本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段檢測(cè)微生物耐藥基因的方法，具體為一種用于檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腸球菌是一種重要的機(jī)會(huì)致病菌，在自然界中廣泛分布，常棲居于人和動(dòng)物的腸道中，腸球菌可導(dǎo)致人和動(dòng)物多個(gè)臟器的感染，包括尿路感染、皮膚軟組織感染、盆腔感染、腹腔感染、傷口感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎和腦膜炎。腸球菌由于其細(xì)胞壁堅(jiān)厚，對(duì)許多抗生素表現(xiàn)為固有耐藥，如對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素、氨基糖苷、氯林可霉素、氯化喹啉酮和甲氧芐氨嘧啶磺胺。由于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和突變株的發(fā)生，腸球菌易被誘導(dǎo)產(chǎn)生新的耐藥性，對(duì)許多抗生素可產(chǎn)生獲得性耐藥，如對(duì)高水平的β-內(nèi)酰胺、氨基糖苷、糖肽類、四環(huán)素、紅霉素、氟化喹啉酮、利福平和氯霉素容易產(chǎn)生獲得性耐藥。近30年來，由于畜牧業(yè)將抗菌藥物作為抗菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加在飼料中，以增加飼料的利用率和加快動(dòng)物生長(zhǎng)，動(dòng)物體內(nèi)的腸球菌在抗菌藥物的選擇性壓力作用下產(chǎn)生了各種耐藥菌，甚至出現(xiàn)了多重耐藥菌株。腸球菌耐藥菌株的增多給臨床治療帶來了較大困難。據(jù)美國(guó)波士頓哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院在2004年的報(bào)道，院內(nèi)獲得性糞腸球菌是手術(shù)后感染的主要原因，其每年可浪費(fèi)數(shù)十億美元的醫(yī)療費(fèi)用。為查明動(dòng)物源性糞腸球菌的耐藥現(xiàn)狀，以阻斷耐藥基因在不同菌株間的傳播，以從動(dòng)物源性食品的角度去控制耐藥性的傳播，現(xiàn)有技術(shù)中采用藥敏紙片法、濃度稀釋法和vitek-ams全自動(dòng)藥敏法，檢測(cè)了臨床分離的不同動(dòng)物源糞腸球菌對(duì)多種抗菌藥物的耐藥表型；并通過采用pcr檢測(cè)不同耐藥基因與耐藥表型之間的關(guān)系。但是上述現(xiàn)有技術(shù)從耐藥表型著手，再對(duì)其是否攜帶耐藥基因進(jìn)行分析，該方法的使用范圍具有局限性，不適合廣泛檢測(cè)病原菌的耐藥基因。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種能夠準(zhǔn)確鑒定菌株耐藥基因，且適用于推廣應(yīng)用，對(duì)于科學(xué)制定抗菌感染的防治方案及細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)提供必要理論依據(jù)，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種用于檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個(gè)堿基t。表1分子標(biāo)記序列名稱序列(5，-3，)seqidno.p1-fnh2-t(10)gtgtccagaactttaccgaa1p1-rgctttgtatctccaagaacac2p2-fnh2-t(10)aactatcattaatcactagtgc3p2-rttcttctggtaccttaagtgg4p3-fnh2-t(10)gccgatgtggattgcgaaaa5p3-rgcttgatccccagtaagtca6所述分子標(biāo)記在制備檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。優(yōu)選的，所述試劑盒檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的糞腸球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個(gè)菌落，向無(wú)菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋150～300倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標(biāo)記可應(yīng)用于不同動(dòng)物源性的糞腸球菌慶大霉素耐藥基因分析；(2)本發(fā)明所述分子標(biāo)記對(duì)于科學(xué)制定抗菌感染的防治方案及細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)提供必要理論依據(jù)；(3)本發(fā)明所述分子標(biāo)記對(duì)有效的預(yù)防與控制糞腸球菌耐藥基因在不同細(xì)菌之間的水平傳播以及食源性細(xì)菌耐藥基因的向人散播有著重要意義。附圖說明圖1是實(shí)施例1～3檢測(cè)結(jié)果圖；其中，1為分子量為1500bp的maker；3為實(shí)施例1pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；4為實(shí)施例2pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；5為實(shí)施例3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種用于檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個(gè)堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的糞腸球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個(gè)菌落，向無(wú)菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋150倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。實(shí)施例2一種用于檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個(gè)堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的糞腸球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個(gè)菌落，向無(wú)菌ep管中加入40μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋250倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。實(shí)施例3一種用于檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5，端進(jìn)行氨基化修飾并附加10個(gè)堿基t。所述分子標(biāo)記在制備檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的糞腸球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個(gè)菌落，向無(wú)菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋300倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。sequencelisting<110>蘇州喬納森新材料科技有限公司<120>一種用于檢測(cè)糞腸球菌慶大霉素耐藥基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gtgtccagaactttaccgaa20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2gctttgtatctccaagaacac21<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3aactatcattaatcactagtgc22<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4ttcttctggtaccttaagtgg21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gccgatgtggattgcgaaaa20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gcttgatccccagtaagtca20當(dāng)前第1頁(yè)12