本發(fā)明涉及法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種硅藻upa基因的分析方法及其在法醫(yī)檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在法醫(yī)學(xué)檢案實(shí)踐中，時(shí)常遇到溺死相關(guān)案件的檢驗(yàn)鑒定。由于我國江河湖海眾多，環(huán)境復(fù)雜，以及尸體腐敗等因素影響，水中尸體的死因鑒定一直是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的難點(diǎn)之一。對(duì)于如何判斷水中尸體是生前入水或死后拋尸入水，學(xué)界仍存在爭(zhēng)議。硅藻檢驗(yàn)一直是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中最常用的方法。目前硅藻檢驗(yàn)的方法有很多，但國內(nèi)常用的硅藻檢驗(yàn)法主要基于硅藻形態(tài)學(xué)進(jìn)行檢測(cè)。然而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已有學(xué)者嘗試通過pcr檢測(cè)硅藻特異性的dna條形碼進(jìn)行溺死的死因鑒定。dna條形碼是指利用短的標(biāo)準(zhǔn)dna序列的核苷酸多樣性進(jìn)行物種的鑒定，利用dna條形碼進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)可以避免形態(tài)學(xué)難以區(qū)分的藻類，消除人工觀察和計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)誤差。

與傳統(tǒng)的硅藻形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)方法相比，熒光定量pcr擴(kuò)增檢測(cè)硅藻dna條形碼用于溺死鑒定主要有以下優(yōu)點(diǎn)：①檢測(cè)特異性強(qiáng)，可用于不能用顯微鏡進(jìn)行形態(tài)辨別的硅藻檢驗(yàn)；②靈敏度高，所需樣本量明顯小于傳統(tǒng)硅藻檢驗(yàn)法；③可用于推斷溺死地點(diǎn)和時(shí)間。利用硅藻dna條形碼的特異性，可以在定性的同時(shí)揭示群落特征，如進(jìn)一步建立不同水域和同一水域不同時(shí)間硅藻生物群落特征變化監(jiān)控系統(tǒng)，并與傳統(tǒng)硅藻檢驗(yàn)法相結(jié)合，對(duì)溺死鑒定則有更重要的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷和不足，提供了一種對(duì)硅藻upa基因（universalplastidamplicon），通用質(zhì)體擴(kuò)增區(qū))的分析方法，以及利用對(duì)硅藻upa基因的分析方法在法醫(yī)檢測(cè)中的應(yīng)用，具體是在判斷溺亡者真實(shí)死因上的應(yīng)用。

upa基因,該片段是葉綠體23srrna基因的v結(jié)構(gòu)域，長(zhǎng)度約370bp。upa基因的測(cè)序效率和擴(kuò)增效率都很高，并具有較高的分辨率，適合硅藻分子分類研究。硅藻是一種廣泛分布于水中的單細(xì)胞生物，細(xì)胞壁由大量硅物質(zhì)組成，硅藻的種內(nèi)繁多，形態(tài)各異，每一處水源的硅藻組成都不盡相同。因此，通過檢測(cè)水中尸體各主要臟器內(nèi)硅藻的存在不僅可成為判斷是否生前溺死的重要證據(jù)之一，亦可對(duì)判斷死亡地點(diǎn)具有重要意義。目前利用硅藻檢驗(yàn)判定溺死的標(biāo)準(zhǔn)是肺臟，肝臟，腎臟等組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)硅藻，且硅藻種類與現(xiàn)場(chǎng)水樣一致即可診斷為溺死。

本發(fā)明所要達(dá)到的技術(shù)效果通過以下方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明中提供一種硅藻upa基因在判斷溺亡者是否真正死于溺亡的應(yīng)用。

本發(fā)明中提供一對(duì)檢測(cè)硅藻upa基因的引物對(duì)，所述引物對(duì)包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如seqidno.1所示，下游引物的序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明中還提供一種硅藻upa基因的分析方法，提取硅藻內(nèi)核酸，利用權(quán)利要求2所述引物對(duì)上述核酸中upa基因進(jìn)行擴(kuò)增，利用擴(kuò)增產(chǎn)物制備待測(cè)樣本，對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行核酸分析。進(jìn)一步地，所使用的探針為5’-cggaggcgtacaaag-3’，且探針5’端以fam熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記，3’端以nfq-mgb熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記。

本發(fā)明中還提供一種硅藻upa基因的熒光定量pcr擴(kuò)增檢測(cè)分析方法，具體為：擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)體系為20ml：premixextaq試劑10ml，濃度為10μmol/l的正向引物0.4ml，濃度為10μmol/l的反向引物0.4ml，roxreferencedyeii0.2ml，探針0.8ml，dna模板2ml，滅菌雙蒸水6.2ml。對(duì)于特異性驗(yàn)證試驗(yàn)，dna模板指的是硅藻的基因組dna，對(duì)于案件檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，dna模板指的是檢材基因組總dna。這兩者的基因組dna皆含有硅藻upa基因。

進(jìn)一步地，pcr反應(yīng)條件為：stage1：預(yù)變性95℃，30s，升溫速率20℃/s，1cycle；stage2：pcr反應(yīng)95℃，5s，升溫速率20℃/s，60℃，34s，升溫速率20℃/s，40cycles；在退火步驟進(jìn)行熒光信號(hào)收集。

待測(cè)樣本的制備方法為：取死者實(shí)體臟器，使用核酸提取試劑盒提取臟器中的基因組dna進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增檢測(cè)，使用核酸提取試劑盒提取臟器中的基因組dna即為待測(cè)樣本。

本發(fā)明中還提供一種上述硅藻upa基因熒光定量pcr檢測(cè)分析方法在法醫(yī)檢測(cè)過程中的應(yīng)用，具體是應(yīng)用于判斷溺亡者是否真正死于溺亡。

進(jìn)一步地，所述的應(yīng)用方法為：取溺水者臟器組織，提取該臟器組織中的核酸，使用如權(quán)利要求2所述的引物對(duì)進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增檢測(cè)分析，確認(rèn)待測(cè)樣本是否含有硅藻upa基因，根據(jù)硅藻upa基因的檢出與否判斷溺亡者是否真正為溺亡。

本發(fā)明還提供一種判斷溺亡者是否真正死于溺亡和/或找出真正溺亡區(qū)域的方法，具體為：取溺水者臟器組織，檢測(cè)臟器組織中是否含有硅藻upa基因，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷溺亡者是否真正死于溺亡，以及找出真正的溺亡區(qū)域。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明提出了硅藻upa基因在判斷溺亡者是否真正死于溺亡的應(yīng)用。

2、本發(fā)明中提供了一種對(duì)硅藻upa基因的分析方法，提供了分析該基因序列的上游引物及下游引物，并同時(shí)提供了與硅藻upa基因相適配的熒光定量pcr擴(kuò)增檢測(cè)參數(shù)，并將該方法引用到利用硅藻upa基因判斷溺亡者真正死因的應(yīng)用中。

3、本發(fā)明還提供了將上述硅藻upa基因分析方法應(yīng)用于法醫(yī)檢測(cè)中的應(yīng)用，在溺亡者臟器中提取硅藻核酸并用熒光定量pcr擴(kuò)增檢測(cè)分析，然后與水樣中的硅藻核酸進(jìn)行比對(duì)，通過檢出率和硅藻upa基因測(cè)序結(jié)果的比對(duì)，即可判斷溺亡者是否真正死于溺亡，同時(shí)有助于找出真正的溺亡區(qū)域。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中引物的primer-blast結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明中熒光定量檢測(cè)硅藻標(biāo)準(zhǔn)株upa基因的擴(kuò)增曲線結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明中引物擴(kuò)增硅藻標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增產(chǎn)物的ncbi-blast結(jié)果圖

圖4為本發(fā)明中檢測(cè)臟器擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)及引物特異性證明

根據(jù)硅藻的upa基因設(shè)計(jì)出一對(duì)上下游引物：

上游引物（如seqidno.1所示）：

5’-cagtgagataccacccttgtaatgtt-3’

下游引物（如seqidno.2所示）：

5’-tctagatacgatttctaaccgctcaga-3’

實(shí)施例2引物對(duì)的特異性驗(yàn)證

利用上述引物和探針對(duì)不同樣本的dna進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)，探針5’端以fam熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記，3’端以nfq-mgb熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記，選取五種常見硅藻、兩種人體共生菌和多種非硅藻藻類dna做引物特異性驗(yàn)證。

1:小環(huán)藻；2：菱形藻；3：舟形藻；4：針桿藻；5：變異直鏈藻；6：大腸桿菌；7：雙歧桿菌；8：殺鮭氣單胞菌；9：維氏氣單胞菌；10：溫和氣單胞菌；11：蛋白核小球藻；12：普通小球藻；13：斜生柵藻；14：鐮形纖維藻；15：念珠藻；16：魚腥藻；17：?jiǎn)吾澹?8：柔細(xì)束絲藻；19：產(chǎn)毒銅綠微囊藻；20：不產(chǎn)毒銅綠微囊藻；21：超純水（陰性對(duì)照）

擴(kuò)增后得到如附圖2所示的擴(kuò)增曲線圖。由附圖2可見只有五個(gè)硅藻樣本出現(xiàn)擴(kuò)增，對(duì)其他細(xì)菌和非硅藻藻類沒有擴(kuò)增曲線，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所得序列在ncbi(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)進(jìn)行blast比對(duì)，比對(duì)結(jié)果（附圖3）顯示為硅藻。即可證明上述引物可對(duì)硅藻進(jìn)行特異性擴(kuò)增。

本方法只需要熒光定量pcr即可進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)，通過觀察擴(kuò)增曲線（常規(guī)pcr沒有擴(kuò)增曲線）即可判斷是否為硅藻（擴(kuò)增曲線起峰且ct值小于35即為硅藻）。

實(shí)施例3動(dòng)物組對(duì)照實(shí)驗(yàn)

人為溺死實(shí)驗(yàn)豬組（n=15）、實(shí)驗(yàn)豬機(jī)械處死后入水組（n=15）和非溺死實(shí)驗(yàn)豬的空白對(duì)照組（n=5）肺臟、肝臟、腎臟（體循環(huán)臟器）的檢材中提取的基因組dna在相同擴(kuò)增體系下經(jīng)本實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，規(guī)定出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且ct值（cyclethreshold）小于35即陽性擴(kuò)增，結(jié)果判定為檢出，檢出率結(jié)果見表1。

表1硅藻upa基因在各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體循環(huán)臟器檢出例數(shù)及陽性率

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，利用本發(fā)明中的方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)豬臟器中的dna進(jìn)行擴(kuò)增，利用陽性擴(kuò)增結(jié)果來確認(rèn)實(shí)驗(yàn)豬死因的方法檢出率可達(dá)93%，考慮到溺亡過程中吸入水的不同及個(gè)體差異，可認(rèn)定本發(fā)明中的方法可有效判定實(shí)驗(yàn)豬是否真正為溺死，同時(shí)可協(xié)助判斷溺亡地點(diǎn)。

實(shí)施例4硅藻upa基因分析方法及在法醫(yī)檢測(cè)中的應(yīng)用

利用實(shí)施例設(shè)計(jì)的引物對(duì)可以設(shè)計(jì)一種硅藻upa基因分析方法，本實(shí)施例中將本發(fā)明中的硅藻upa基因分析方法應(yīng)用于法醫(yī)檢測(cè)中，具體應(yīng)用于確認(rèn)溺水者是否為溺亡以及尋找溺對(duì)應(yīng)的溺亡區(qū)域。本實(shí)施例中采用的溺水者確認(rèn)為真實(shí)溺水死亡人員。

法醫(yī)檢測(cè)步驟為如下：

步驟一：在通風(fēng)櫥中剪取溺水者肺臟、肝臟、腎臟組織；

步驟二：提取肺臟、肝臟、腎臟組織中的基因組dna；

步驟三：使用實(shí)施例1中的引物和探針進(jìn)行實(shí)施熒光定量pcr擴(kuò)增；

在步驟三中，擴(kuò)增過程中使用的上游引物為5’-cagtgagataccacccttgtaatgtt-3’；下游引物為5’-tctagatacgatttctaaccgctcaga-3’；taqman探針為5’-cggaggcgtacaaag-3’；

探針5’端以fam熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記，3’端以nfq-mgb熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)在熒光定量pcr儀中的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。

實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)體系為20ml：pcr反應(yīng)體系為20ml：premixextaq（probeqpcr）試劑（2×）10ml，濃度為10μmol/l的正向引物0.4ml，濃度為10μmol/l的反向引物0.4ml，roxreferencedyeii（50×）0.2ml，探針0.8ml，dna模板2ml，滅菌雙蒸水6.2ml。上述2×/50×含義為所使用的試劑濃度為最終其在擴(kuò)增體系中濃度的2/50倍。

先混合擴(kuò)增原料，dna模板最后加入擴(kuò)增體系。對(duì)于特異性驗(yàn)證試驗(yàn)，dna模板指的是硅藻的基因組dna，對(duì)于案件檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，dna模板指的是檢材基因組dna。這兩者的基因組dna皆含有硅藻upa基因。

反應(yīng)條件為:stage1：預(yù)變性95℃，30s，升溫速率20℃/s，1cycle；stage2：pcr反應(yīng)95℃，5s，升溫速率20℃/s，60℃，34s，升溫速率20℃/s，40cycles；在退火步驟進(jìn)行熒光信號(hào)收集。

本實(shí)施例中，實(shí)時(shí)熒光定量分析使用的儀器為quantstudio7flex，也可采用其他有效實(shí)施熒光定量分析儀。

利用實(shí)時(shí)熒光定量分析儀檢測(cè)水中尸體臟器的硅藻upa基因，具有陽性擴(kuò)增即可確認(rèn)為該樣本中含有硅藻，該樣本可判定為溺水死亡，結(jié)果表明與已知死因相符。

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序如附圖4所示。

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序?yàn)椋篴gtgagataccacccttgtaatgttagatttctaactttgaatcattatctggtcaaagaacagtttcaggcgggcagtttgactggggcggtcgcctcccaaatggtgacggaggcgtacaaaggtttcctctgagcggttagaaatcgtatctaga。

最后需要說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案而非對(duì)其進(jìn)行限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解依然可以對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而這些修改或者等同替換亦不能使修改后的技術(shù)方案脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所

<120>一種硅藻upa基因分析方法及其在法醫(yī)檢測(cè)中的應(yīng)用

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>引物β-actinf1

<400>1

cagtgagataccacccttgtaatgtt26

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>引物β-actinr1

<400>2

tctagatacgatttctaaccgctcaga27