本發(fā)明涉及基因測序技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種測序樣本制備系統(tǒng)及方法。

背景技術(shù)：

從1977年第一代dna測序技術(shù)(sanger法)，發(fā)展至今三十多年時間，測序技術(shù)已取得了相當大的發(fā)展。

第一代dna測序技術(shù)用的是1975年由sanger和coulso開創(chuàng)的鏈終止法或者是1976-1977年由maxam和gilbert發(fā)明的化學(xué)法(鏈降解)。并在1977年，桑格測定了第一個基因組序列，是噬菌體x174的，全長5375個堿基。自此，人類獲得了窺探生命遺傳差異本質(zhì)的能力，并以此為開端步入基因組學(xué)時代。研究人員在sanger法的多年實踐之中不斷對其進行改進。在2001年，完成的首個人類基因組圖譜就是以改進了的sanger法為其測序基礎(chǔ)。

第一代測序技術(shù)的主要特點是測序讀長可達1000bp，準確性高達99.999％，但其測序成本高，通量低等方面的缺點，嚴重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用。經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進，以roche公司的454技術(shù)、illumina公司的solexa，hiseq技術(shù)和abi公司的solid技術(shù)為代表的第二代測序技術(shù)誕生了。第二代測序技術(shù)大大降低了測序成本的同時，還大幅提高了測序速度，并且保持了高準確性，但在序列讀長方面比起第一代測序技術(shù)則要短很多。

以roche454測序系統(tǒng)為例，它是第一個商業(yè)化運營二代測序技術(shù)的平臺。它的主要測序原理是：

(1)dna測序樣本制備

454測序系統(tǒng)的文件構(gòu)建是利用噴霧法將待測dna打斷成300-800bp長的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎ydna變性后用雜交引物進行pcr擴增，連接載體，構(gòu)建單鏈dna文庫。

(2)emulsionpcr(乳液pcr)

454的dna擴增過程是將這些單鏈dna結(jié)合在水油包被的直徑約28um的微球上，并在其上面孵育、退火。

(3)焦磷酸測序

測序前需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有dna的磁珠，接著將磁珠放在一種ptp平板上。將一種比ptp板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動測序反應(yīng)。測序反應(yīng)以磁珠上大量擴增出的單鏈dna為模板，每次反應(yīng)加入一種dntp進行合成反應(yīng)。如果dntp能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團。釋放的焦磷酸基團會與反應(yīng)體系中的atp硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成atp。生成的atp和熒光素酶共同氧化使測序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時由ptp板另一側(cè)的ccd照相機記錄，最后通過計算機進行光信號處理而獲得最終的測序結(jié)果。

目前還有一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代革命性測序技術(shù)——iontorrent。該技術(shù)使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片。這一技術(shù)的發(fā)明人同時也是454測序技術(shù)的發(fā)明人之一，jonathanrothberg，它的文庫和樣本制備跟454技術(shù)很像，只是測序過程中不是通過檢測焦磷酸熒光顯色，而是通過檢測h+信號的變化來獲得序列堿基信息。iontorrent相比于其他測序技術(shù)來說，不需要昂貴的物理成像等設(shè)備，因此，成本相對來說會低，體積也會比較小，同時操作也要更為簡單，速度也相當快速，除了兩天文庫制作時間，整個上機測序可在2-3.5小時內(nèi)完成，不過整個芯片的通量并不高，目前是10g左右，但非常適合小基因組和外顯子驗證的測序。

與一般的測序平臺不同，半導(dǎo)體芯片測序的核心是由大規(guī)模離子敏感場效應(yīng)晶體管(isfet)陣列組成的半導(dǎo)體芯片，其中包含了數(shù)百萬個孔和離子感應(yīng)器。其核心原理是利用isfet測量堿基在dna鏈上延伸時釋放質(zhì)子/氫離子導(dǎo)致的ph值的變化。用isfet測量ph值或生物分子等技術(shù)已經(jīng)是廣為人知技術(shù)，相關(guān)的研究也一直方興未艾。

半導(dǎo)體芯片上的每一個傳感單元有一個微球槽，每個微球槽原則上只能放入一個表面攜帶某一條dna片段克隆簇的微球(可以包括各種磁性微球、乳膠微球、水凝膠微球等)。

半導(dǎo)體基因測序具體的測序原理為：

在每一個isfet傳感單元上，通過cmos標準工藝技術(shù)開一個微球槽，微球槽的大小僅能容納一個微球；

在每一個微球上通過聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)技術(shù)，獲得大量序列相同的dna片段(10,000以上)，這樣可以增加每次堿基配對并酶促合成時釋放出來的氫離子總量，達到增強測試信號的目的。

用isfet探測酶促合成時釋放出來的氫離子從而獲得相應(yīng)微球所裝載核酸的序列。

在二代基因測序技術(shù)中，采用一定的方式制備數(shù)百億計的高質(zhì)量單分子文庫是測序前必不可少的步驟。當前各種測序樣本制備過程至少存在以下問題：第一，無法整合測序樣本制備的過程，需要通過多個單獨的制備按部就班，制備效率不高；第二，整個制備過程時間還是較長，基本是天為單位；第三，整個制備過程比較復(fù)雜，制備的質(zhì)量直接影響到測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量。在測序樣本制備過程中：乳液的均一度、pcr擴增熱循環(huán)效率和溫度控制、微珠收集率等是重要的質(zhì)量指標。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明實施方式的目的在于提供一種測序樣本制備系統(tǒng)及方法，可以整合測序樣本制備的過程，提高制備效率。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實施方式提供了一種測序樣本制備系統(tǒng)，包括：乳液制備模塊、基因擴增模塊、破乳富集模塊；

所述乳液制備模塊用于制備油包水乳液；

所述基因擴增模塊用于對由所述乳液制備模塊制備的油包水乳液進行基因擴增；

所述破乳富集模塊用于對由所述基因擴增模塊進行基因擴增后的油包水乳液進行油水分離。

本發(fā)明的實施方式還提供了一種測序樣本制備方法，包括：

利用乳液制備模塊制備油包水乳液；

利用基因擴增模塊對由所述乳液制備模塊制備的油包水乳液進行基因擴增；

利用破乳富集模塊對由所述基因擴增模塊進行基因擴增后的油包水乳液進行油水分離。

本發(fā)明實施方式相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，通過乳液制備模塊、基因擴增模塊、破乳富集模塊的依次配合，整合了測序樣本制備的過程，提高了制備效率。

另外，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，所述乳液制備模塊包括：油相提供裝置、水相提供裝置、毛細管裝置；

所述毛細管裝置具有供油相流動的油相通道，以及供水相流動的水相通道；

所述油相提供裝置用于向所述油相通道提供油相；

所述水相提供裝置用于向所述水相通道提供水相；

所述油相通道與所述水相通道至少匯聚于一條出液通道，用于使由所述油相提供裝置提供的油相與由所述水相提供裝置提供的水相在所述出液通道內(nèi)相互剪切并形成油包水乳液；

所述出液通道和所述基因擴增模塊連接，用于將所形成的油包水乳液輸送至所述基因擴增模塊。因此，在乳液制備過程中，通過對毛細管裝置的結(jié)構(gòu)設(shè)計和動力設(shè)計，即通過油相通道、水相通道以及出液通道的匯聚結(jié)構(gòu)，以及油相提供裝置和水相提供裝置的動力支持，實現(xiàn)提升生成液滴的均一性和可靠性的技術(shù)效果。

另外，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，所述基因擴增模塊包括變性恒溫柱、延伸恒溫柱、導(dǎo)液管；

所述導(dǎo)液管具有導(dǎo)液入口和導(dǎo)液出口，所述導(dǎo)液入口用于接收油包水乳液，所述導(dǎo)液出口用于排放油包水乳液；

所述導(dǎo)液管間隔式纏繞在所述變性恒溫柱和所述延伸恒溫柱上，用于使在所述導(dǎo)液管內(nèi)流動的油包水乳液分別與所述變性恒溫柱和所述延伸恒溫柱進行熱傳導(dǎo)，并且所述導(dǎo)液管在所述變性恒溫柱上的纏繞長度與在所述延伸恒溫柱上的纏繞長度之比1：1至1：20。通過使用雙溫區(qū)恒溫控制技術(shù)，有效實現(xiàn)油包水乳液邊生成邊擴增，比傳統(tǒng)的反復(fù)升溫降溫方法效率更高，整個擴增時間可以減少到10分鐘至90分鐘，并且油包水乳液在流動過程中實現(xiàn)擴增，避免靜止狀況下油包水乳液堆疊并在重力作用下發(fā)生的液滴融合現(xiàn)象。

另外，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，所述變性恒溫柱的工作溫度為85-97℃。

另外，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，所述延伸恒溫柱的工作溫度為50-75℃。

另外，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，所述基因擴增模塊還包括第一隔熱層，所述第一隔熱層設(shè)置在所述變性恒溫柱和所述延伸恒溫柱之間，用于隔絕二者之間的熱傳導(dǎo)。

另外，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，所述基因擴增模塊還包括退火恒溫柱；

所述導(dǎo)液管間隔式纏繞在所述變性恒溫柱、所述延伸恒溫柱和所述退火恒溫柱上，用于使在所述導(dǎo)液管內(nèi)流動的油包水乳液分別與所述變性恒溫柱、所述延伸恒溫柱和所述退火恒溫柱分別進行熱傳導(dǎo)，并且所述導(dǎo)液管在所述變性恒溫柱上的纏繞長度與在所述延伸恒溫柱上的纏繞長度與在所述退火恒溫柱上的纏繞長度之比1：1：1至1：20：2。通過使用三溫區(qū)恒溫控制技術(shù)，有效實現(xiàn)油包水乳液邊生成邊擴增，比傳統(tǒng)的反復(fù)升溫降溫方法效率更高，整個擴增時間可以減少到10分鐘至90分鐘，并且油包水乳液在流動過程中實現(xiàn)擴增，避免靜止狀況下油包水乳液堆疊并在重力作用下發(fā)生的液滴融合現(xiàn)象。

另外，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，所述退火恒溫柱的工作溫度為45-68℃。

另外，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，所述基因擴增模塊還包括第二隔熱層，所述第二隔熱層設(shè)置在所述變性恒溫柱、所述延伸恒溫柱和所述退火恒溫柱之間，用于隔絕三者之間的熱傳導(dǎo)。

另外，在該測序樣本制備方法中，所述基因擴增模塊包括變性恒溫柱、延伸恒溫柱、導(dǎo)液管；

所述導(dǎo)液管具有導(dǎo)液入口和導(dǎo)液出口，所述導(dǎo)液入口用于接收油包水乳液，所述導(dǎo)液出口用于排放油包水乳液；

所述導(dǎo)液管間隔式纏繞在所述變性恒溫柱和所述延伸恒溫柱上，用于使在所述導(dǎo)液管內(nèi)流動的油包水乳液分別與所述變性恒溫柱和所述延伸恒溫柱進行熱傳導(dǎo)，并且所述導(dǎo)液管在所述變性恒溫柱上的纏繞長度與在所述延伸恒溫柱上的纏繞長度之比1：1至1：20；

并且，在所述利用基因擴增模塊對由所述乳液制備模塊制備的油包水乳液進行基因擴增的步驟中，具體包括以下子步驟：

控制油包水乳液流經(jīng)受所述變性恒溫柱影響的導(dǎo)液管的時間為10到600秒；

控制油包水乳液流經(jīng)受所述延伸恒溫柱影響的導(dǎo)液管的時間為30到300秒；

將由所述導(dǎo)液出口排出的油包水乳液輸送至所述導(dǎo)液入口，并重復(fù)上述子步驟20至60次。

另外，在該測序樣本制備方法中，基因擴增還包括退火恒溫柱；

所述導(dǎo)液管間隔式纏繞在所述變性恒溫柱、所述延伸恒溫柱和所述退火恒溫柱上，用于使在所述導(dǎo)液管內(nèi)流動的油包水乳液分別與所述變性恒溫柱、所述延伸恒溫柱和所述退火恒溫柱分別進行熱傳導(dǎo)，并且所述導(dǎo)液管在所述變性恒溫柱上的纏繞長度與在所述延伸恒溫柱上的纏繞長度與在所述退火恒溫柱上的纏繞長度之比1：1：1至1：20：2；

并且，在所述利用基因擴增模塊對由所述乳液制備模塊制備的油包水乳液進行基因擴增的步驟中，具體包括以下子步驟：

控制油包水乳液流經(jīng)受所述變性恒溫柱影響的導(dǎo)液管的時間為10到600秒；

控制油包水乳液流經(jīng)受所述延伸恒溫柱影響的導(dǎo)液管的時間為30到300秒；

控制油包水乳液流經(jīng)受所述退火恒溫柱影響的導(dǎo)液管的時間10到600秒；

將由所述導(dǎo)液出口排出的油包水乳液輸送至所述導(dǎo)液入口，并重復(fù)上述子步驟20至60次。

另外，在所述利用破乳富集模塊對由所述基因擴增模塊進行基因擴增后的油包水乳液進行油水分離的步驟中，具體包括：

向油包水乳液中添加破乳劑，并進行離心破乳；

對完成離心破乳的液滴去除上清，并收集；

對完成收集的液滴離心去除上清，并添加清洗劑，清洗2～4次；

對完成清洗的液滴離心去除上清，加入鏈霉親和素修飾的磁珠，溫育600～1800秒；

對完成溫育的液滴磁性富集，去除上清，添加變性緩沖液并混勻，添加ph中和緩沖液并混勻；

離心去除上清，得到測序樣本。提升油水分離的效果，生成的液滴更易被收集。

另外，在該測序樣本制備方法中，所述清洗劑的成分包括10mmtris-hcl、1mmedta、2mnacl。

另外，在該測序樣本制備方法中，所述破乳劑成分包括濃度為5-15％的十二烷基硫酸鈉，以及濃度為1-50％的1-丁基-2-吡咯烷酮、1-乙基-2-吡咯烷酮、1-辛基-2-吡咯烷酮、1-癸基-2-吡咯烷酮中的任意一種。以進一步提升油水分離的效果。

另外，在該測序樣本制備方法中，所述變性緩沖液包含100～400mm的naoh，以及濃度為0.01～0.5％的tween20。

附圖說明

圖1是本發(fā)明第一實施方式中的乳液制備模塊的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明第一實施方式中的基因擴增模塊的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是本發(fā)明第一實施方式中的基因擴增模塊的俯視結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4是本發(fā)明第二實施方式中的乳液制備模塊的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5是本發(fā)明第三實施方式中的乳液制備模塊的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖6是本發(fā)明第四實施方式中的基因擴增模塊的俯視結(jié)構(gòu)示意圖；

圖7是本發(fā)明第五實施方式中的測序樣本制備方法的流程示意圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的各實施方式進行詳細的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術(shù)細節(jié)。但是，即使沒有這些技術(shù)細節(jié)和基于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現(xiàn)本申請所要求保護的技術(shù)方案。

本發(fā)明的第一實施方式涉及一種測序樣本制備系統(tǒng)，包括：乳液制備模塊1、基因擴增模塊2、破乳富集模塊，其中，乳液制備模塊1用于制備油包水乳液；基因擴增模塊2用于對由乳液制備模塊1制備的油包水乳液進行基因擴增；破乳富集模塊用于對由基因擴增模塊2進行基因擴增后的油包水乳液進行油水分離。本發(fā)明實施方式所提供的測序樣本制備系統(tǒng)，通過乳液制備模塊1、基因擴增模塊2、破乳富集模塊的依次配合，在使用時，利用乳液制備模塊1制備油包水乳液；利用基因擴增模塊2對由乳液制備模塊1制備的油包水乳液進行基因擴增；利用破乳富集模塊對由基因擴增模塊2進行基因擴增后的油包水乳液進行油水分離，從而整合了測序樣本制備的過程，提高了制備效率。

具體來說，在本實施方式的測序樣本制備系統(tǒng)中，乳液制備模塊1包括：油相提供裝置11、水相提供裝置12、毛細管裝置13。

該毛細管裝置13為一微流控芯片，材料選用疏水親油材料，如圖1所示，它具有供油相流動的油相通道131，以及供水相流動的水相通道132，油相通道131與水相通道132匯聚于一條出液通道133。

油相提供裝置11和水相提供裝置12為現(xiàn)有技術(shù)中的氣泵或液壓泵，其中，油相提供裝置11用于向油相通道131提供油相，水相提供裝置12用于向水相通道132提供水相，在使用時，由油相提供裝置11提供的油相與由水相提供裝置12提供的水相在出液通道133內(nèi)相互剪切并形成油包水乳液，即為液滴。剪切原理如下：水油的剪切通過微流控芯片裝置實現(xiàn)，通過外置氣泵或液壓泵為動力，分別驅(qū)動水和油互不相溶的兩相液體在特定結(jié)構(gòu)的微管道中流動過程中產(chǎn)生的流動剪切力與表面張力之間的相互作用下水相被油相分割成離散的納升或皮升級的單分散液滴。通過調(diào)控水油兩相液體的驅(qū)動力的大小即可直接調(diào)整生成液滴的大小。毛細管裝置13的結(jié)構(gòu)設(shè)計會影響液滴的生成結(jié)果。同時，出液通道133和基因擴增模塊2連接，用于將所形成的油包水乳液輸送至基因擴增模塊2。通過上述內(nèi)容不難發(fā)現(xiàn)，本實施方式的測序樣本制備系統(tǒng)在乳液制備過程中，通過對毛細管裝置13的結(jié)構(gòu)設(shè)計和動力設(shè)計，即通過油相通道131、水相通道132以及出液通道133的匯聚結(jié)構(gòu)，以及油相提供裝置11和水相提供裝置12的動力支持，實現(xiàn)提升生成液滴的均一性和可靠性的技術(shù)效果。利用微流控芯片制備出尺寸均一的單分散液滴，減少由于不均勻液相中微小或超大液滴導(dǎo)致的模板損失及多克隆微球、無擴增微球等無效微球的比例，提高了單分子文庫的制備效率。

值得補充說明的是，水相的制備：包括dna聚合酶，dntps，偶聯(lián)有引物序列的微球，連接好接頭的待測dna以及dna聚合酶反應(yīng)所需的緩沖液、鹽離子、表面活性劑等成分。油相的制備：可以包括礦物油、tegosoft、氟化液、表面活性劑等成分。

另外，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，如圖2和圖3所示，基因擴增模塊2包括變性恒溫柱21、延伸恒溫柱22、導(dǎo)液管23。其中，導(dǎo)液管23具有導(dǎo)液入口231和導(dǎo)液出口232，導(dǎo)液入口231用于接收油包水乳液，導(dǎo)液出口232用于排放油包水乳液。導(dǎo)液管23為一整根細長的管道，其間隔式纏繞在變性恒溫柱21和延伸恒溫柱22上，用于使在導(dǎo)液管23內(nèi)流動的油包水乳液分別與變性恒溫柱21和延伸恒溫柱22進行熱傳導(dǎo)，也可以說，在導(dǎo)液管23的延伸方向上，導(dǎo)液管23先纏繞在變性恒溫柱21上，再纏繞在延伸恒溫柱22上，之后又繼續(xù)纏繞在變性恒溫柱21上，實現(xiàn)間隔式纏繞，值得指出的是，導(dǎo)液管23在變性恒溫柱21上的纏繞長度與在延伸恒溫柱22上的纏繞長度之比1：1至1：20?？梢岳斫獾氖牵摲N方式通過使用雙溫區(qū)恒溫控制技術(shù)，有效實現(xiàn)油包水乳液邊生成邊擴增，比傳統(tǒng)的反復(fù)升溫降溫方法效率更高，整個擴增時間可以減少到10分鐘至90分鐘，并且油包水乳液在流動過程中實現(xiàn)擴增，避免靜止狀況下油包水乳液堆疊并在重力作用下發(fā)生的液滴融合現(xiàn)象。優(yōu)選的，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，變性恒溫柱21的工作溫度為85-97℃；同樣優(yōu)選的，延伸恒溫柱22的工作溫度為50-75℃。

值得指出的是，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，基因擴增模塊2還包括第一隔熱層24，第一隔熱層24設(shè)置在變性恒溫柱21和延伸恒溫柱22之間，用于隔絕二者之間的熱傳導(dǎo)。第一隔熱層24可由現(xiàn)有技術(shù)中的任意一種隔熱材料制成。

本發(fā)明的第二實施方式涉及一種測序樣本制備系統(tǒng)，與第一實施方式基本相同，其區(qū)別之處在于，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，該毛細管裝置13如圖4所示，它具有供油相流動的油相通道131，以及供水相流動的水相通道132，油相通道131與水相通道132匯聚于兩條出液通道133。

本發(fā)明的第三實施方式涉及一種測序樣本制備系統(tǒng)，與第一實施方式基本相同，其區(qū)別之處在于，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，該毛細管裝置13為一微流控芯片，如圖5所示，它具有供油相流動的油相通道131，以及供水相流動的水相通道132，油相通道131與水相通道132匯至少聚于一條出液通道133。

本發(fā)明的第四實施方式涉及一種測序樣本制備系統(tǒng)，與第一實施方式基本相同，其區(qū)別之處在于，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，如圖6所示，基因擴增模塊2還包括退火恒溫柱25。具體來說，導(dǎo)液管23間隔式纏繞在變性恒溫柱21、延伸恒溫柱22和退火恒溫柱25上，用于使在導(dǎo)液管23內(nèi)流動的油包水乳液分別與變性恒溫柱21、延伸恒溫柱22和退火恒溫柱25分別進行熱傳導(dǎo)，也可以說，在導(dǎo)液管23的延伸方向上，導(dǎo)液管23先纏繞在變性恒溫柱21上，再纏繞在延伸恒溫柱22上，再纏繞在退火恒溫柱25上，之后又繼續(xù)纏繞在變性恒溫柱21上，實現(xiàn)間隔式纏繞，并且導(dǎo)液管23在變性恒溫柱21上的纏繞長度與在延伸恒溫柱22上的纏繞長度與在退火恒溫柱25上的纏繞長度之比1：1：1至1：20：2。通過使用三溫區(qū)恒溫控制技術(shù)，有效實現(xiàn)油包水乳液邊生成邊擴增，比傳統(tǒng)的反復(fù)升溫降溫方法效率更高，整個擴增時間可以減少到10分鐘至90分鐘，并且油包水乳液在流動過程中實現(xiàn)擴增，避免靜止狀況下油包水乳液堆疊并在重力作用下發(fā)生的液滴融合現(xiàn)象。優(yōu)選的，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，退火恒溫柱25的工作溫度為45-68℃。可以理解的是，在該測序樣本制備系統(tǒng)中，基因擴增模塊2還包括第二隔熱層24’(可參照第一隔熱層24的理解)，本實施方式中的第二隔熱層24’為一實心柱體，第二隔熱層24’設(shè)置在變性恒溫柱21、延伸恒溫柱22和退火恒溫柱25之間，用于隔絕三者之間的熱傳導(dǎo)。

本發(fā)明的第五實施方式涉及一種測序樣本制備方法，結(jié)合上述實施方式，如圖7所示，包括：

s1利用乳液制備模塊1制備油包水乳液；

s2利用基因擴增模塊2對由乳液制備模塊1制備的油包水乳液進行基因擴增；

s3利用破乳富集模塊對由基因擴增模塊2進行基因擴增后的油包水乳液進行油水分離。本發(fā)明實施方式相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，整合了測序樣本制備的過程，提高了制備效率。

進一步來說，在該測序樣本制備方法中，基因擴增模塊2包括變性恒溫柱21、延伸恒溫柱22、導(dǎo)液管23；

導(dǎo)液管23具有導(dǎo)液入口231和導(dǎo)液出口232，導(dǎo)液入口231用于接收油包水乳液，導(dǎo)液出口232用于排放油包水乳液；

導(dǎo)液管23間隔式纏繞在變性恒溫柱21和延伸恒溫柱22上，用于使在導(dǎo)液管23內(nèi)流動的油包水乳液分別與變性恒溫柱21和延伸恒溫柱22進行熱傳導(dǎo)，并且導(dǎo)液管23在變性恒溫柱21上的纏繞長度與在延伸恒溫柱22上的纏繞長度之比1：1至1：20；

并且，在s2利用基因擴增模塊2對由乳液制備模塊1制備的油包水乳液進行基因擴增的步驟中，具體包括以下子步驟：

控制油包水乳液流經(jīng)受變性恒溫柱21影響的導(dǎo)液管23的時間為10到600秒；

控制油包水乳液流經(jīng)受延伸恒溫柱22影響的導(dǎo)液管23的時間為30到300秒；

將由導(dǎo)液出口232排出的油包水乳液輸送至導(dǎo)液入口231，并重復(fù)上述子步驟20至60次。

進一步來說，在該測序樣本制備方法中，基因擴增還包括退火恒溫柱25；

導(dǎo)液管23間隔式纏繞在變性恒溫柱21、延伸恒溫柱22和退火恒溫柱25上，用于使在導(dǎo)液管23內(nèi)流動的油包水乳液分別與變性恒溫柱21、延伸恒溫柱22和退火恒溫柱25分別進行熱傳導(dǎo)，并且導(dǎo)液管23在變性恒溫柱21上的纏繞長度與在延伸恒溫柱22上的纏繞長度與在退火恒溫柱25上的纏繞長度之比1：1：1至1：20：2；

并且，在利用基因擴增模塊2對由乳液制備模塊1制備的油包水乳液進行基因擴增的步驟中，具體包括以下子步驟：

控制油包水乳液流經(jīng)受變性恒溫柱21影響的導(dǎo)液管23的時間為10到600秒；

控制油包水乳液流經(jīng)受延伸恒溫柱22影響的導(dǎo)液管23的時間為30到300秒；

控制油包水乳液流經(jīng)受退火恒溫柱25影響的導(dǎo)液管23的時間10到600秒；

將由導(dǎo)液出口232排出的油包水乳液輸送至導(dǎo)液入口231，并重復(fù)上述子步驟20至60次。

進一步來說，在利用破乳富集模塊對由基因擴增模塊2進行基因擴增后的油包水乳液進行油水分離的步驟中，具體包括：

向油包水乳液中添加破乳劑，并進行離心破乳；

對完成離心破乳的液滴去除上清，并收集；

對完成收集的液滴離心去除上清，并添加清洗劑，清洗2～4次；

對完成清洗的液滴離心去除上清，加入鏈霉親和素修飾的磁珠，溫育600～1800秒；

對完成溫育的液滴磁性富集，去除上清，添加變性緩沖液并混勻，添加ph中和緩沖液并混勻；

離心去除上清，得到測序樣本。提升油水分離的效果，生成的液滴更易被收集。

具體來說，經(jīng)基因擴增模塊2的油包水乳液被收集到專用塑料試管里，同時加入破乳劑，將試管放入離心機，在離心機和破乳劑的共同作用下，實現(xiàn)油包水液滴的破乳過程。在破乳劑的作用下，分離出來的微球更容易沉到試管，便于提純分離。

其中，破乳富集的主要步驟有：

(1)對生成的液滴添加適量破乳劑，并進行離心；

(2)將完成離心破乳的液滴移去上清，收集到專用試管；

(3)離心去除上清，添加適量清洗劑，主要成分10mmtris-hcl(ph7.5)，1mmedta，2mnacl，清洗2～4次；

(4)離心去除上清，加入鏈霉親和素修飾的磁珠，溫育10～30分鐘；

(5)磁性富集，去上清，添加變性緩沖液(100～400mmnaoh,0.01～0.5％tween20)上下吹打混勻，然后添加相應(yīng)量的ph中和緩沖液(1nhcl)，吹打混勻；

(6)離心去除上清，試管底部剩余部分即為半導(dǎo)體基因測序所需要的文庫。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，上述各實施方式是實現(xiàn)本發(fā)明的具體實施例，而在實際應(yīng)用中，可以在形式上和細節(jié)上對其作各種改變，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。