本發(fā)明涉及基因工程技術領域，特別是涉及一種大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3啟動子、核酸構建體、細胞及其制備方法和用途。

背景技術：

干擾素調(diào)節(jié)因子(interferonregulatoryfactor,irf)家族是一類重要的轉錄因子，具有多種生物學作用，包括對機體免疫應答、細胞凋亡等信號轉導通路的調(diào)節(jié)等(taniquchit,oqasawarak,takaokaa,etal.,irffamilyoftranscriptionfactorsasregulatorsofhostdefense[j].annurevimmunol,2001；19:623–55)。irf3屬于干擾素調(diào)節(jié)因子家族成員，其蛋白分子二級結構由氨基端的dna結合結構域(dnabindingdomain,dbd)和羧基端的irf相關結構域(irfassociateddomain,iad)構成(lohoffm,maktw,rolesofinterferon-regulatoryfactorsint-helper-celldifferentiation[j].natrevimmunol,2005；5:125–35)。哺乳動物中的研究表明，當細胞受病毒侵襲時，細胞可通過模式識別受體如toll樣受體(toll-likereceptors,tlrs)中的tlr3、rig樣受體(rig-i-likereceptors,rlrs)中的rig-i/mda5等識別病毒的rna結構，并通過其介導的細胞信號通路，誘導irf3發(fā)生磷酸化并活化，活化的irf3分子可以自身形成同源二聚體復合物，或與irf7形成異源二聚體復合物，并進入細胞核，結合到i型干擾素如ifn-β或者其他干擾素調(diào)節(jié)基因如isg54(interferonstimulatedgene54)基因啟動子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因的表達，從而在受病毒感染的宿主細胞以及相鄰細胞中誘導抗病毒狀態(tài)的形成，在宿主的抗病毒免疫反應中發(fā)揮重要作用(matsumiyatandstafforinidm,functionandregulationofretinoicacid-induciblegene-i[j].critrevimmunol,2010；30:489–513)。鑒于干擾素調(diào)節(jié)因子irf3功能的重要性，研究其基因的表達調(diào)控機制對于揭示宿主的抗病免疫反應及細胞信號轉導通路具有重要意義。哺乳動物中的研究中，已有通過構建干擾素調(diào)節(jié)因子irf3啟動子的熒光素酶報告系統(tǒng)，研究目標基因的功能及其介導的細胞信號轉導通路的相關報道(sabbaha,changth,harnackr,etal.,activationofinnateimmuneantiviralresponsesbynod2[j].natimmunol,2009；10:1073–80)。

目前，干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因已從多種硬骨魚類中得到克隆，如斑馬魚(daniorerio)、大黃魚(larimichthyscrocea)、鯽魚(carassiusauratus)、鯉魚(cyprinuscarpio)、草魚(ctenopharyngodonidella)、大西洋鮭(salmosalar)、虹鱒(oncorhynchusmykiss)、羅非魚(oreochromisniloticus)、石斑魚(epinepheluscoioides)、歐洲鰻鱺(anguillaanguilla)等。一些魚類干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因在不同組織中的表達水平以及在病原或病原相關類似物刺激下的表達調(diào)控已較明確，然而，目前對魚類干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因的表達調(diào)控機制，尤其是有關干擾素調(diào)節(jié)因子irf3所涉及的細胞信號轉導通路調(diào)控網(wǎng)絡的相關研究依然較匱乏。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3啟動子。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3啟動子，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno.1所示，或者為與seqidno.1互補的核苷酸序列。

本發(fā)明提供一種核酸構建體，包含所述的irf3啟動子，與irf3啟動子可操作連接的基因序列，其中所述irf3啟動子與所述基因序列來源相同或者不同。

本發(fā)明提供一種載體，其特征在于：所述載體含有所述的irf3啟動子或權利要求2所述的核酸構建體。

進一步，所述載體為所述的irf3啟動子或所述的核酸構建體與真核表達載體經(jīng)重組得到的重組載體；優(yōu)選的，真核表達載體為pgl4.17質(zhì)粒。

本發(fā)明提供一種重組細胞，其特征在于：所述細胞含有所述的irf3啟動子或所述的核酸構建體或所述的載體，所述重組細胞為魚類細胞或哺乳動物細胞；優(yōu)選的，魚類細胞為epc細胞。

本發(fā)明提供一組引物對，所述引物對用于擴增得到所述的irf3啟動子，其特征在于：所述引物對的兩條引物為seqidno：4和seqidno：5所示的序列；優(yōu)選的，所述引物對的兩條引物在seqidno：4和seqidno：5所示序列的5’端還分別連接有限制性酶切位點和/或保護堿基；優(yōu)選的，所述引物對的兩條引物分別為seqidno：2和seqidno：3所示的序列。

本發(fā)明提供一種制備所述的irf3啟動子的方法，包括：以大黃魚基因組dna為模板，使用一對擴增引物進行擴增，所述擴增引物根據(jù)seqidno：1在大黃魚基因組dna中的序列分別針對首尾進行設計。

進一步，所述擴增引物為所述的引物對。

本發(fā)明提供一種調(diào)控魚類或哺乳動物中高效表達外源基因的方法，所述方法包括，將所述的啟動子或所述的核酸構建體或所述的載體或所述的重組細胞導入魚類或哺乳動物；優(yōu)選的，所述魚類為大黃魚。

本發(fā)明還提供所述的啟動子、所述的核酸構建體、或者所述的載體、或所述的重組細胞、或含有所述啟動子或所述的核酸構建體或所述的載體或所述的重組細胞的魚類或哺乳動物在調(diào)控目的基因表達或轉基因魚中的用途；優(yōu)選的，所述魚類為大黃魚。

本發(fā)明的申請人以大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3的基因序列(yaocl,huangxn,fanzj,etal.,cloningandexpressionanalysisofinterferonregulatoryfactor(irf)3and7inlargeyellowcroaker,larimichthyscrocea[j].fishshellfishimmunol,2012；32:869–78)為基礎設計引物克隆了一種大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子區(qū)序列，構建了該啟動子序列的熒光素酶報告基因系統(tǒng)，并經(jīng)過熒光素酶分析實驗證實了該大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子具有較強的啟動子活性。該大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子的克隆及其熒光素酶報告基因系統(tǒng)的成功構建，在理論上將為研究大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因的表達調(diào)控機制及細胞信號轉導調(diào)控網(wǎng)絡提供良好的實驗系統(tǒng)，在應用方面為利用該啟動子構建表達載體高效表達外源基因、轉基因魚的培育以及免疫增強劑或抗病藥物的篩選創(chuàng)造了條件，具有重要的理論和實際意義。

本發(fā)明所述的一種大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子序列為：

tgtcgtggttccaacttctcaaaggtttgctttgctgtcttttcttgtaattattttaataaactgaatttattgtatttttagtagttttgagctttggttggacaaaacaagcatgtgatgtcactttggtaactgagatgtcacgtctcgagattttttacaaacattgattacacaatcgattaaattaaaagaaaaataatccttaatttattaaggattcttttttaatttattattatttaaaataataataataaaatgagctcaacctaatctacttgtactagtaaaatcctgcttttaaatgaatgcatgaataataattttaataataatttaaataacttttttaaactttaggtacatttcatggttatacttgagcttcaggggttgcatcatgtcaacaaacgtcataaatataagtgtgtgtgtgaagtgtgcgcatgcgcatgcgcgtgtttgaccccacctagcgggcccgggctgggatgaaacgtgatgacgtcacatttgaaaaacgaaactgagtcctcggagtttcccgagaaaaccgaaaacccctccgtgagcgtgtcagacagctctgtgacagggagccaccgtgctggtatttaaaagcatgagcagctgagattgaatgacactttgtcacgaagcttcaggaggaacaaacgagccattatctccgactttctggccctgcacctgaactcaacactcacctacaccaactggaagctcgtgactgcaggtaggagagtttgcaatgctgtgaaatatgattaataatgtattcatttatagcacatctgcagactgagtaacgaaatataccttgtgtactatgtatgaaatttcacacttgagttgttgtactcgagtatttccacattacgtaactttatagcctgtttcacttctattttaagttacaataaaaaaatacaaattgaatctgttattgtacactaatattcatatctgacacctgaatgaataaaatgcatgaatatgtacttttacctttcatgcttaaatacatgaactgtaacagttacagtgtttttaagttttgttttactcatatttagtatttttggaattgaaggctgaaccaaacctggcctcatatttgcctgcttcctctttttggttattcagaaattgtaaatataagttaacttccagcagctgcatcatagcaatgcacacatcaggttgttgatgctcagatgtgtgtacctattcctgattcctgtgtaagtgagtccttgccttgacatattttgccaataaatctgatttagtagtagtgagaaatgtcatccctcacttgcatgaggatcttttaaaaatagattttctcattttaaattaatatcaaacatgcaaaagtgaacttacttttttttttactaattccaggcaggacgtgatgattacatttctttctgcatgtatctggttgtaaagtgactaaatagtgccatctacagggcctgaacattctaatcattaatataaacctataaatacatatgaataattgtggtgattaaacattcagcctggctcagcttgttttatttacataaagtgaatcatcaacaattatttctgtttcactgttggattcagggcaaactgctctggatactgagagctacaagacaagaaatatatatatatatttttaatcatagatgatctgacaccgttgatgtgacttttttttttttttttgctcctgcaggaatgtctcattctaaacctctgctcatcccctggcttcgggcccacattgacagcaccaggtatcctggtgtccaatggacaaacctggaacgaaccgagttctccgtcccgtggaaacaseqidno:1。

本發(fā)明所述的一種利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3啟動子活性的分析方法，包括以下步驟：

1)采用pcr方法從大黃魚基因組中擴增出大黃魚irf3啟動子區(qū)序列，將擴增的pcr產(chǎn)物連接到takara公司pmd19-t載體并測序鑒定；

2)將大黃魚irf3基因啟動子區(qū)序列插入到promega公司熒光素酶報告基因載體pgl4.17中，使螢火蟲熒光素酶基因位于該啟動子的控制之下，構建得到重組載體pgl4-irf3-pro并測序鑒定；

3)采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析啟動子活性：將經(jīng)過測序鑒定的pgl4-irf3-pro重組載體和海腎熒光素酶對照報告基因載體prl-tk共轉染epc細胞系，轉染48小時后收集細胞，并通過promega公司的雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的酶活性值，計算二者的比值得出轉染細胞的熒光素酶相對活性；同時，以共轉染pgl4.17空載體和prl-tk載體epc細胞的熒光素酶相對活性為對照，計算出大黃魚irf3啟動子的相對活性；

4)使用不同濃度的lps和polyi:c分別刺激pgl4-irf3-pro重組載體和prl-tk共轉染的epc細胞，刺激24小時后收集細胞，檢測并計算irf3啟動子的相對活性，通過比較刺激前后的大黃魚irf3啟動子相對活性的變化，確定大黃魚irf3基因啟動子在lps和polyi:c免疫刺激下的活性變化。

5)將大黃魚線粒體抗病毒信號蛋白mavs真核表達重組載體p3xflag-mavs與pgl4-irf3-pro、prl-tk共轉染的epc細胞，以共轉染空載體p3xflag-cmv-14、pgl4-irf3-pro、prl-tk的epc細胞為對照，轉染48小時后收集細胞，檢測并計算irf3啟動子的相對活性，通過比較共轉染mavs真核表達重組載體p3xflag-mavs與共轉染空載體p3xfalg-cmv-14的大黃魚irf3啟動子相對活性的變化，確定大黃魚irf3基因啟動子活性是否可被大黃魚線粒體抗病毒信號蛋白mavs所誘導。

本發(fā)明所述的大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子的應用如下：

1)所述的大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子的克隆及啟動子活性驗證，為研究大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因的表達調(diào)控及細胞信號轉導調(diào)控網(wǎng)絡提供良好的實驗系統(tǒng)；

2)所述的大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子可用于構建真核表達載體在魚類細胞或哺乳動物細胞中高效表達外源基因以及轉基因魚的培育；

3)所述的大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子可用于免疫增強劑或抗病藥物的篩選。

附圖說明

圖1為pgl4-irf3-pro重組載體的構建過程示意圖。

圖2為pgl4-irf3-pro重組載體與prl-tk共轉染epc細胞的普通光學顯微鏡觀察圖(100倍)?？梢杂^察到細胞生長狀態(tài)良好。

圖3為采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子的活性圖。

圖4為采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子在不同濃度polyi:c和lps刺激下的活性圖。

圖5為采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析大黃魚線粒體抗病毒信號蛋白mavs對大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子的誘導作用圖。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

epc細胞，可購買于中國典型培養(yǎng)物保存中心，也可購買于其他商業(yè)機構。

實施例1：大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子的克隆

以下依據(jù)圖1的流程步驟進行。

以大黃魚基因組(將市面上的大黃魚按照正常的基因組提取工藝，提取其大黃魚基因組dna)為模板，設計引物，引物序列如下；

正向引物：seqidno:2；其中下劃直線為kpni酶切位點，下劃虛線為seqidno:4；

反向引物：seqidno:3；其中下劃直線為bglii酶切位點，下劃虛線為seqidno:5。

采用takaraextaq酶，pcr擴增大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子，pcr反應體系如下：

pcr反應條件如下：

將pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用omega公司膠回收試劑盒進行pcr產(chǎn)物回收；

將pcr產(chǎn)物連接到pmd19-t克隆載體，轉化大腸桿菌top10感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定，測序正確的克隆稱為pmd19-t-irf3-pro重組載體。

實施例2：大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子重組載體pgl4-irf3-pro的構建

1)將上述pmd19-t-irf3-pro重組載體的top10菌株擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒使用kpni/bglii雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收酶切后的irf3promoter；

2)將pgl4.17熒光素酶報告載體(promega公司)使用kpni/bglii雙酶切并用膠回收試劑盒回收酶切后的載體；

3)使用takara公司的t4dna連接酶連接經(jīng)雙酶切的irf3啟動子序列片段和載體pgl4.17，構建重組載體pgl4-irf3-pro，連接體系如下：

反應條件：16℃孵育過夜；

4)將上述連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌top10感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定；

5)將經(jīng)過測序鑒定的含有重組載體pgl4-irf3-pro的大腸桿菌top10細胞擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，檢測質(zhì)粒濃度與純度備用。

實施例3：雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子的活性

1.接種epc細胞于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔2×10⁵個細胞，加500μlmem培養(yǎng)基，于25℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；

2.每孔epc細胞使用invitrogen公司的lipofectamine^tm3000轉染試劑共轉染100ng實施例2所得的重組載體pgl4-irf3-pro和10ng海腎熒光素酶對照報告基因載體prl-tk；同時，以共轉染100ng空載體pgl4.17和10ng海腎熒光素酶對照報告基因載體prl-tk的epc細胞為對照；每個處理設置3個重復。細胞轉染具體步驟如下：

a)將待轉染的載體(100ngpgl4-irf3-pro+10ngprl-tk或者100ngpgl4.17+10ngprl-tk)分別用25μlopti-mem培養(yǎng)基(購自gibco)混勻；

b)取0.75μllipofectamine^tm3000脂質(zhì)體加入25μlopti-mem培養(yǎng)基混勻；

c)將上述被opti-mem培養(yǎng)基稀釋好的待轉染的載體和脂質(zhì)體混勻，室溫孵育5分鐘；

d)將上述混勻的50μl混合物小心加入到24孔細胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，輕輕搖晃細胞板混勻，置于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

pgl4-irf3-pro重組載體與海腎熒光素酶對照報告基因載體prl-tk共轉染epc細胞結果見圖2，可以觀察到細胞生長狀態(tài)良好。

3.轉染48小時后收集轉染細胞，用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分別讀取螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的酶活性值，通過計算二者酶活性值的比值得出轉染細胞中熒光素酶的相對活性；同時，以空載體pgl4.17和海腎熒光素酶對照報告基因載體prl-tk共轉染的epc細胞中熒光素酶的相對活性作為對照，結果見圖3。圖3為采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子的活性圖。圖中pgl4.17表示空載體pgl4.17轉染細胞的熒光素酶相對活性(即為對照)；irf3-pro為重組載體pgl4-irf3-pro轉染細胞的熒光素酶相對活性；*表示顯著性差異p<0.05。從圖中可以看出，重組載體pgl4-irf3-pro轉染細胞的熒光素酶相對活性與對照相比，具有顯著差異；也就是說，含有irf3啟動子基因的重組載體與不含irf3啟動子基因的空載體相比，具有明顯的啟動熒光素酶的作用。

熒光素酶酶活性測定方法參考promega公司雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)說明書進行，具體步驟為：

a)轉染epc細胞48小時后，用磷酸緩沖液洗滌一次；

b)每孔加入100μlplb裂解液(passivelysisbuffer，promega試劑盒提供)并在室溫下裂解細胞15分鐘，晃動培養(yǎng)板，使其裂解完全，短暫離心收集細胞裂解液上清；

c)在檢測管中將100μl熒光素酶檢測試劑ii(larii)和20μl上述細胞裂解液上清混合，螢火蟲熒光素酶活性立即用化學發(fā)光檢測儀(promegaglomax20/20)檢測；

d)向檢測管中加入100μlstop&glo試劑，將上述反應淬滅，同時啟動海腎熒光素酶反應，檢測海腎熒光素酶活性；

e)分別讀取螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的酶活性值，計算二者酶活性值的比值得出轉染細胞中熒光素酶的相對活性，同時，以轉染空載體pgl4.17和海腎熒光素酶對照報告基因載體prl-tk共轉染的epc細胞中熒光素酶的相對活性作為對照。

4.對于免疫刺激實驗，在上述重組載體pgl4-irf3-pro和海腎熒光素酶對照報告基因載體prl-tk共轉染epc細胞24小時后，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為100ng/mlpolyi:c、1000ng/mlpolyi:c、及100ng/mllps、1000ng/mllps繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集細胞，用上述熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分別計算在不同濃度lps和polyi:c刺激條件下轉染細胞中的熒光素酶相對活性，并與未經(jīng)刺激的轉染細胞中熒光素酶相對活性進行比較，實驗結果為3次獨立實驗結果的平均值，結果見圖4。圖4為采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子在不同濃度polyi:c和lps刺激下的活性。圖中表示空載體pgl4.17轉染細胞(對照)和重組載體pgl4-irf3-pro轉染細胞分別在無刺激或100ng/mlpolyi:c、1000ng/mlpolyi:c、100ng/mllps、1000ng/mllps刺激下的熒光素酶相對活性；*表示顯著性差異p<0.05。從圖4中的結果可以發(fā)現(xiàn)，不同濃度的lps刺激不能明顯改變轉染細胞中熒光素酶的相對活性，而1000ng/mlpolyi:c刺激下轉染細胞中熒光素酶相對活性顯著上調(diào)，說明大黃魚irf3啟動子活性可被polyi:c免疫刺激所誘導。

對于檢測其他分子是否有激活大黃魚irf3啟動子活性的實驗，可將構建好的其他分子的真核表達重組載體與上述所得重組載體pgl4-irf3-pro及prl-tk共轉染epc細胞，檢測其他分子的表達是否可激活大黃魚irf3啟動子。本實驗中以大黃魚線粒體抗病毒信號蛋白mavs的重組載體p3xflag-mavs為例進行檢測，其中重組載體p3xflag-mavs的構建步驟如下：

以大黃魚cdna(將市面上的大黃魚按照標準的trizol法提取總rna，取1μg總rna使用thermofisher公司的cdna合成試劑盒逆轉錄為cdna)為模板，設計引物，引物序列如下；

正向引物：seqidno:6；其中下劃直線為hindiii酶切位點，下劃虛線為seqidno:8；

反向引物：seqidno:7；其中下劃直線為bamhi酶切位點，下劃虛線為seqidno:9。

1)采用takaraextaq酶，pcr擴增大黃魚線粒體抗病毒信號蛋白mavs的完整開放閱讀框，pcr反應體系如下：

pcr反應條件如下：

將pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用omega公司膠回收試劑盒進行pcr產(chǎn)物回收；

2)將上述所得pcr產(chǎn)物使用hindiii/bamhi雙酶切，將p3xflag-cmv-14載體使用hindiii/bamhi雙酶切，并分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收酶切后的pcr產(chǎn)物與載體；

3)使用takara公司的t4dna連接酶連接經(jīng)雙酶切的mavs完整開放閱讀框片段和載體p3xflag-cmv-14，構建重組載體p3xflag-mavs，連接體系如下：

反應條件：16℃孵育過夜；

4)將上述連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌top10感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定；

5)將上述經(jīng)過測序鑒定的含有重組載體p3xflag-mavs的大腸桿菌top10細胞擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，檢測質(zhì)粒濃度與純度備用。

將上述構建好的大黃魚線粒體抗病毒信號蛋白mavs重組載體p3xflag-mavs100ng與100ng上述所得重組載體pgl4-irf3-pro及10ng海腎熒光素酶對照報告基因載體prl-tk共轉染epc細胞系，同時以共轉染空載體p3xflag-cmv-14100ng與100ng重組載體pgl4-irf3-pro及10ngprl-tk的epc細胞為對照，轉染后48小時，收集細胞，用上述熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測共轉染p3xflag-mavs重組質(zhì)粒細胞中的熒光素酶相對活性，并與轉染空載體p3xflag-cmv-14細胞中的熒光素酶相對活性進行比較，實驗結果為3次獨立實驗結果的平均值,結果見圖5。圖5為采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析大黃魚線粒體抗病毒信號蛋白mavs對大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3基因啟動子的誘導作用。其中p3xflag-cmv-14表示空載體p3xflag-cmv-14與重組載體pgl4-irf3-pro共轉染細胞后的熒光素酶相對活性(對照)；flag-mavs表示重組載體p3xflag-mavs與重組載體pgl4-irf3-pro共轉染細胞后的熒光素酶相對活性；*表示顯著性差異p<0.05。從圖5中的結果可以發(fā)現(xiàn)，p3xflag-mavs與pgl4-irf3-pro共轉染細胞中的熒光素酶相對活性顯著高于p3xflag-cmv-14空載體與pgl4-irf3-pro共轉染細胞中的熒光素酶相對活性，說明大黃魚mavs可以誘導irf3啟動子的活化，同時證明構建的pgl4-irf3-pro重組質(zhì)?？捎糜诨蚬δ苎芯颗c信號通路分析。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。

sequencelisting

<110>集美大學

廈門大學嘉庚學院

<120>一種大黃魚干擾素調(diào)節(jié)因子irf3啟動子、核酸構建體、細胞及其制備方法和

用途

<130>jmdx-17005-cni

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1883

<212>dna

<213>大黃魚

<400>1

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