本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學手段檢測微生物耐藥基因的方法，具體為一種用于檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的分子標記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
b族鏈球菌學名為無乳鏈球菌，是一種有莢膜的細菌，能夠引起牛乳房炎，危害牧業(yè)非常嚴重，所以早為畜醫(yī)界注目。后來發(fā)現(xiàn)該細菌能夠感染人類，尤其是新生兒。該細菌所引起的敗血癥、腦膜炎、肺炎等疾病的死亡率極高，并且通常伴有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，由此又被醫(yī)學界所重視。
b族鏈球菌是婦女生殖道常見的攜帶菌，也是婦女圍產(chǎn)期感染、泌尿道感染、新生兒菌血癥、心內(nèi)膜炎等主要病原菌。目前治療b族鏈球菌感染多選用β內(nèi)酰胺類抗生素，對有過敏體質(zhì)或輕微感染患者，常用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素替代。隨著大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的使用顯著增加，導致大量耐藥菌株出現(xiàn)，我國有關(guān)b族鏈球菌耐藥性及耐藥基因譜的資料少見報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種能夠特異性檢測b族鏈球菌耐藥基因的方法，本發(fā)明提供了一種用于檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的分子標記及其應(yīng)用。
技術(shù)方案：一種用于檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
優(yōu)選的，所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。
表1分子標記序列
所述分子標記在制備檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
優(yōu)選的，所述試劑盒檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的步驟包括：
(1)取樣：選取純化后的b族鏈球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；
(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋50～200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋10～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
優(yōu)選的，所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。
優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。
優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。
有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標記具有特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點；(2)本發(fā)明所述分析標記能夠有效檢測耐藥基因，確定造成耐藥的原因，了解耐藥流行株的發(fā)生、發(fā)展、傳播規(guī)律，對預(yù)防和控制耐藥發(fā)展起著非常重要的作用。
附圖說明
圖1是實施例1～3檢測結(jié)果圖；
其中，1為分子量為2000bp的maker；2為實施例1pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；3為實施例2pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；4為實施例3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果。
具體實施方式
實施例1
一種用于檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。
所述分子標記在制備檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的步驟包括：
(1)取樣：選取純化后的b族鏈球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；
(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。
實施例2
一種用于檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。
所述分子標記在制備檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的步驟包括：
(1)取樣：選取純化后的b族鏈球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入30μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；
(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋150倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。
實施例3
一種用于檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。
所述分子標記在制備檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的步驟包括：
(1)取樣：選取純化后的b族鏈球菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；
(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。
sequencelisting
<110>蘇州喬納森新材料科技有限公司
<120>一種用于檢測b族鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的分子標記及其應(yīng)用
<130>
<160>6
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
aggaacgaatatcgcacctgaaat24
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
atgctgggcaatctacgtttct22
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
cgaaacgatttatcgcacctgaaat25
<210>4
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
atgctgcccaatcaatgtttct22
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
cgtactgggagctggtttag20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
cggcggtttgctaagctgat20