去離子水加至1升。生物素儲(chǔ)液組成為每升0.2g的生物素。cove痕量金屬溶液組成為0.04g的na2b4o7·10h2o，0.4g的cuso4·5h2o，1.2g的feso4·7h2o，0.7g的mnso4·h2o，0.8g的na2moo2·h2o，10g的znso4·7h2o，和去離子水加至1升。實(shí)施例1：嗜松青霉菌株菌絲體的制備于2000年12月12日從中國(guó)云南收集到堆肥樣品。將嗜松青霉nn046877使用單孢子分離技術(shù)在45℃分離至pda平板上。將嗜松青霉菌株nn046877接種于pda平板上，并在黑暗中在37℃溫育4日。將幾個(gè)菌絲體-pda栓接種入含有100ml的nncyp-pcs培養(yǎng)基的500ml搖瓶。將瓶在37℃以160rpm振蕩溫育5日。在第4日和第5日收集菌絲體。將來(lái)自每日的菌絲體凍結(jié)于液氮中，并儲(chǔ)藏于-80℃冷凍箱直至使用。實(shí)施例2：嗜松青霉菌株rna分離將凍結(jié)的菌絲體轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的杵和研缽，并磨成細(xì)粉。通過用trizoltm試劑(invitrogencorporation,carlsbad,ca,usa)提取從每日粉末狀菌絲體制備總rna。使用mtraptotalkit(activemotif,carlsbad,ca,usa)分離多聚a富集的rna。實(shí)施例3：嗜松青霉菌株cdna文庫(kù)的構(gòu)建用smarttmcdna文庫(kù)constructionkit(clontechlaboratories,inc.,mountainview,ca,usa)合成來(lái)自每日的雙鏈cdna。將cdna用sfii切割，并將cdna通過使用44mmtris堿、44mm硼酸、0.5mmedta(tbe)緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行大小分級(jí)。從凝膠切出500bp或更大的cdna級(jí)分，并使用pcrdnaandgelbandpurificationkit(gehealthcare,unitedkingdom)根據(jù)生產(chǎn)商的指示純化。然后將來(lái)自第4日和第5日的等量cdna匯集以供文庫(kù)構(gòu)建。然后將匯集的cdna通過使用t4連接酶(newenglandbiolabs,inc.,beverly,ma,usa)依照生產(chǎn)商的指示連接入sfii切割的pmhas7(wo2009/037253)來(lái)進(jìn)行定向克隆。將連接混合物使用gene和pulsecontroller(bio-radlaboratories,inc.,hercules,ca,usa)依照生產(chǎn)商的指示以25μf，25mamp，1.8kv用1mm間隙的小杯電穿孔入大腸桿菌electromaxtmdh10btm細(xì)胞(invitrogencorp.,carlsbad,ca,usa)。將經(jīng)電穿孔的細(xì)胞鋪板于補(bǔ)充50mg每升卡那霉素的lb平板。從起始pmhas7載體連接的總共60,000個(gè)轉(zhuǎn)化體制備了cdna質(zhì)粒匯集物。質(zhì)粒dna直接從菌落的匯集物使用plasmidkit(qiageninc.,valencia,ca,usa)制備。實(shí)施例4：含有β-內(nèi)酰胺酶報(bào)道基因的siga4轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建從含有wo2001/77315中所述的質(zhì)粒的psiga2轉(zhuǎn)座子構(gòu)建含有命名為psiga4的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子以構(gòu)建psiga2信號(hào)捕獲轉(zhuǎn)座子的選擇背景減少的改善版本。所述psiga2轉(zhuǎn)座子含有轉(zhuǎn)座子自身上編碼的無(wú)信號(hào)β-內(nèi)酰胺酶構(gòu)建體。使用pcr構(gòu)建見于質(zhì)粒骨架的完整β-內(nèi)酰胺酶基因的缺失，所述pcr使用校正讀碼的pfuturbo聚合酶proofstarttm(qiagengmbhcorporation,hilden,germany)和下述5’磷酸化引物(tagcopenhagen,denmark)：siga2notu-p：5’-tcgcgatccgttttcgcatttatcgtgaaacgct-3’(seqidno:3)siga2notd-p：5’-ccgcaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaa-3’(seqidno:4)擴(kuò)增反應(yīng)物組成為1μl的psiga2(10ng/μl),5μl的10xproofstarttmbuffer(qiagengmbhcorporation,hilden,germany),2.5μl的dntp混合物(20mm)，0.5μl的siga2notu-p(10mm)，0.5μl的siga2notd-p(10mm)，10μl的q溶液(qiagengmbhcorporation,hilden,germany)和31.25μl的去離子水。使用dnaenginetmthermalcycler(mjresearchinc.,waltham,ma,usa)進(jìn)行擴(kuò)增，其程序?yàn)橐粋€(gè)循環(huán)在95℃進(jìn)行5分鐘；和20個(gè)循環(huán)，每循環(huán)在94℃進(jìn)行30秒，在62℃進(jìn)行30秒和在72℃進(jìn)行4分鐘。通過使用40mmtris堿-20mm乙酸鈉-1mmedta二鈉鹽(tae)緩沖液和0.1μg每ml的溴乙錠的0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離了3.9kb的pcr反應(yīng)產(chǎn)物。在eagleimagingsystem(stratagene,lajolla,ca,usa)的協(xié)助下在360nm處顯影dna條帶。從凝膠切出3.9kbdna條帶，并使用pcrdnaandgelbandpurificationkit依照生產(chǎn)商的指示進(jìn)行純化。將3.9kb片段用10單位的t4dna連接酶(newenglandbiolabs,inc.,beverly,ma,usa)，9μl的所述3.9kbpcr片段，和1μl的10x連接緩沖液(newenglandbiolabs,inc.,beverly,ma,usa)在16℃進(jìn)行自連接過夜。將連接物在65℃熱失活10分鐘，然后用dpni在37℃消化2小時(shí)。在溫育之后，使用pcrdnaandgelbandpurificationkit純化消化產(chǎn)物。然后將純化的材料依照生產(chǎn)商的指示轉(zhuǎn)化入大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞(invitrogencorp.,carlsbad,ca,usa)。將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于補(bǔ)充25μg每ml的氯霉素的lb平板上。從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒的小量制備物，并用bglii消化。選擇具有正確構(gòu)建體的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒命名為psiga4。質(zhì)粒psiga4含有側(cè)翼為bglii的轉(zhuǎn)座子siga2，其與wo2001/77315中公開的完全相同。將質(zhì)粒psiga4dna(0.3μg/μl)的60μl樣品用bglii消化，并通過使用tbe緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。將2kb的siga2轉(zhuǎn)座子dna條帶用200μl的eb緩沖液(qiagengmbhcorporation,hilden,germany)洗脫并使用pcrdnaandgelbandpurificationkit依照生產(chǎn)商的指示純化，并洗脫于200μl的eb緩沖液。將siga2用于轉(zhuǎn)座子協(xié)助的信號(hào)捕獲。實(shí)施例5：嗜松青霉菌株的轉(zhuǎn)座子協(xié)助的信號(hào)捕獲轉(zhuǎn)座子協(xié)助的信號(hào)捕獲的完整描述如wo2001/77315所述。用轉(zhuǎn)座子siga2和hypermutm轉(zhuǎn)座酶(epicentrebiotechnologies,madison,wi,usa)依照生產(chǎn)商的指示處理質(zhì)粒匯集物。對(duì)于嗜松青霉cdna文庫(kù)的體外轉(zhuǎn)座子標(biāo)記，將2μl的含有大約100ng的dna的siga2轉(zhuǎn)座子與1μl的含有1μg的dna的嗜松青霉cdna文庫(kù)的質(zhì)粒dna匯集物，1μl的hypermutm轉(zhuǎn)座酶，和2μl的10x緩沖液(epicentrebiotechnologies,madison,wi,usa)以20μl的總體積混合，并在30℃溫育3小時(shí)，接著添加2μl的終止緩沖液(epicentrebiotechnologies,madison,wi,usa)，并在75℃熱失活10分鐘。通過添加2μl的3m乙酸鈉ph5和55μl的96％乙醇來(lái)沉淀dna并在10,000xg，4℃離心30分鐘。將沉淀在70％乙醇中洗滌，在室溫風(fēng)干，并重懸于10μl的去離子水。將2μl體積的轉(zhuǎn)座子標(biāo)記的質(zhì)粒匯集物依照生產(chǎn)商的指示使用gene和pulsecontroller以25μf，25mamp，1.8kv用1mm間隙的小杯依照生產(chǎn)商的步驟電穿孔入50μl的大腸桿菌electromaxtmdh10btm細(xì)胞(invitrogencorp.,carlsbad,ca,usa)。將經(jīng)電穿孔的細(xì)胞在soc培養(yǎng)基中在37℃以225rpm振蕩1小時(shí)進(jìn)行溫育，然后鋪板于下述選擇性培養(yǎng)基：補(bǔ)充50μg每ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基；補(bǔ)充50μg每ml卡那霉素和15μg每ml的氯霉素的lb培養(yǎng)基；和補(bǔ)充50μg每ml卡那霉素，15μg每ml的氯霉素，和30μg每ml的氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基。通過將電穿孔物鋪板于補(bǔ)充卡那霉素、氯霉素和氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基，在30℃在3日之后觀察到大約每50μl200個(gè)菌落。將所有菌落復(fù)制鋪板于如上所述的lb卡那霉素、氯霉素和氨芐青霉素培養(yǎng)基。在該選擇條件下回收了五百個(gè)菌落。用如下所示轉(zhuǎn)座子正向和反向引物(引物a和b)，依照wo2001/77315(第28頁(yè))中公開的步驟，對(duì)來(lái)自每個(gè)菌落的dna進(jìn)行測(cè)序。引物a：5’-agcgtttgcggccgcgatcc-3’(seqidno:5)引物b：5’-ttattcggtcgaaaaggatcc-3’(seqidno:6)實(shí)施例6：序列匯編和調(diào)繪從sinogenomaxco.,ltd(beijing,china)獲得dna序列。對(duì)于每個(gè)質(zhì)粒裁剪引物a和引物b序列讀碼以去除載體和轉(zhuǎn)座子序列。將匯編的序列通過使用程序phredphrap(ewing等,1998,genomeresearch8:175-185；ewing和green,1998,genomeresearch8:186-194)分組為重疊群。然后使用程序blastx2.0a19mp-washu[14-jul-1998][buildlinux-x8618:51:4430-jul-1998](gish等,1993,nat.genet.3:266-72)將所有的重疊群與可從標(biāo)準(zhǔn)的公共dna和蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)(trembl，swall，pdb，ensemblpep，geneseqp)獲得的序列相比較。家族gh10木聚糖酶候選物通過分析blastx結(jié)果直接鑒定出。實(shí)施例7：嗜松青霉nn046877基因組dna的制備將嗜松青霉nn046877在pda瓊脂平板上在37℃生長(zhǎng)4-5日。將菌絲體直接從瓊脂平板收集入滅菌的研缽，并在液氮下凍結(jié)。將凍結(jié)的菌絲體通過杵和研缽磨成細(xì)粉，并使用plantminikit(qiageninc.,valencia,ca,usa)分離基因組dna。實(shí)施例8：從基因組dna克隆嗜松青霉木聚糖酶基因基于實(shí)施例6中所述獲得的嗜松青霉gh10木聚糖酶基因信息，設(shè)計(jì)了如下所示的寡核苷酸引物以從嗜松青霉nn046877的基因組dna擴(kuò)增gh10木聚糖酶基因。使用in-cfdry-downcloningkit(clontechlaboratories,inc.,mountainview,ca,usa)將片段直接克隆入表達(dá)載體ppfjo355，而無(wú)需進(jìn)行限制性消化和連接。有義引物：5’-acacaactggggatccaccatgactctagtaaaggctattcttttagc-3’(seqidno:7)反義引物：5’-gtcaccctctagatcttcacaaacattgggagtagtatgg-3’(seqidno:8)粗體字母代表編碼序列，而剩余序列與ppfjo355的插入位點(diǎn)同源。表達(dá)載體ppfjo355含有米曲霉taka-淀粉酶啟動(dòng)子，黑曲霉葡糖淀粉酶終止子元件，用于在大腸桿菌中選擇和繁殖的puc19來(lái)源的序列，和pyrg基因，其編碼構(gòu)巢曲霉乳清酸核苷脫羧酶以供選擇pyrg突變體曲霉屬菌株的轉(zhuǎn)化體。將上述引物各二十皮摩爾用于pcr反應(yīng)，所述反應(yīng)物組成為嗜松青霉nn046877基因組dna，10μl的5xgcbuffer(finnzymesoy,espoo,finland)，1.5μl的dmso，各2.5mm的datp、dttp、dgtp和dctp，和0.6單位的phusiontmhigh-fidelitydnapolymerase(finnzymesoy,espoo,finland)，最終體積為50μl。擴(kuò)增使用peltierthermalcycler(mjresearchinc.,southsanfrancisco,ca,usa)進(jìn)行，其程序?yàn)椋涸?8℃變性1分鐘；5個(gè)循環(huán)，每循環(huán)在98℃變性15秒，在56℃退火30秒，其中每循環(huán)增加1℃，并在72℃延伸75秒；25個(gè)循環(huán)，每循環(huán)在98℃進(jìn)行15秒，65℃進(jìn)行30秒和在72℃進(jìn)行75秒；和在72℃最終延伸10分鐘。加熱塊然后進(jìn)入4℃浸泡循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物通過使用tbe緩沖液的1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，其中從凝膠切出大約1.4kb產(chǎn)物條帶，并使用pcrdnaandgelbandpurificationkit(gehealthcare,buckinghamshire,uk)依照生產(chǎn)商的指示純化。將質(zhì)粒ppfjo355用bami和bglii消化，通過使用tbe緩沖液的1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用pcrdnaandgelbandpurificationkit依照生產(chǎn)商的指示進(jìn)行純化。使用in-cfdry-downpcrcloningkit將基因片段和消化的載體連接在一起，得到pppin3(圖1)，其中嗜松青霉gh10木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄處于米曲霉taka-α-淀粉酶啟動(dòng)子的調(diào)控之下。簡(jiǎn)言之，將30ng的用bami和bglii消化的ppfjo355和60ng的嗜松青霉gh10木聚糖酶基因純化的pcr產(chǎn)物添加至反應(yīng)小瓶，并通過添加去離子水重懸至10μl的終體積。將反應(yīng)在37℃溫育15分鐘，然后在50℃溫育15分鐘。使用三μl的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞(tiangenbiotechco.ltd.,beijing,china)。含有pppin3的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體通過菌落pcr檢測(cè)，并使用qiaprepspinminiprepkit(qiageninc.,valencia,ca,usa)制備質(zhì)粒dna。pppin3中的嗜松青霉gh10木聚糖酶基因插入物通過使用3730xldnaanalyzer(appliedbiosystemsinc,fostercity,ca,usa)的dna測(cè)序確認(rèn)。使用pgem-tvectorsystem(promegacorporation,madison,wi,usa)將相同的pcr片段克隆入載體pgem-t(promegacorporation,madison,wi,usa)以生成pgem-t-ppin3。pgem-t-ppin3中含有的嗜松青霉gh10木聚糖酶基因通過使用3730xldnaanalyzer的dna測(cè)序來(lái)確認(rèn)。將含有pgem-t-ppin3的大腸桿菌菌株059157t-ppin3(nn059157)于2009年9月7日保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh)(dsm),d-38124braunschweig,germany，并分配登錄號(hào)dsm22922。實(shí)施例9：編碼具有木聚糖酶活性的gh10多肽的嗜松青霉基因組序列的表征編碼具有木聚糖酶活性的gh10多肽的嗜松青霉基因組克隆的dna測(cè)序用appliedbiosystemsmodel3700automateddnasequencer使用版本3.1big-dyetm終止子化學(xué)(appliedbiosystems,inc.,fostercity,ca,usa)和dgtp化學(xué)(appliedbiosystems,inc.,fostercity,ca,usa)和引物步移策略進(jìn)行。就其品質(zhì)審視核苷酸序列數(shù)據(jù)，并將所有序列以phred/phrap軟件(universityofwashington,seattle,wa,usa)的協(xié)助相互比較。嗜松青霉gh10基因的核苷酸序列(seqidno:1)和推導(dǎo)的氨基酸序列(seqidno:2)示于表2a和2b。編碼序列為1442bp，包含終止密碼子，并由51bp(核苷酸199-249)，73bp(核苷酸383-455)和94bp(核苷酸570-663)的三個(gè)內(nèi)含子間隔。編碼的預(yù)測(cè)的蛋白為407個(gè)氨基酸?；虻木幋a序列(包括內(nèi)含子)的％g+c為47.99％g+c，而成熟多肽編碼序列為49.22％。使用signalp程序(nielsen等,1997,proteinengineering10:1-6)，預(yù)測(cè)了19個(gè)殘基的信號(hào)肽。預(yù)測(cè)的成熟蛋白含有388個(gè)氨基酸，具有41.5kda的預(yù)測(cè)的分子量和5.03的等電點(diǎn)。使用如emboss的needle程序中執(zhí)行的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)，以缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和eblosum62矩陣確定了氨基酸序列的比較性逐對(duì)全局比對(duì)。比對(duì)顯示編碼具有木聚糖酶活性的gh10多肽的嗜松青霉基因的推導(dǎo)的氨基酸序列分別與來(lái)自埃默森踝節(jié)菌(aau99346)和馬爾內(nèi)菲青霉(penicilliummarneffei)(b6qn64)的預(yù)測(cè)的gh10家族蛋白的推導(dǎo)的氨基酸序列具有76％和87％同一性(排除缺口)。實(shí)施例10：在米曲霉中表達(dá)嗜松青霉gh10木聚糖酶基因米曲霉howb101(wo95/35385實(shí)施例1)原生質(zhì)體根據(jù)christensen等,1988,bio/technology6:1419-1422的方法制備，并用3μg的pppin3轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化產(chǎn)生約50個(gè)轉(zhuǎn)化子。將十二個(gè)轉(zhuǎn)化體分離至單獨(dú)的基本培養(yǎng)基平板。將四個(gè)轉(zhuǎn)化體分別接種入24孔板中的3ml的ypm培養(yǎng)基，并在30℃以150rpm振蕩進(jìn)行溫育。在3日溫育之后，通過使用含2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)的4-12％bis-trisgel(invitrogencorporation,carlsbad,ca,usa)的sds-page依照生產(chǎn)商的指示分析來(lái)自每個(gè)培養(yǎng)物的20μl上清。將所得的凝膠用blue(expedeonltd.,babrahamcambridge,uk)染色。培養(yǎng)物的sds-page概貌顯示大多數(shù)轉(zhuǎn)化體具有大約55kda的主要條帶。表達(dá)菌株命名為米曲霉exp02765。將米曲霉exp02765的斜面用10ml的ypm洗滌，并接種入含有400ml的ypm培養(yǎng)基的2升燒瓶以生成用于表征該酶的培養(yǎng)液。在第3日收獲培養(yǎng)物，并使用0.45μmmembrane(millipore,bedford,ma,usa)過濾。實(shí)施例11：從米曲霉純化重組的嗜松青霉gh10木聚糖酶將1升體積的米曲霉菌株exp02765的過濾的培養(yǎng)液用硫酸銨(80％飽和)沉淀，并重新溶解于50ml的25mm乙酸鈉ph4.3，然后針對(duì)相同的緩沖液透析，并通過0.45mm過濾器過濾。將溶液施于在25mm乙酸鈉ph4.3中平衡的40mlqsepharosetmfastflow柱(gehealthcare,buckinghamshire,uk)。重組的gh10蛋白并不結(jié)合于柱。收集具有木聚糖酶活性的級(jí)分，并如實(shí)施例10中所述通過sds-page進(jìn)行衡量。匯集含有大約55kda的條帶的級(jí)分。將匯集的級(jí)分通過超濾濃縮。實(shí)施例12：在pcs水解中衡量嗜松青霉gh10木聚糖酶在u.s.departmentofenergynationalrenewableenergylaboratory(美國(guó)能源部國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室)(nrel)使用稀硫酸預(yù)處理玉米秸稈。使用下述條件進(jìn)行預(yù)處理：在190℃，25％w/w干固體，0.048g硫酸/g干生物質(zhì)進(jìn)行1分鐘左右。預(yù)處理的玉米秸稈(pcs)中的不溶于水的固體含有52％纖維素，3.6％半纖維素和29.8％木質(zhì)素。通過兩階段硫酸水解，接著通過使用nrelstandardanalyticalprocedure#002的高效液相色譜分析糖來(lái)測(cè)定纖維素和半纖維素。木質(zhì)素在用硫酸水解纖維素和半纖維素級(jí)分之后使用nrelstandardanalyticalprocedure#003以重量分析法測(cè)定。在酶水解之前，將pcs磨碎(multiutilitygrinder,innoconceptsinc.,ga,usa)并通過450um濾網(wǎng)(retschas200)篩濾。如實(shí)施例10和11所述表達(dá)并純化嗜松青霉gh10木聚糖酶。蛋白濃度通過使用8-16％sds-page凝膠(bio-radlaboratories,inc.,hercules,ca,usa)的sds-page和stain-freeimagingsystem(bio-radlaboratories,inc.,hercules,ca,usa)確定。嗜松青霉gh10木聚糖酶和里氏木霉same-mf268纖維素分解酶制備物(wo2008/151079)之間的協(xié)同效應(yīng)使用在50℃，ph5的1克經(jīng)磨碎篩濾、未洗滌的pcs(gs-pcs)水解測(cè)定法來(lái)確定。將嗜松青霉gh10木聚糖酶(0.6mg/g纖維素)添加至里氏木霉same-mf268纖維素分解酶制備物(3mg/g纖維素)，得到3.6mg蛋白/g纖維素的總加載量。gs-pcs的總不溶性固體加載量為50g/l(在含有1mm硫酸錳的50mm乙酸鈉ph5.0緩沖液中)?？偡磻?yīng)體積為96孔板中的1.0ml。測(cè)定重復(fù)運(yùn)行。在50℃的72小時(shí)溫育之后，移出上清，并通過0.45μm96孔濾板(millipore,bedford,ma,usa)過濾，在5mmh2so4中2倍稀釋，并通過hpx-87h柱層析(bio-radlaboratories,inc.,hercules,ca,usa)使用1100hplc(agilenttechnologies,santaclara,ca,usa)和折光率檢測(cè)來(lái)進(jìn)行分析。水解數(shù)據(jù)表示為轉(zhuǎn)化為葡萄糖的總纖維素的％。纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖的程度使用下述方程計(jì)算：轉(zhuǎn)化(％)＝rs(mg/ml)*100*162/(纖維素(mg/ml)*180)＝rs(mg/ml)*100/(纖維素(mg/ml)*1.111)在該方程中，rs是溶液中還原糖的濃度，以葡萄糖當(dāng)量(mg/ml)測(cè)量，而因子1.111反映了纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的重量增加。通過嗜松青霉gh10木聚糖酶(0.6mg/g纖維素)和里氏木霉same-mf268纖維素分解酶制備物(3mg/g纖維素)的pcs水解在72小時(shí)之后產(chǎn)生了65.8％的纖維素轉(zhuǎn)化率，而通過3.6mg/g纖維素的里氏木霉same-mf268纖維素分解酶制備物的pcs水解產(chǎn)生了61.7％的纖維素轉(zhuǎn)化率，表明補(bǔ)充的嗜松青霉gh10木聚糖酶與里氏木霉same-mf268纖維素分解酶制備物在50℃，ph5.0在pcs水解中具有協(xié)同效應(yīng)。實(shí)施例13：嗜松青霉gh10木聚糖酶的表征比活性：對(duì)樺木木聚糖(sigmachemicalco.,st.louis,mo,usa)測(cè)定嗜松青霉gh10木聚糖酶的比活性。在含有0.01％20的50mm乙酸鈉ph5.0中制備樺木木聚糖溶液(2g/l)。將十微升的嗜松青霉gh10木聚糖酶(以不同加載量)添加至190μl的樺木木聚糖溶液。包括了底物對(duì)照和酶對(duì)照。將反應(yīng)在50℃溫育30分鐘，接著以50μl的0.5mnaoh終止反應(yīng)。產(chǎn)生的還原糖使用如下所述調(diào)適為96孔微孔板格式的對(duì)羥基苯甲酸酰肼(phbah,sigma,st.louis,mo,usa)測(cè)定法來(lái)確定。簡(jiǎn)言之，將適當(dāng)稀釋的樣品的100μl等分試樣置于96孔錐底微孔板(conicalbottomedmicroplate)中。通過添加50μl的2％naoh中的1.5％(w/v)phbah至每個(gè)孔來(lái)起始反應(yīng)。將板不加覆蓋地在95℃加熱10分鐘。允許板冷卻至室溫(rt)并將50μl的去離子水添加至每個(gè)孔。將來(lái)自每個(gè)孔的100μl等分試樣轉(zhuǎn)移至平底的96孔板，并使用microplatereader(moleculardevices,sunnyvale,ca,usa)測(cè)量在410nm的吸光度。使用葡萄糖標(biāo)樣(用0.4％氫氧化鈉稀釋至0.1-0.0125mg/ml)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線以將獲得的a410nm值換算為葡萄糖當(dāng)量。以酶加載量對(duì)產(chǎn)生的還原糖進(jìn)行作圖，并使用線性范圍來(lái)計(jì)算嗜松青霉gh10木聚糖酶的比活性，表示為每mg酶每分鐘產(chǎn)生的葡萄糖當(dāng)量微摩爾數(shù)，或iu/mg。嗜松青霉gh10木聚糖酶對(duì)樺木木聚糖的比活性測(cè)量為113.5iu/mg酶。熱穩(wěn)定性：將嗜松青霉gh10木聚糖酶在含有0.01％20的50mm乙酸鈉ph5中稀釋至1g每升，然后在60℃溫育3小時(shí)或24小時(shí)。然后將同樣樣品亦儲(chǔ)藏于4℃以充當(dāng)對(duì)照。在溫育之后，樣品對(duì)樺木木聚糖的活性使用如上所述相同的測(cè)定方案就比活性進(jìn)行測(cè)量，只是使用一種給出<5％轉(zhuǎn)化率的酶加載量。將樣品在4℃的活性標(biāo)準(zhǔn)化為100％，并將在其他溫育條件的樣品的活性與4℃活性相比較。嗜松青霉gh10木聚糖酶的熱穩(wěn)定性如下所示，表明該酶在60℃溫育3小時(shí)之后保留其活性的100％，而在60℃溫育24小時(shí)之后保留其活性的83％。ph概貌：嗜松青霉gh10木聚糖酶的ph活性使用如上所述的相同測(cè)定方案就比活性進(jìn)行確定，只是將酶在5個(gè)不同的ph：4，5，6，7和8溫育，并使用一種給出少于5％轉(zhuǎn)化率的酶加載量。使用brittonrobinson緩沖液作為緩沖系統(tǒng)。為了制備brittonrobinson緩沖液，制備每升去離子水含有0.1摩爾硼酸，0.1摩爾乙酸和0.1摩爾磷酸的100mm儲(chǔ)液。然后使用5mnaoh將100mm儲(chǔ)液滴定至4，5，6，7或8的ph，然后稀釋至40mm。將樺木木聚糖以2g每升的濃度添加至每個(gè)緩沖液，然后在50℃測(cè)量活性。將最高的活性標(biāo)準(zhǔn)化至100％，并將其他ph的活性與最高活性相比較，并表示為％活性。嗜松青霉gh10木聚糖酶的ph活性概貌如下所示：ph值活性4.0100％5.078％6.062％7.019％8.00％生物材料的保藏下述的生物材料已經(jīng)依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh,dsm),mascheroderweg1b,d-38124braunschweig,germany，并給予下述的登錄號(hào)：保藏物登錄號(hào)保藏日期大腸桿菌(nn059157)dsm229222009年9月7日所述菌株于下述條件下保藏：確保在本專利申請(qǐng)未決期間，依據(jù)該外國(guó)專利法律的授權(quán)的人能夠獲得所述培養(yǎng)物。所述保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請(qǐng)的副本，或其后續(xù)文本的國(guó)家，依據(jù)該外國(guó)專利法律可以獲得所述保藏物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的獲得并不構(gòu)成對(duì)實(shí)施本發(fā)明的許可，實(shí)施本發(fā)明是對(duì)政府行為所授予的專利權(quán)的侵犯。通過下述編號(hào)段落描述本發(fā)明：[1]具有木聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組：(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與seqidno:2的成熟多肽具有至少90％同一性；(b)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與以下雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于seqidno:1的成熟多肽編碼序列的cdna序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少90％同一性的核苷酸序列；和(d)seqidno:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[2]段1的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與seqidno:2的氨基酸序列具有至少90％同一性。[3]段2的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與seqidno:2的氨基酸序列具有至少95％同一性。[4]段3的多肽，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與seqidno:2的氨基酸序列具有至少97％同一性。[5]段1的多肽，其包含seqidno:2的氨基酸序列或其具有木聚糖酶活性的片段或由seqidno:2的氨基酸序列或其具有木聚糖酶活性的片段組成。[6]段5的多肽，其包含seqidno:2的氨基酸序列或由seqidno:2的氨基酸序列組成。[7]段5的多肽，其包含seqidno:2的成熟多肽或由seqidno:2的成熟多肽組成。[8]段1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與下述雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于seqidno:1的成熟多肽編碼序列的cdna序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[9]段1的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少90％同一性。[10]段9的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少95％同一性。[11]段10的多肽，其由包含核苷酸序列的多核苷酸編碼，所述核苷酸序列與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少97％同一性。[12]段1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含seqidno:1的核苷酸序列或其編碼具有木聚糖酶活性的片段的亞序列或由seqidno:1的核苷酸序列或其編碼具有木聚糖酶活性的片段的亞序列組成。[13]段12的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含seqidno:1的核苷酸序列或由seqidno:1的核苷酸序列組成。[14]段12的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含seqidno:1的成熟多肽編碼序列或由seqidno:1的成熟多肽編碼序列組成。[15]段1的多肽，其中所述多肽是seqidno:2的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入的變體。[16]段1的多肽，所述多肽由質(zhì)粒pgem-t-ppin3中含有的多核苷酸編碼，所述質(zhì)粒pgem-t-ppin3包含在大腸桿菌dsm22922中。[17]段1-16中任一項(xiàng)的多肽，其中成熟多肽是seqidno:2的氨基酸20至407。[18]段1-17中任一項(xiàng)的多肽，其中成熟多肽編碼序列是seqidno:1的核苷酸58至1439。[19]分離的多核苷酸，其包含編碼段1-18中任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。[20]段19的分離的多核苷酸，其在seqidno:1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)突變，其中所述突變核苷酸序列編碼seqidno:2的成熟多肽。[21]核酸構(gòu)建體，其包含段19或20的多核苷酸，所述多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列指導(dǎo)多肽在表達(dá)宿主中產(chǎn)生。[22]重組表達(dá)載體，其包含段21的核酸構(gòu)建體。[23]重組宿主細(xì)胞，其包含段21的核酸構(gòu)建體。[24]用于產(chǎn)生段1-18中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。[25]用于產(chǎn)生段1-18中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。[26]用于產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，所述方法包括破壞或缺失編碼段1-18中任一項(xiàng)的多肽或其一部分的多核苷酸，其導(dǎo)致突變體與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽。[27]由段26的方法產(chǎn)生的突變細(xì)胞。[28]段27的突變細(xì)胞，其進(jìn)一步包含編碼天然或異源蛋白的基因。[29]產(chǎn)生蛋白的方法，其包括：(a)在有助于所述蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)段28的突變細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白。[30]段19或20的分離的多核苷酸，其通過下述獲得：(a)在非常高嚴(yán)格條件下將dna群體與下述雜交：(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于seqidno:1的成熟多肽編碼序列的cdna序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有木聚糖酶活性的多肽。[31]段30的分離的多核苷酸，其中所述成熟多肽編碼序列是seqidno:1的核苷酸58至1439。[32]用于產(chǎn)生包含突變核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述突變核苷酸序列編碼具有木聚糖酶活性的多肽，所述方法包括：(a)向seqidno:1的成熟多肽編碼序列中引入至少一個(gè)突變，其中突變核苷酸序列編碼包含seqidno:2的成熟多肽或者由seqidno:2的成熟多肽組成的多肽；和(b)回收所述包含突變核苷酸序列的多核苷酸。[33]由段32的方法產(chǎn)生的突變多核苷酸。[34]產(chǎn)生多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含段33的編碼所述多肽的突變多核苷酸；和(b)回收所述多肽。[35]產(chǎn)生段1-18中任一項(xiàng)的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。[36]轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其用編碼段1-18中任一項(xiàng)的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。[37]雙鏈抑制rna(dsrna)分子，其包含段19或20的多核苷酸的亞序列，其中dsrna任選地為sirna或mirna分子。[38]段37的雙鏈抑制rna(dsrna)分子，其為長(zhǎng)約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更長(zhǎng)的雙鏈體核苷酸。[39]用于抑制具有木聚糖酶活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對(duì)細(xì)胞施用雙鏈rna(dsrna)分子，或者在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈rna(dsrna)分子，其中所述dsrna包括段19或20的多核苷酸的亞序列。[40]段39的方法，其中dsrna為長(zhǎng)約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更長(zhǎng)的雙鏈體核苷酸。[41]分離的多核苷酸，其編碼信號(hào)肽，所述信號(hào)肽包含seqidno:2的氨基酸1至19或由seqidno:2的氨基酸1至19組成。[42]核酸構(gòu)建體，其包含編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因可操作地連接于段41的多核苷酸，其中所述基因?qū)τ诰幋a所述信號(hào)肽的多核苷酸是外源的。[43]重組表達(dá)載體，其包含段42的核酸構(gòu)建體。[44]重組宿主細(xì)胞，其包含段42的核酸構(gòu)建體。[45]用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括：(a)在有助于所述蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)段44的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。[46]組合物，其包含段1-18中任一項(xiàng)的多肽。[47]降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，其包括：在段1-18中任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽存在下用酶組合物處理所述纖維素材料。[48]段47的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)過預(yù)處理。[49]段47或48的方法，其中酶組合物包含選自下組的一種或多種纖維素分解酶：內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[50]段47-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自下組的酶：半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或過氧化物酶。[51]段47-50中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括回收已降解的纖維素材料。[52]段51的方法，其中已降解的纖維素材料是糖。[53]段52的方法，其中所述糖選自下組：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖，和阿拉伯糖。[54]產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其包括：(a)在段1-18中任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽存在下，用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從所述發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。[55]段54的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。[56]段54或55的方法，其中所述酶組合物包含選自下組的一種或多種纖維素分解酶：內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[57]段54-56中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含選自下組的一種或多種酶：半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或過氧化物酶。[58]段54-57中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)和(b)在同步糖化和發(fā)酵中同時(shí)進(jìn)行。[59]段54-58中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。[60]發(fā)酵纖維素材料的方法，其包括：用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中所述纖維素材料是在段1-18中任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下用酶組合物糖化的。[61]段60的方法，其中所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。[62]段61的方法，其進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[63]段60-62中任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料在糖化前經(jīng)過預(yù)處理。[64]段60-63中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含選自下組的一種或多種纖維素分解酶：內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[65]段60-64中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含選自下組的一種或多種酶：半纖維素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶或過氧化物酶。[66]段60-65中任一項(xiàng)的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸，或氣體。[67]一種降解或轉(zhuǎn)化含木聚糖材料的方法，包括在段1-18任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下用酶組合物處理半纖維素材料。[68]段67的方法，其中所述含木聚糖材料經(jīng)預(yù)處理。[69]段67或68的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種選自下組的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合。[70]段67-69中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自下組的酶：內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[71]段67-70中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括回收所述經(jīng)降解的半纖維素材料。[72]一種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括：(a)在段1-18中任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下用酶組合物糖化含木聚糖材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的含木聚糖材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(c)從發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。[73]段72的方法，其中所述含木聚糖材料經(jīng)預(yù)處理。[74]段72或73的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種選自下組的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合。[75]段72-74中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自下組的酶：內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[76]段72-75中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)和(b)在同步糖化和發(fā)酵中同時(shí)進(jìn)行。[77]段72-76中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。[78]一種發(fā)酵含木聚糖材料的方法，包括用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵含木聚糖材料，其中所述半纖維素材料是在段1-18中任一項(xiàng)的具有木聚糖酶活性的多肽存在下用酶組合物糖化的。[79]段78的方法，其中所述含木聚糖材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。[80]段79的方法，進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[81]段78-80中任一項(xiàng)的方法，其中所述含木聚糖材料在糖化之前經(jīng)預(yù)處理。[82]段78-81中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種選自下組的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合。[83]段78-82中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含一種或多種選自下組的酶：內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[84]段78-83中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。本文描述和要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于本文公開的具體方面的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些方面旨在作為本發(fā)明幾個(gè)方面的說(shuō)明。旨在將任何等同的方面包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，從前面的說(shuō)明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。這些修改也旨在落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開為準(zhǔn)。序列表<110>諾維信股份有限公司(novozymes,inc.)諾維信公司(novozymesa/s)tang,lanliu,yeduan,junxinding,hanshu<120>具有木聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸<130>11668-wo-pcd<150>us61/246,887<151>2009-09-29<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>1442<212>dna<213>嗜松青霉(penicilliumpinophilum)<400>1atgactctagtaaaggctattcttttagcgcttgctgtgggccacgttgcccaggcccaa60ttgaacacggccgcaaaagcagctggtctattgtactttggtactgcggttgacaatcca120gacttgagcgactccaaatatattgcaaaccttgagactgcggatttcggtcagatcacg180ccagcaaatgcaatgaaagtcagtggccaatcactactgtatacaaccagctaagtgatg240acaatttagtggcaacccaccgagccgtctcaaggctcttatactttcactcagggtgac300cagattgcgagcctggccaagtctaataatgactacttgagatgccacaatctggtctgg360tacaaccagttgccatcatacggtaagcaagcatacgacctccatgaattgtcatccaac420atccacgatagcaagctgatacggtatctgtctagttacttcgggttcatggacaaacgc480aacccttattgctgccttgaaggagcatatcaatggagttgtcacgcattacaagggaca540atgctacgcgtgggatgttgtaaacgaaggtatgcgatattatatacaggccctttctct600gcatccttacatcttttttatctccattctacgtaatcgtgtcgagctaagtgaagtatc660tagccttgaacgaagacggcacctatcgtcaaaatgttttctaccaatatataggcgagg720catacattccaattgcgtttgctgccgctgcagccgcggaccctaatgccaagttgtact780acaacgactacaacatcgaatacgctgggtcaaaggcaactggtgctcagcgcattgtaa840aattaattcaagctgctggtggtcgtatcgatggcgtgggtcttcagtctcacttcattg900tgggacaaacccctagtcttgctactcagaaagcaaacatggctgcttttactgctctcg960gtgttgatgttgccattactgagcttgacattcgtatgactctcccggataccagcgctc1020ttcaaactcagcagtccaccgactaccagaccaccactactgcctgcgtccagactaaag1080gctgtgttggtatcacgctatgggattacacagacaagtactcatgggttcccggtacct1140tctctggccagggtgatgcttgtccatgggactcaaattacaacaagaagccggcatact1200atggtatccttgctggcttacaatctggcactggttcttcatcgtcaacttctagcacca1260ccctaacaaccaccacaacacccactaccgcttcaagtactacgtcaacgactagcacaa1320gcgctacctcaggtgctgcacactggggacaatgcggaggcattggctggtctggtccta1380ccatttgtgtttcgccctacacttgtcaagtgttgaacccatactactcccaatgtttgt1440ga1442<210>2<211>407<212>prt<213>嗜松青霉(penicilliumpinophilum)<400>2metthrleuvallysalaileleuleualaleualavalglyhisval151015alaglnalaglnleuasnthralaalalysalaalaglyleuleutyr202530pheglythralavalaspasnproaspleuseraspserlystyrile354045alaasnleugluthralaasppheglyglnilethrproalaasnala505560metlystrpglnprothrgluproserglnglysertyrthrphethr65707580glnglyaspglnilealaserleualalysserasnasnasptyrleu859095argcyshisasnleuvaltrptyrasnglnleuprosertyrvalthr100105110serglysertrpthrasnalathrleuilealaalaleulysgluhis115120125ileasnglyvalvalthrhistyrlysglyglncystyralatrpasp130135140valvalasnglualaleuasngluaspglythrtyrargglnasnval145150155160phetyrglntyrileglyglualatyrileproilealaphealaala165170175alaalaalaalaaspproasnalalysleutyrtyrasnasptyrasn180185190ileglutyralaglyserlysalathrglyalaglnargilevallys195200205leuileglnalaalaglyglyargileaspglyvalglyleuglnser210215220hispheilevalglyglnthrproserleualathrglnlysalaasn225230235240metalaalaphethralaleuglyvalaspvalalailethrgluleu245250255aspileargmetthrleuproaspthrseralaleuglnthrglngln260265270serthrasptyrglnthrthrthrthralacysvalglnthrlysgly275280285cysvalglyilethrleutrpasptyrthrasplystyrsertrpval290295300proglythrpheserglyglnglyaspalacysprotrpaspserasn305310315320tyrasnlyslysproalatyrtyrglyileleualaglyleuglnser325330335glythrglyserserserserthrserserthrthrleuthrthrthr340345350thrthrprothrthralaserserthrthrserthrthrserthrser355360365alathrserglyalaalahistrpglyglncysglyglyileglytrp370375380serglyprothrilecysvalserprotyrthrcysglnvalleuasn385390395400protyrtyrserglncysleu405<210>3<211>34<212>dna<213>嗜松青霉(penicilliumpinophilum)<400>3tcgcgatccgttttcgcatttatcgtgaaacgct34<210>4<211>33<212>dna<213>嗜松青霉(penicilliumpinophilum)<400>4ccgcaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaa33<210>5<211>20<212>dna<213>嗜松青霉(penicilliumpinophilum)<400>5agcgtttgcggccgcgatcc20<210>6<211>21<212>dna<213>嗜松青霉(penicilliumpinophilum)<400>6ttattcggtcgaaaaggatcc21<210>7<211>48<212>dna<213>嗜松青霉(penicilliumpinophilum)<400>7acacaactggggatccaccatgactctagtaaaggctattcttttagc48<210>8<211>40<212>dna<213>嗜松青霉(penicilliumpinophilum)<400>8gtcaccctctagatcttcacaaacattgggagtagtatgg40當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12